说明书防止生物膜形成的方法
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本申请要求2012年5月7日提交的美国临时申请No.61/643,650的优先权。该申请的内容通过提述完整据此并入。
发明背景
生物膜是微生物聚集体，其中单独的细胞的表面彼此附着，通常包埋在自我产生的聚合物基质内。已经发现生物膜牵涉人体中的多种微生物感染，包括诸如尿路感染、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、牙龈炎之类的常见病症，以及诸如心内膜炎、囊性纤维化中的肺部感染、和永久性留置装置(例如关节假体、心脏瓣膜和宫内节育器)感染等较不常见但更致命的病症。还已经注意的是，细菌生物膜可能损害皮肤伤口愈合，并在愈合或治疗感染的皮肤伤口中降低局部抗菌效率。
在许多细菌中，包括葡萄球菌，负责细胞间粘附的主要分子是葡萄糖胺聚合物，聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)。PNAG是一种β-1-6-连接的N-乙酰葡萄糖胺聚合物，与诸如磷壁酸和蛋白质等其他聚合物一起形成细菌生物膜的细胞外基质的主要部分。
表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)是特征性地牵涉生物膜的医院感染(例如，在留置医疗装置上)的最常见病因。表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的生物膜形成是特别成问题的，因为生物膜保护细菌免受抗生素和宿主免疫系统的攻击，从而致使感染难于治疗。
因而，本领域需要治疗或预防表皮葡萄球菌或金黄色葡萄球菌感染的替代方法。确切地说，需要通过破坏或抑制这些细菌的生物膜形成而发挥作用的方法。
发明概述
本发明提供了用于治疗或预防其中基础病理学涉及含有PNAG的微生物生物膜的微生物感染(例如医院感染)的方法。本发明方法通常涉及向受试者 施用有效量的与PNAG特异性结合并破坏或抑制含有PNAG的微生物生物膜形成的抗体。这样的方法对于治疗医院葡萄球菌(例如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)感染特别有用。
因而，在一个方面，本发明提供了预防医院感染的方法，该方法通常包括：鉴定有风险因医疗程序产生含有聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)的微生物生物膜的受试者(例如人类受试者)；和向受试者施用有效量的与PNAG特异性结合并抑制含有PNAG的微生物生物膜形成的抗体。
在某些实施方案中，所述医院感染为肺部感染、关节感染、心内膜感染、皮肤感染、软组织感染、或败血症。
在某些实施方案中，所述抗体在所述医疗程序之前大约0到240小时施用。
在某些实施方案中，所述医疗程序为在受试者中安装例如支架、导管、插管、假体、或起搏器等外科植入物。
在某些实施方案中，所述抗体是全身施用的。在其它实施方案中，将所述抗体局部施用到外科植入物的植入部位。
在某些实施方案中，将所述抗体包被在外科植入物上或粘附到外科植入物上。
在某些实施方案中，以控释制剂的形式施用所述抗体。
在某些实施方案中，生物膜包含葡萄球菌属细菌(Staphylococcus)，例如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。
在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:1、2、和3中示出的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的VH结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:4、5、和6中示出的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID No:7中示出的VH结构域序列。
前述权利要求的任一项的方法，其中所述抗体包含在SEQ ID No:8中示出的VL结构域序列。
在另一方面，本发明提供了抑制含有聚N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)的微生物生物膜在受试者(例如人类受试者)体内的外科植入物上形成的方法，该方 法通常包括在外科植入物植入受试者之前向受试者施用有效量的与PNAG特异性结合的抗体。
在某些实施方案中，所述外科植入物为支架、导管、插管、假体、或起搏器。
在某些实施方案中，所述抗体在所述医疗程序之前大约0到240小时施用。
在某些实施方案中，所述抗体是全身施用的。在其它实施方案中，将所述抗体局部施用到外科植入物的植入部位。
在某些实施方案中，将所述抗体包被在外科植入物上或粘附到外科植入物上。
在某些实施方案中，以控释制剂的形式施用所述抗体。
在某些实施方案中，生物膜包含葡萄球菌属细菌，例如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。
