一种EPHRINB2高表达的重组HEK293细胞及其应用.pdf

本发明公开了一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用，该重组细胞是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达载体。与现有只含EphrinB2胞外区或部分基因序列构建的重组细胞相比，本发明构建的包含EphrinB2基因全长的重组HEK293细胞膜能够稳定的表达EphrinB2分子，而且具有完整的分子活性。MTT法检测在一定浓度下达沙替尼对重组HEK293细胞有良好的作用，因此可以在以EphrinB2为靶点的药物筛选中应用。

权利要求书
1.  一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征在于：该重组细胞 是以HEK293细胞为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2 全长基因的表达载体。

2.  根据权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征 在于：所述的EphrinB2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.  根据权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征 在于：所述的包含EphrinB2全长基因的表达载体是pEZ-M61-EphrinB2，其中 pEZ-M61-EphrinB2是将EphrinB2全长基因克隆到载体pEZ-M61中。

4.  根据权利要求3所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，其特征 在于：所述的pEZ-M61-EphrinB2的引物序列为：
上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3。

5.  权利要求1所述的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞在以EphrinB2 为靶点的药物筛选中的应用。

6.  如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的以EphrinB2为靶点的药 物为能够与受体EphB4-Fc结合的药物。

说明书一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及EphrinB2高表达的非癌细胞的构建，特别 涉及一种基于外源重组质粒的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应用。
背景技术
酪氨酸激酶受体(RTK)是一个庞大的家族，在生物体的生命活动中担当着非 常重要的作用。RTK的胞外区是结合配体结构域，配体是可溶性或膜结合的多 肽或蛋白类激素，包括胰岛素和多种生长因子。胞内段是酪氨酸蛋白激酶的催 化部位，并具有自磷酸化位点。当配体与RTK结合后，能诱导受体构象变化， 导致受体发生稳定的二聚化，二聚化的受体发生磷酸化，在受体激酶区内形成 含有磷酸化酪氨酸位点的基序，并伴有PTK的激活。酪氨酸特异的磷酸化使激 酶区稳定在激活的构象，并为下游含有src癌基因家族SH2区和结合磷酸化酪 氨酸的功能区(phosphotyrosine binding domain,PTB)的信号转导分子提供识别、 停靠和结合的部位。PTK通过启动细胞内的信号通路调节细胞的生长、分化、 运动、变形和代谢等，导致多种效应。
Eph是属于目前已知最大的蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKs)亚族，包括 Eph受体及其Ephrin配体。EphB4与EphrinB2在信号传递时表现出独特的方式， 可互被对方激活，产生“正向信号”和“反向信号”，以EphrinB2激活EphB4等 信号通路为正向信号；而EphB4激活EphrinB2为反向信号。EphB4/EphrinB2 及其独特的双向信号转导几乎参与血管生长的每个方面。EphrinB2可能在VEGF 信号通路中扮演一个总调控者的角色，并在血管生长中发挥核心作用。 Eph/Ephrin家族是受体酪氨酸激酶家族中的最大亚族，根据配体结构不同分为两 种亚型：固定于胞膜上的称为EphrinA亚型，共5种；而3种B亚型的Ephrin 配体则属于跨膜蛋白(Cell,1997,90(3):403-404)。根据同源序列将Eph受体也 分为两组:EphA和EphB受体。Eph受体由跨膜域、细胞外配体识别域和半胱氨 酸域组成，半胱氨酸域中含有一个位于细胞内侧的PDZ结合域；Eph跨膜蛋白 位于细胞外负责识别细胞环境中信号的结构域可以与Ephrin发生作用，形成多 聚体的形式，因而导致Ephrin配体和Eph受体的活化，从而影响细胞相互作用 及细胞迁移等功能(Cur Opini Cell Bio,2010,22:611-616)。
肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤血管形成，只有在新生血管形成以后， 肿瘤才能迅速生长，并进一步向周围浸润和进入血液循环向远处转移，而 Eph/Ephrin信号转导是胚胎生长、血管生长和发生过程的重要细胞形态学调控因 素，Eph/Ephrin家族中的数个配体和受体已经证实参与了肿瘤生长过程(Cancer  Cell,2010,17:533-534)。
