一种海马胰蛋白酶酶解液及其作为抗氧化剂的应用.pdf

本发明公开一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液按照以下步骤制备获得：将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200，将混合溶液在50-60℃的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100℃的条件下水浴至少10min，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液。这是一种成本低廉、获得容易的海马胰蛋白酶酶解液，以及该种海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。

权利要求书
1.  一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液按照以下步骤制备获得：
将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200，将混合溶液在50-60℃的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100℃的条件下水浴至少10min，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液。

2.  根据权利要求1所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马粉末为雄海马粉末。

3.  一种如权利要求1所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。

4.  根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液对DPPH自由基进行清除的应用。

5.  根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液对羟基自由基进行清除的应用。

6.  根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液对超氧阴离子自由基进行清除的应用。

说明书一种海马胰蛋白酶酶解液及其作为抗氧化剂的应用
技术领域
本发明涉及一种蛋白酶酶解液，以及该种酶解液作为抗氧化剂的应用。
背景技术
海马在全世界共有20多种，多数生活在近海，水藻和海草茂盛、风浪不使很大大的海域。我国海马资源丰富，东南沿海均产海马，以南海较多。另外，海马作为一种著名中药，在很多地方药房均有销售，为海马的研究提供了可能。
海马有很多对人类有益的功能，如温肾壮阳、缓解前列腺增生、耐缺氧、抗氧化、抗疲劳、延缓衰老、抗肿瘤等，所以是珍贵的海洋生物资源，具有很重要的研究和开发价值。根据已有报道，目前科研人员对海马组分的研究主要集中在氨基酸、微量元素、甾体类和磷脂等化学成分，但对海马蛋白质及酶解液的研究报道非常少。
现代医学研究表明，过量的自由基会在有机体中引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞核分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病理学基础。因此抗氧化剂的研究对有效预防和治疗某些疾病十分重要。而人工合成的抗氧化剂往往具有一定的毒副作用，使得它们早使用时受到严格的控制。而天然抗氧化剂副作用小，安全性高，有利于产品的进一步应用。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种成本低廉、获得容易的海马胰蛋白酶酶解液，以及该种海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。
本发明的技术解决方案是：一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液按照以下步骤制备获得：
将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200，将混合溶液在50-60℃的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100℃的条件下水浴至少10min，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液。
所述的海马粉末为雄海马粉末。
一种如上所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。
所述的海马胰蛋白酶酶解液对DPPH自由基进行清除的应用。
所述的海马胰蛋白酶酶解液对羟基自由基进行清除的应用。
所述的海马胰蛋白酶酶解液对超氧阴离子自由基进行清除的应用。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
本发明公开一种海马胰蛋白酶酶解液，同时经过试验表明，该种海马胰蛋白酶酶解液具有较好的抗氧化活性，对DPPH自由基（DPPH·）、羟基自由基（· OH）和超氧阴离子自由基（O2—·）都有较好的清除效果，因此这种海马胰蛋白酶酶解液可以作为抗氧化活性的药物和保健品的原料进行生产，同时该种海马胰蛋白酶酶解液获得容易，成本低廉，因此可以说它具有多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。
具体实施方式
下面将结合说明本发明的具体实施方式。一种海马胰蛋白酶酶解液，按照以下步骤制备获得：
将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS缓冲溶液，获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200，将混合溶液在50-60℃的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100℃的条件下水浴至少10min，灭酶活，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，经过滤膜过滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液；这里的海马粉末优选雄性海马制成的粉末。
通过上述方法所获得的海马胰蛋白酶酶解液，可以作为抗氧化剂应用。
对经过上述方法获得的海马蛋白酶酶解液进行抗氧化活性研究实验，具体步骤如下：
a. 清除DPPH自由基（DPPH·）：吸光度值Ai的测定，准确移取2.0mL海马酶解液，然后加入2.0mL配制好的DPPH溶液，混合均匀于25℃水浴中反应30min，反应结束后移入比色皿中测其吸光度值Ai；吸光度值Aj的测定，准确移取2.0mL酶解液，加入2.0mL乙醇，在25℃水浴中反应30min后，测定其吸光度值Aj；吸光度值A0的测定，准确移取2.0mL的DPPH，加入2.0mL的乙醇，于25℃水浴中反应30min后测定的吸光度值为A0。
b. 清除羟基自由基（·OH）：吸光度Ai的测定，准确移取海马酶解液2.0mL，先后加入2.0mL的FeSO4溶液（3mmoL/L）、2.0mL的水杨酸－乙醇溶液（6mmoL/L），最后加入2.0mL质量分数为3.75%的双氧水启动反应，在37℃水浴中反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm下测定吸光度值Ai；吸光度值Aj的测定，准确移取蒸馏水2.0mL，先后加入2.0mL的FeSO4溶液（3mmoL/L），2.0mL的水杨酸－乙醇溶液（6mmoL/L）和2.0mL的酶解液，同样条件下测定本底吸收值Aj；吸光度值A0的测定，移取蒸馏水2.0mL，先后加入2.0mL的FeSO4溶液（3mmoL/L）、2.0mL的水杨酸－乙醇溶液（6mmoL/L），最后加入2.0mL质量分数为3.75%的双氧水启动反应，在37℃下反应30min，然后测定其吸光度值A0。
c. 清除超氧阴离子自由基（O2—·）：测吸光度值Ai的测定，准确移取海马酶解液1.0mL，然后加入4.5mL pH为8.2的tris-HCl缓冲溶液（0.05mol/L），在25℃水浴中保温20min后，加入0.5mL邻苯三酚（25mmol/L），混匀后，在25℃水浴中反应5min，用1.0mL的HCl 溶液（8mmol/L）终止反应，在320nm下以蒸馏水作为空白对照测吸光度值A0和Ai；吸光度值Aj的测定，准确移取海马酶解液1.0mL，然后加入4.5mL pH为8.2的tris-HCl缓冲溶液（0.05mol/L），在25℃水浴中保温20min后，加入0.5mL的水，混匀后，在25℃水浴中反应5min，用1.0mL的HCl 溶液（8mmol/L）终止反应，在320nm下测吸光度值Aj。
实验结果表明：海马胰蛋白酶酶解液对DPPH自由基（DPPH·）的清除率为：雄海马53.5%，雌海马45.8%。对羟基自由基（·OH）的清除率为：雄海马88.35%，雌海马82.49%。对超氧阴离子自由基（O2—·）的清除率为：雄海马34.7%，雌海马51.5%。所以在进行海马胰蛋白酶酶解液的制备时，优选雄海马粉末作为原料。
通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马的胰蛋白酶酶解液对DPPH·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海马酶解液对DPPH·的清除率要好于雌海马。如表1所示。
通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马胰蛋白酶酶解液对·OH有显著的清除效果。其中，雄海马酶解液对·OH的清除率要好于雌海马。如表2所示。
通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马的胰蛋白酶酶解液对O2—·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海马酶解液对O2—·的清除率要好于雌海马。如表3所示。
表1
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表 2
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表3
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