在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:1、2、和3中示出的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的VH结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:4、5、和6中示出的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID No:7中示出的VH结构域序列。
前述权利要求的任一项的方法，其中所述抗体包含在SEQ ID No:8中示出的VL结构域序列。
在一个另外的方面，本发明提供了抑制含有PNAG的微生物生物膜在基体上形成的方法，该方法包括使该基体与有效量的与PNAG特异性结合的抗体接触。
在某些实施方案中，生物膜包含葡萄球菌属细菌，例如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌。
在某些实施方案中，所述抗体是人抗体。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:1、2、和3中示出的HCDR1、HCDR2、和HCDR3氨基酸序列的VH结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID Nos:4、5、和6中示出 的LCDR1、LCDR2、和LCDR3氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含在SEQ ID No:7中示出的VH结构域序列。
前述权利要求的任一项的方法，其中所述抗体包含在SEQ ID No:8中示出的VL结构域序列。
附图简述
图1描绘了测量在F598存在或缺乏下金黄色葡萄球菌(ATCC 33592)生物膜形成的体外测定的结果。
图2描绘了测量在F598存在或缺乏下表皮葡萄球菌1457的生物膜形成的体外测定的结果。
图3描绘了测量在F598存在或缺乏下表皮葡萄球菌RP62A的生物膜形成的体外测定的结果。
发明详述
本发明提供了用于治疗或预防其中基础病理学涉及含有PNAG的微生物生物膜的微生物感染(例如医院感染)的方法。本发明方法通常涉及向受试者施用有效量的与PNAG特异性结合并破坏或抑制含有PNAG的微生物生物膜形成的抗体。这样的方法对于治疗医院葡萄球菌(例如表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)感染特别有用。
I.定义
为了更易于理解本发明，首先对某些术语进行了定义。
如本文中使用的，术语“聚-N-乙酰葡萄糖胺”或“PNAG”指经由β1-6键连接的N-乙酰葡萄糖胺单体的聚合物。所述术语还涵盖部分或完全去乙酰化的聚-N-乙酰葡萄糖胺。
如本文中使用的，术语“含有PNAG的微生物生物膜”指包埋在PNAG基质中的微生物的固着聚集体。
如本文中使用的，术语“医院感染”指在医院内获得或来自在医院内或医院外进行的医疗程序的感染。医院感染的例子包括脓毒症(血流感染)、手术部位感染、或医院获得性肺炎。
如本文中使用的，术语“预防医院感染”指抑制或降低感染严重性。
如本文中使用的，术语“抗体”指包含4条多肽链(经由二硫键互相连接的2条重(H)链和2条轻(L)链)的免疫球蛋白分子、以及它们的多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(缩写VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDRs)，互补决定区与更为保守的被称为框架区(FR)的区域间隔。VH和VL各自由3个CDR和4个FR组成，按下列顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文中使用的，术语抗体的“抗原结合部分”包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶法获得的、合成的、或遗传工程改造的多肽或糖蛋白。可以例如使用任何合适的标准技术诸如蛋白水解酶消化或重组基因工程技术(牵涉编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA的操作和表达)从全抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)模拟抗体高变区(例如，分离的互补决定区(CDR))的由氨基酸残基组成的最小识别单位。诸如双链抗体(diabodies)、三链抗体(triabodies)、四链抗体(tetrabodies)和微型抗体(minibodies)的其它工程改造的分子也包含在表述“抗原结合部分”中。
如本文中使用的，术语“CDR”或“互补决定区”表示在重链和轻链两条多肽的可变区内发现的非连续抗原结合部位。这些特定的区域已经由Kabat等，J.Biol.Chem.252，6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，和由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和由MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中定义包括当针对彼此进行比较时的氨基酸残基的重叠或子集。涵盖如以上每一篇引用的参考文献所定义的CDR的氨基酸残基被列出用于比较。优选地，术语“CDR”为根据序列比较由Kabat定义的CDR。