创新药物研究与开发是国家科技计划中的重大研究领域，抗肿瘤药物靶向 筛选是新药筛选的一个重要方向和领域。目前，寻找靶标开发抗肿瘤药物己成 为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚 没有对EphrinB2有一定的抑制作用药物。以EphrinB2为靶点，寻找靶向于肿瘤 中EphrinB2的药物会成为研发抗肿瘤药物的重要途径之一。目前对EphrinB2基 因的研究较多，但对全长序列EphrinB2载体的构建及生物学应用研究及其应用 未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞及其应 用，在构建EphrinB2全长基因的表达载体的基础上，转染HEK293细胞，获得 稳定、高表达EphrinB2分子的重组HEK293细胞株，能够用于以EphrinB2为靶 点的药物的筛选。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种EphrinB2高表达的重组HEK293细胞，该重组细胞是以HEK293细胞 为宿主细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EphrinB2全长基因的表达 载体。
所述的EphrinB2全长基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
所述的包含EphrinB2全长基因的表达载体是pEZ-M61-EphrinB2，其中 pEZ-M61-EphrinB2是将EphrinB2全长基因克隆到载体pEZ-M61中。
所述的pEZ-M61-EphrinB2的引物序列为：
上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3。
EphrinB2高表达的重组HEK293细胞在以EphrinB2为靶点的药物筛选中的 应用。
所述的以EphrinB2为靶点的药物为能够与受体EphB4-Fc结合的药物。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种EphrinB2高表达的重组细胞，在构建EphrinB2全长 基因的表达载体的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EphrinB2分 子的重组HEK293细胞。与现有只含EphrinB2胞外区或部分基因序列构建的重 组细胞相比，本发明构建的包含EphrinB2基因全长的重组HEK293细胞膜能够 稳定的表达EphrinB2分子，最高表达EphrinB2受体量较转染前提高29.3倍， 而且具有完整的分子活性。
2、作为宿主细胞的HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒 (Ad5)DNA的永生化细胞，该细胞本身含有的各种受体表达量相对较低；而本 发明提供的重组HEK293细胞的EphrinB2配体的相对表达量比HEK293明显增 高，相对于其他细胞表面分子占据表达优势地位，在结合其受体方面处于有利 地位；这样就大大提高了筛选以EphrinB2为靶点药物的灵敏性及特异性；同时 能够为进一步研究EphrinB2生物学特性以及发现功能蛋白的有效性提供较好的 细胞模型。
3、在肿瘤细胞抑制剂的研发中，尚没有靶向于EphrinB2的药物。因此运用 构建的重组HEK293细胞对上市的索拉菲尼和达沙替尼药物进行了细胞抑制试 验，发现在一定浓度下达沙替尼对重组HEK293细胞有良好的抑制作用，表明 本发明提供的重组HEK293细胞可以应用以EphrinB2为靶点的药物筛选。
附图说明
图1是pEZ-M61-EphrinB2载体的质粒图谱；
图2是DMEM培养基加G418筛选阳性细胞的培养图；其中a是对照组 HEK293细胞，b是重组HEK293细胞，c是重组HEK293细胞的荧光图；
图3是重组HEK293细胞的EphrinB2表达水平的RT-PCR检测图；其中1 为重组HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的对照组 HEK293细胞；
图4是重组HEK293细胞经提取RNA、反转录和PCR后琼脂糖凝胶电泳 图；其中泳道1为Marker，泳道2为转染pEZ-M61-EphrinB2的重组HEK293 细胞，泳道3为未转染的HEK293细胞，泳道4为转染空载体的HEK293细胞；
图5是在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定性鉴定EphrinB2在重组 HEK293细胞中的表达图；其中a为对照组HEK293细胞，b为重组HEK293细 胞；
图6是重组HEK293细胞与EphrinB2的受体EphB4的结合图；
图7是Western Blot检测重组HEK293细胞的EphrinB2表达量图；其中1 为重组HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的HEK293 细胞；
图8是MTT实验检测达沙替尼对重组HEK293细胞的抑制作用并绘制的 量效曲线图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步详细说明。
本发明首先构建了EphrinB2全长基因的真核表达载体pEZ-M61-EphrinB2， 其基因测序结果与基因库人EphrinB2一致，pEZ-M61-EphrinB2载体脂质体法转 染HEK293细胞，经过筛选获得了稳定、高表达EphrinB2分子的重组HEK293 细胞，即重组HEK293-EphrinB2细胞。下面对本方面做详细说明是对本发明的 解释而不是限定。
a.本发明是以pEZ-M61-EphrinB2为基础载体(GeneCopoeia公司)，引物 序列如下：
上游引物：5-TCATCTTCATCGTCATCATCATC-3
下游引物：5-CTGTCCGCAGTCCTTAGC-3
构建的pEZ-M61-EphrinB2载体的质粒图谱如图1所示。
b.pEZ-M61-EphrinB2表达载体转染HEK293细胞
采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国 GIBCO,Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基 (Dulbecco's Modified Eagle Medium)加G418浓度500μg/mL筛选14天后，得 到的阳性克隆在倒置荧光显微镜下均带有绿色荧光，挑取G418抗性单克隆传代 培养，4周后调整G418浓度为300μg/mL的DMEM培养基培养，得到含 pEZ-M61-EphrinB2阳性转染的克隆细胞株。
