基于谷氨酸脱氢酶的工程菌及其实现方法.pdf

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410705878.5 (22)申请日 2014.11.27 CGMCC NO.5706 2012.01.09 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12P 13/14(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 上海交通大学 地址 200240 上海市闵行区东川路 800 号 (72)发明人 周培 冯海玮 王大欣 俞明磊 毛亮 唐冬 (74)专利代理机构 上海交达专利事务所 31201 代理人 王毓理 王锡麟 (54) 发明名称 基于谷氨酸脱氢酶的工程菌及其实现。

2、方法 (57) 摘要 一 种 灰 略 红 链 霉 菌 (Streptomyces griseorubens) 胞内谷氨酸脱氢酶编码基因及其 应用。通过将该谷氨酸脱氢酶编码基因构建到表 达载体上， 并将该重组表达载体导入大肠杆菌进 而得到可发酵合成谷氨酸脱氢酶的转基因重组大 肠杆菌。本发明克服现有技术中由于谷氨酸脱氢 酶多为胞内表达且表达量较低导致的应用范围和 效果严重受限等不足， 应用基因工程手段实现其 体外的大量表达合成。 此外， 本发明通过在重组蛋 白添加聚组氨酸标签的方法， 方便了后期蛋白的 纯化。本发明可为谷氨酸脱氢酶的规模化发酵生 产提供一种新方法。 (83)生物保藏信息 (51)I。

3、nt.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表10页 附图2页 (10)申请公布号 CN 104498419 A (43)申请公布日 2015.04.08 CN 104498419 A 1/1 页 2 1.一种谷氨酸脱氢酶的工程菌， 其特征在于， 该工程菌为外源表达谷氨酸脱氢酶的大 肠杆菌 ； 所述的胞内谷氨酸脱氢酶具体为灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)JSD1 谷氨酸脱氢酶编码基因 SGGH 的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 2.根据权。

4、利要求 1 所述的工程菌， 其特征是， 所述的灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)JSD1， 现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏编号为 CGMCC No.5706， 保藏日期为 2012 年 1 月 9 日。 3.一种根据权利要求1或2中所述的工程菌的实现方法， 其特征在于， 以灰略红链霉菌 基因组 DNA 为模板， 与含有酶切位点的引物进行 PCR 扩增得到编码谷氨酸脱氢酶核苷酸序 列 ； 然后将扩增得到的核苷酸序列连接到表达载体 pET 22b(+) ； 之后将该谷氨酸脱氢酶表 达载体转化到大肠杆菌表达菌株内， 获得谷。

5、氨酸脱氢酶过表达重组菌株。 4.根据权利要求 3 所述的方法， 其特征是， 所述的含有酶切位点的引物包括 ： GHNde IF:GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG GHEcoR IR:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG。 5.根据权利要求 3 所述的方法， 其特征是， 所述的 PCR 扩增的条件为 ： 98预变性 3min ； 98变性 10s， 55退火 15s， 68延伸 2min ； 30 个循环后 68终延伸 5min。 6.根 据 权 利 要 求 3 所 述 的 方 法， 其 特 征 是， 所。

6、 述 的 大 肠 杆 菌 表 达 菌 株 为 Transetta(DE3) 大肠杆菌。 7.一种根据上述任一权利要求所述的谷氨酸脱氢酶的工程菌的应用， 其特征在于， 将 其用于谷氨酸脱氢酶的体外高效表达， 并最终实现谷氨酸的工业发酵生产。 权 利 要 求 书 CN 104498419 A 2 1/4 页 3 基于谷氨酸脱氢酶的工程菌及其实现方法 技术领域 0001 本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株， 具体是一种灰 略红链霉菌的基于谷氨酸脱氢酶的工程菌及其实现方法。 背景技术 0002 氮是植物生长发育过程中最重要的营养元素之一。目前， 维持或提高作物产量的 主要方法是大。

7、量施肥， 然而氮肥的大量施用， 不仅增加了农民的生产成本， 而且会加剧水体 的富营养化及温室气体的排放。 0003 对作物而言， 能够吸收同化 NO3、 NH4+及氨态 N 等不同氮素形态。植物以 NO 3 为 氮源时， 氮同化可以分为 3 个阶段 ： (1) 氮的无机同化 (NO3NO2NH4+) ； (2) 氨的同化， 即 NH4+经过谷氨酸脱氢酶 (GS) 合成谷氨酰胺， 再由谷氨酰胺经谷氨酸脱氢酶 (GOGAT) 合成谷 氨酸 ； (3) 氨的有机同化， 即由谷氨酰胺和谷氨酸合成其它氨基酸， 进而合成蛋白质和其他 物质 ； (4) 氨的异化， 即在谷氨酸脱氢酶作用下将谷氨酸催化分解为 。