如本文中使用的术语“框架(FR)氨基酸残基”指在Ig链的框架区中的那些氨基酸。如本文中使用的术语“框架区”或“FR区”包括属于可变区的一部分但不属于CDR(例如，利用CDR的Kabat定义)的一部分的氨基酸残基。因此，长度为大约100-120个氨基酸之间的可变区框架仅仅包括在CDR之外的那些氨 基酸。
如本文中使用的，术语“特异性结合”指抗体或其抗原结合片段以至少大约为1x 10-6M、1x 10-7M、1x 10-8M、1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M、1x 10-12M或更大的Kd与抗原结合和/或以比它与非特异性抗原的亲和力至少大两倍的亲和力与抗原结合的能力。
如本文中使用的，术语“抗原”指被抗体或其抗原结合部分识别的结合部位或表位。
如本文中使用的，术语“有效量”指当向受试者施用时，足以实现如本文中描述的对含有PNAG的微生物生物膜的治疗、预后或诊断的结合PNAG的抗体或其抗原结合部分的量。治疗有效量将取决于被治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化，这可容易地由本领域普通技术人员确定。施用剂量的范围例如可以为大约1ng到大约10,000mg、大约5ng到大约9,500mg、大约10ng到大约9,000mg、大约20ng到大约8,500mg、大约30ng到大约7,500mg、大约40ng到大约7,000mg、大约50ng到大约6,500mg、大约100ng到大约6,000mg、大约200ng到大约5,500mg、大约300ng到大约5,000mg、大约400ng到大约4,500mg、大约500ng到大约4,000mg、大约1ug到大约3,500mg、大约5ug到大约3,000mg、大约10ug到大约2,600mg、大约20ug到大约2,575mg、大约30ug到大约2,550mg、大约40ug到大约2,500mg、大约50ug到大约2,475mg、大约100ug到大约2,450mg、大约200ug到大约2,425mg、大约300ug到大约2,000mg、大约400ug到大约1,175mg、大约500ug到大约1,150mg、大约0.5mg到大约1,125mg、大约1mg到大约1,100mg、大约1.25mg到大约1,075mg、大约1.5mg到大约1,050mg、大约2.0mg到大约1,025mg、大约2.5mg到大约1,000mg、大约3.0mg到大约975mg、大约3.5mg到大约950mg、大约4.0mg到大约925mg、大约4.5mg到大约900mg、大约5mg到大约875mg、大约10mg到大约850mg、大约20mg到大约825mg、大约30mg到大约800mg、大约40mg到大约775mg、大约50mg到大约750mg、大约100mg到大约725mg、大约200mg到大约700mg、大约300mg到大约675mg、大约400mg到大约650mg、大约500mg、或大约525mg到大约625mg的根据本发明的抗体或其抗原结合部分。可以调整施用方案，以提供最佳治疗反应。有效量也是其中抗体或其抗原结合部分的任何毒性或有害作用(即，副作用)被最小化和/或有益作用远 胜于任何毒性或有害作用的量。
如本文中使用的，术语“受试者”包括任何人或非人类的动物。
II.生物膜
可以使用本发明方法来破坏或抑制含有聚N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)的微生物生物膜的形成。含有PNAG的生物膜可以由多种微生物产生，包括细菌和真菌。一般而言，可以使用本发明方法来破坏或抑制任何含有PNAG的微生物生物膜。
在细菌的情况下，含有PNAG的生物膜通常由例如葡萄球菌属细菌(例如表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(例如多重耐药金黄色葡萄球菌)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、和溶血葡萄球菌(S.haemolyticus)形成。已知的形成含有PNAG的生物膜的葡萄球菌属细菌的临床分离株包括但不限于，表皮葡萄球菌RP62A(ATCC号35984)、表皮葡萄球菌RP12(ATCC号35983)、表皮葡萄球菌M187、肉葡萄球菌TM300(pCN27)、金黄色葡萄球菌RN4220(pCN27)、和金黄色葡萄球菌MN8粘液型。
含有PNAG的生物膜也可由其它细菌形成，包括但不限于，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(例如大肠杆菌O157:H7和大肠杆菌CFT073)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia entercolitica)、地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)、副百日咳博德特菌(Bordetella parapertussis)和支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)。
III.医院感染