DMEM培养基加G418筛选阳性细胞14天后，作为对照的HEK293细胞培 养图如图2a所示；重组HEK293细胞，即HEK293-EphrinB2阳性细胞的细胞培 养图如图2b、2c所示；未转染质粒pEZ-M61-EphrinB2的HEK293细胞全部死 亡，转染有pEZ-M61-EphrinB2的HEK293细胞部分死亡，同时存活细胞在倒置 荧光显微镜下均带有绿色荧光，这与转染质粒含有抗G418抗性基因和绿色荧光 蛋白GFP基因有关，表明质粒pEZ-M61-EphrinB2成功转入宿主细胞HEK293。
c.对转染细胞株的RT-PCR检测：
采用TRIZOL试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA 为模板采用TAKARA公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA；
分别以所得cDNA为模板，PCR扩增EphrinB2基因全长。
PCR反应体系为：Premix Ex TaqTMII 12.5μL；上游引物(sense, 20μmol/L)0.5μL；下游引物(antisense,20μmol/L)0.5μL；模板(cDNA)2μL；ddH2O 9.5μL；Total：25μL。
PCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃延伸30s，循环40次； RT-PCR检测结果如图3所示，1为重组HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293 细胞，3为未转染的HEK293细胞作阴性对照；与2、3相比，1中EphrinB2基 因水平明显升高，最高表达EphrinB2受体量较转染前提高29.3倍。GAPDH组 为EphrinB2组的阳性参照。
将PCR产物做凝胶电泳检测，结果如图4所示，其中，泳道1为Marker， 泳道2为转染pEZ-M61-EphrinB2的重组HEK293细胞，泳道3为未转染的 HEK293细胞，泳道4为转染空载体的HEK293细胞；
与泳道3、4相比，泳道2得到的187bp左右的条带明显高于泳道3、4，琼 脂糖凝胶电泳检测结果表明重组HEK293细胞的EphrinB2表达明显上调。
d.倒置荧光显微镜下重组HEK293细胞中EphrinB2的表达及其与EphB4 受体的结合
在倒置荧光显微镜下下观察重组HEK293细胞的EphrinB2的表达，结果如 图5所示，其中a为对照组HEK293细胞，b为重组HEK293细胞，从图5中可 以看出对照组HEK293细胞无绿色荧光，而重组HEK293细胞绿色荧光较亮， 说明其EphrinB2表达量显著增加。
取生长状态良好接近汇合的重组HEK293细胞，0.25％胰蛋白酶消化，计数， 按1×104个/孔浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200uL，将EphB4-Fc原液 (1mg/mL)稀释后加入96孔培养板内，使其终浓度为2.5ug/mL孵育细胞，37℃ 培养箱中培养24h，由于重组HEK293细胞本身带有绿色荧光，因此同一视野下 拍照合成图片如图6所示，可见绿色与红色重合，说明重组HEK293细胞高表 达EphrinB2且能够与其配体(受体)EphB4-Fc较好的结合。
e.Western Blot检测EphrinB2的表达量
用裂解液RIPA裂解细胞后提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。经 电泳、转膜、免疫染色(一抗：兔抗人EphrinB2多克隆抗体，购于Abcam公司； 二抗：山羊抗兔，购于博奥森公司)和显影，实验结果如图7所示，其中，1为 重组HEK293细胞，2为转染空质粒的HEK293细胞，3为未转染的HEK293细 胞。与2、3相比，1中目标蛋白EphrinB2的表达量明显升高，2、3中EphrinB2 的表达量较少；GAPDH组为EphrinB2组的阳性参照。
f.重组HEK293细胞的活性分析
用MTT法分析达沙替尼对重组HEK293细胞增殖的影响。
取对数生长期的重组HEK293细胞，0.25％膜蛋白酶消化，计数，按1×104个/孔浓度接种于96孔培养板内，每孔体积200uL，37℃、5％CO2、饱和湿度条 件下培养24h后，加入达沙替尼溶液20uL，使达沙替尼终浓度分别为6.1、12.2、 24.4、48.8、97.7、195.3、390.6mmol/L，对照组加入等量药物溶剂，每个浓度5 个复孔。继续培养48h后，小心吸弃孔内培养液，每孔加入无血清培养基200uL， 然后加入5mg/mL MTT溶液20uL，37℃孵育4h。小心吸弃孔内培养液上请， 每孔加入150uLDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定490nm 波长下各孔吸光度值，取各复孔吸光度平均值，根据下式计算达沙替尼对细胞 的抑制率：
抑制率(％)＝(1－实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100％
以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标作图，得到抑制作用曲线， 如图8所示：随着达沙替尼浓度的增大，达沙替尼对重组HEK293细胞的抑制 作用明显增强，经计算，达沙替尼的半数抑制浓度IC50为107.9nmol/L；这说 明重组细胞的EphrinB2与达沙替尼结合后，抑制了EphrinB2高表达的重组细胞 的生长。
综上所述，本发明提供的EphrinB2高表达的重组HEK293细胞可以用于筛 选以EphrinB2为靶点的药物，从而进一步得到能够消除EphrinB2对肿瘤发展的 影响的药物。