8、酮戊二酸和氨。谷 氨酸脱氢酶是作为一种不需氧的脱氢酶， 既能利用 NAD+ 又能利用 NADH+ 作为还原当量。由 此可见， 谷氨酸脱氢酶在氮代谢转化通路中起着十分关键的作用。 发明内容 0004 本发明针对现有技术存在的由于谷氨酸脱氢酶在生物体内多为胞内酶且表达量 较低导致的应用范围和效果严重受限等不足， 提出一种基于谷氨酸脱氢酶的工程菌及其实 现方法， 能够应用基因工程手段实现其体外的大量表达合成， 此外本发明通过在重组蛋白 添加聚组氨酸标签的方法， 方便了后期蛋白的纯化， 可为谷氨酸脱氢酶的规模化发酵生产 提供一种新的途径。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 0006 本发明。

9、涉及一种谷氨酸脱氢酶的工程菌， 该工程菌为外源表达谷氨酸脱氢酶的大 肠杆菌。 0007 所述的胞内谷氨酸脱氢酶具体为灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) JSD1 谷氨酸脱氢酶编码基因 SGGH 的核苷酸序列如 SEQ ID No.1 所示， 氨基酸序列如 SEQ ID No.2 所示。 0008 所述的谷氨酸脱氢酶编码基因通过全基因组测序和 PCR 扩增的方式克隆获得。 0009 所述的灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens)， 命名为 JSD 1， 现保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏地址 。

10、： 北京市朝阳区北辰西 路 1 号院 3 号， 邮编 ： 100101， 保藏编号为 CGMCC No.5706， 保藏日期为 2012 年 1 月 9 日。 0010 本发明涉及上述工程菌的实现方法， 以灰略红链霉菌基因组 DNA 为模板， 与含有 酶切位点的引物进行 PCR 扩增得到编码谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列 ； 然后将扩增得到的核 苷酸序列连接到表达载体 pET22b(+) ； 之后将该谷氨酸脱氢酶表达载体转化到大肠杆菌 表达菌株内， 获得谷氨酸脱氢酶过表达重组菌株。 说 明 书 CN 104498419 A 3 2/4 页 4 0011 所述的含有酶切位点的引物序列， 包括 ： 00。

11、12 GHNde IF:GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG 0013 GHEcoR IR:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG 0014 所述的PCR扩增的条件为 ： 98预变性3min ； 98变性10s， 55退火15s， 68延 伸 2min ； 30 个循环后 68终延伸 5min。 0015 所述的大肠杆菌表达菌株为 Transetta(DE3) 大肠杆菌。 0016 本发明涉及一种谷氨酸脱氢酶的工程菌的应用， 将其用于谷氨酸脱氢酶的体外高 效表达， 并最终实现谷氨酸的工业发酵生产。 技术效果 。

12、0017 现有谷氨酸脱氢酶在灰略红链霉菌内为胞内酶且表达量很低， 因此严重限制了其 使用范围和效果 ； 与现有技术相比， 本发明提供了一种全新的谷氨酸脱氢酶基因序列 ； 在 特殊条件下(如高温以及碱性)具有更稳定的生物学活性 ； 本发明通过构建外源表达载体， 实现了谷氨酸脱氢酶的体外过表达， 并通过在表达重组蛋白 C 端添加聚组氨酸标签的方 法， 维持蛋白活性的同时也最大程度的保证了蛋白纯度。 附图说明 0018 图 1 为基于 KEGG 的灰略红链霉菌硝酸盐代谢通路预测图。 0019 图 2 为谷氨酸脱氢酶基因表达水平示意图。 0020 图 3 为谷氨酸脱氢酶信号肽预测图。 0021 图 4。

13、 为谷氨酸脱氢酶空间结构模拟图。 具体实施方式 0022 下面对本发明的实施例作详细说明， 本实施例在以本发明技术方案为前提下进行 实施， 给出了详细的实施方式和具体的操作过程， 但本发明的保护范围不限于下述的实施 例。 实施例 1 0023 本实施例包括以下步骤 ： 0024 步骤1)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)的分离及培养:灰略红链霉 菌(Streptomyces griseorubens)分离自上海市浦江镇收集的腐烂秸秆， 保藏编号为CGMCC No.5706。将该菌种接种于 LB 液体培养基， 32培养 48h。 0025 上述 LB 液体培养基组。

14、分为 ： 蛋白胨 10.0g/L， 酵母提取物 5.0g/L， NaCl 10.0g/L， pH6.87.2。在液体培养基中加入 15.020.0g/L 琼脂即得 LB 固体培养基。 0026 步骤 2) 灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 基因组 DNA 提取 ： 收集 2.0mL 菌液， 12000rpm 离心 2min。弃上清， 收集菌体沉淀， 加入 180l 溶菌酶 (20mg/mL) 和 20l EDTA 溶液 (0.5M,pH 8.0)， 37处理 45min， 加入 4l RNase A(100mg/mL)， 震荡混 匀 15s， 室温放置 5m。

15、in， 随后按照细菌 DNA 提取试剂盒操作说明完成剩余操作， 得到高纯度 基因组 DNA。通过 0.8琼脂糖凝胶电泳确定基因组 DNA 质量， 确保无明显 RNA 条带， 基因 组条带清洗、 完整、 无降解、 无污染。 0027 步骤3)灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)基因组测序 ： 确定全基因组 说 明 书 CN 104498419 A 4 3/4 页 5 鸟枪法(WGS)策略， 采用第二代测序技术， 构建不同插入片段长度的文库， 采用Illumina平 台进行测序。收集测序的原始数据， 对带接头、 低质量的数据进行过滤， 随后对去除接头的 测序数据进行从。

16、头拼接， 最后进行缺口填补得到链霉菌基因组草图。 0028 步骤4)蛋白编码基因功能预测 ： 采用Glimmer 3.0软件对全基因组序列进行基因 预测。 基因预测模型选取自我训练基因预测模型， 即提取拼装序列中最长的序列， 以该序列 作为基因预测模型训练的序列。然后以该序列构建的基因预测模型， 对所有序列进行基因 预测， 设定开放阅读框的长度为 110bp， 其余参数为 Glimmer 3.0 的默认设置。 0029 步骤 5)KEGG 是基因组注释上应用最广泛的的数据库。KEGG 注释的主要目的包括 两个 ： KO 注释， 即将分子网络的相关信息进行跨物种注释 ； KEGG Pathway。

17、 注释， 即代谢通路 注释， 获得物种内分子间相互作用和反应的网络。 0030 蛋白编码基因的 KO 及 Pathway 注释主要采用 KEGG 的 KAAS 自动化注释系统完成。 KO 注释完成后， 将 KO 映射到相应的 KEGG Pathway 通路上， 便可得相应的 KEGG 代谢通路。 应用上述方法， 目前已获得灰略红链霉菌 JSD1 内硝酸盐代谢通路 ( 图 1)。 0031 步骤 6) 灰略红链霉菌总 RNA 的提取 ： 将链霉菌接种于以 KNO3为唯一氮源的无机 盐培养基， 32、 150rpm 条件下培养 72h。每 12h 取样， 离心收集菌体沉淀， 并按细菌总 RNA 提。

18、取试剂盒要求提取高纯度的链霉菌总 RNA。 0032 上 述 无 机 盐 培 养 基 组 分 为 ： 葡 萄 糖 20g/L,KH2PO41.0g/L,NaCl 0.5g/ L,MgSO40.25g/L,CaCl2 2H2O0.1g/L,FeSO4 7H2O 0.01g/L 及 KNO3(1g/L、 3g/L、 5g/L 和 10g/ L)。 0033 步骤 7) 谷氨酸脱氢酶表达水平测定 ： 根据谷氨酸脱氢酶基因序列， 通过 DNAMAN 6.0 软件设计特异性 PCR 引物， 引物序列如下 ： 0034 GFF:AAACTGCCGACTGGGACC 0035 GFR:GCGGTCGGTGA。

19、GGTCTTC 0036 同样的， 根据 16S rRNA 的特异性序列设计引物， 并作为内参基因， 引物序列如下 ： 0037 16S rRNAF:CGTATTCACCGCAGCAATGC 0038 16S rRNAR:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA 0039 以链霉菌总 RNA 模板进行反转录获得 cDNA 文库， 并按照荧光定量 PCR 试剂盒要求 进行相关操作。设置三个重复， 待实验完成收集处理数据， 分析在不同浓度 KNO3作用下， 谷 氨酸脱氢酶的表达量(如图2)。 结果表明， 随着时间的延长和KNO3浓度的升高， 该谷氨酸脱 氢酶的表达量显著上调， 证明该基因确实参与硝。

20、酸盐的代谢过程。 随着硝酸盐浓度的升高， 谷氨酸脱氢酶的表达量呈现先升高后下降的趋势， 且当硝酸盐添加量为 3g/L 时， 谷氨酸脱 氢酶的表达量达到最大。 0040 上述的荧光定量 PCR 的反应条件为 ： 95预变性 30s ； 95变性 10s， 60退火 30s， 72延伸 15s， 共 40 个循环。 0041 步骤8)谷氨酸脱氢酶膜定位预测 ： 采用SignalP 4.1分别对谷氨酸脱氢酶进行信 号肽模拟， 如图 3 所示。结果表明谷氨酸脱氢酶的 N 端不存在明显的信号肽序列， 推测该酶 为胞内酶。 0042 步骤 9) 谷氨酸脱氢酶氨基酸序列对比 ： 在 NCBI 数据库中搜索与。

21、灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 谷氨酸脱氢酶序列相似度最高的蛋白质序列， 可知本发明 说 明 书 CN 104498419 A 5 4/4 页 6 所示序列与已知的谷氨酸脱氢酶氨基酸序列在一级结构上具有很高的相似度， 相似度最大 可达 99。 0043 步骤10)谷氨酸脱氢酶3D模型预测 ： 运用PHYRE 2在线程序对谷氨酸脱氢酶的3D 空间模型进行预测， 结果如图 4 所示。谷氨酸脱氢酶与 PDB 数据库中已有蛋白模型的最高 相似度仅为 18， 说明该酶在二级结构上与目前已报到的谷氨酸脱氢酶存在较大的差异。 尽管如此， 预测结果仍然具有 100可信度。。

22、 0044 步骤 11) 谷氨酸脱氢酶表达载体构建 ： 根据谷氨酸脱氢酶基因序列， 设计含有酶 切位点的引物， 序列如下 ： 0045 GHNde IF:GTACATATGCAGACCAAGCTGGACGAAGCCAAG 0046 GHEcoR IR:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCGAGTTCCTGAGCAGCGTG 0047 以灰略红链霉菌 (Streptomyces griseorubens) 基因组 DNA 为模板， 用含有 Nde I 和 EcoR I 酶切位点引物进行 PCR 扩增获得谷氨酸脱氢酶基因序列， 使用 DNA A Tailing Kit 加 A。

23、 后连接到 TVector PMDTM 19T， 并将连接产物转入 DH5 大肠杆菌内。在氨苄 (50g/mL) 抗性平板上挑选阳性克隆， 摇菌提取质粒测序。随后 Nde I 和 EcoR I 进行双 酶切 (37 )， 回收谷氨酸脱氢酶片段 GH。用相同内切酶酶切表达载体 pET22b(+) 并回 收载体 DNA 片段。将 GH 与载体片段混合， T4DNA 连接酶过夜连接 (16 )， 将连接产物转入 DH5大肠杆菌感受态细胞内， 通过抗性平板及菌落PCR筛选含有重组质粒的阳性克隆。 挑 取阳性克隆接种于含有氨苄青霉素(50g/mL)的LB液体培养基中， 于180rpm、 37条件下 培养。

24、 16 小时提取质粒测序， 结果证实插入片段与基因组测序结果完全相同。 0048 上述 GH 基因扩增条件为 ： 98预变性 3min ； 98变性 10s， 55退火 15s， 68延 伸 2min ； 30 个循环后 68终延伸 5min。 0049 步骤 12) 谷氨酸脱氢酶表达菌株的构建 ： 将上述谷氨酸脱氢酶表达载体转入大肠 杆菌Transetta(DE3)， 并在含有氨苄青霉素(50g/mL)和氯霉素(34g/mL)的LB固体培 养基上筛选， 获得谷氨酸脱氢酶表达菌株。 0050 上述的 Transetta(DE3) 具有以下特征 ： 该菌株具有氯霉素 (Camr)， 且含有大肠杆。

25、 菌缺乏的6种稀有密码子(AGA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA)对应的tRNA， 可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及链霉菌等高 GC 含量生物基因在原核系统中的表达水平。 说 明 书 CN 104498419 A 6 1/10 页 7 0001 序 列 表 CN 104498419 A 7 2/10 页 8 0002 0003 序 列 表 CN 104498419 A 8 3/10 页 9 0004 序 列 表 CN 104498419 A 9 4/10 页 10 0005 序 列 表 CN 104498419 A 10 5/10 页 11 0006 序 列 表 CN 104498419 A 11 6/10 页 12 0007 序 列 表 CN 104498419 A 12 7/10 页 13 0008 序 列 表 CN 104498419 A 13 8/10 页 14 0009 序 列 表 CN 104498419 A 14 9/10 页 15 0010 序 列 表 CN 104498419 A 15 10/10 页 16 序 列 表 CN 104498419 A 16 1/2 页 17 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 104498419 A 17 2/2 页 18 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 104498419 A 18 。