通过鉴定有风险因医疗程序产生含有聚-N-乙酰葡萄糖胺(PNAG)的微生物生物膜风险的受试者，并且向所述受试者施用有效量的与PNAG特异性结合并抑制含有PNAG的微生物生物膜形成的抗体，本发明提供了治疗或预防医院感染的方法。
给患者带来产生含有PNAG的微生物生物膜风险的任何医疗程序，无论 是在医院内还是在医院外进行的，都可以使用本发明方法进行治疗或预防。这样的医疗程序的例子包括但不限于，手术和外科装置的植入(例如导管、插管、假体、呼吸机、置换心脏瓣膜、和起搏器)。示例性外科装置包括但不限于，中心静脉导管；腹膜透析管；整形外科假体；整形网；心内装置，诸如人工瓣膜、起搏器、和支架；耳蜗植入物；乳腺植入物；气管内管；发音假体；人工晶状体(intraocular lens)。
本领域普通技术人员会领会，在受到免疫抑制的受试者的情况下，仅仅受试者在医院(或者可能藏匿能够形成含有PNAG的微生物生物膜的细菌的其它环境)内的事实，就能将这个受试者鉴定为具有产生含有PNAG的微生物生物膜(例如，在肺、泌尿道中或在开放性伤口中)的风险，即使他们没有接受外科手术也是如此。
IV.抗PNAG抗体
可以在本发明方法中使用与PNAG结合并抑制含有PNAG的细菌生物膜的形成的抗体。适合于在本发明中使用的示例性抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列在表1中列出。
表1.示例性坑PNAG抗体的VH、VL和CDR氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自下组的一个或多个CDR区氨基酸序列：SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6，9，10，11，12，13，14，17，18，19，20，21，和22。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCDR3、HCDR2和HCDR1区氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:1，2和3；
b)分别为SEQ ID NO:9，10和11；和
c)分别为SEQ ID NO:17，18和19。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自下组的LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:4，5和6；
b)分别为SEQ ID NO:12，13和14；和
c)分别为SEQ ID NO:20，21和22。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCDR3、HCDR2、HCDR1、LCDR3、LCDR2和LCDR1区氨基酸序列：
a)分别为SEQ ID NO:1，2，3，4，5和6；
b)分别为SEQ ID NO:9，10，21，12，13和14；和
c)分别为SEQ ID NO:17，18，21，20，21和22。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:7，15和/或23中列出的VH区氨基酸序列。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含在SEQ ID NO:8，16和/或24中列出的VL区氨基酸序列。
在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含选自下组的VH和VL区氨基酸序列：分别为SEQ ID NO:7和8；分别为SEQ ID NO:15和16； 和分别为SEQ ID NO:23和24。
V.修饰的抗PNAG抗体
抗PNAG抗体可以包含一种或多种修饰。可以使用本领域已知的任何技术来制造这种修饰形式的抗PNAG抗体。
i)降低免疫原性
在一些实施方案中，可以利用去免疫化作用来降低抗体或其抗原结合部分的免疫原性。如本文中使用的，术语“去免疫化作用”包括改变抗体或其抗原结合部分，从而修饰T细胞表位(参见，例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，可以分析来自初始抗体的VH和VL序列，并可以从各个V区产生人T细胞表位“图谱”，显示表位相对于互补决定区(CDR)的位置和所述序列内的其它关键残基。分析来自所述T细胞表位图谱的单独T细胞表位，以便鉴定具有低风险改变最终抗体活性的替代氨基酸取代。设计了包含氨基酸取代的组合的一系列备选VH和VL序列，随后将这些序列并入一系列在本文中公开的方法中使用的抗PNAG抗体或其片段中，然后测定它们的功能。然后，将包含修饰的V区和人C区的完整重链基因和轻链基因克隆到表达载体中，随后的质粒被引入细胞系中以供产生完全的抗体。然后，将所述抗体在合适的生物化学测定和生物测定中进行比较，并鉴定出最佳变体。
ii)效应子功能和Fc修饰
抗PNAG抗体可以包含介导一种或多种效应子功能的抗体恒定区(例如IgG恒定区，比如人IgG恒定区，诸如人IgG1或IgG4恒定区)。例如，补体的C1成分与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体激活在细胞病原体的调理作用和溶解中是重要的。补体激活还刺激炎症应答，并且还可能牵涉自身免疫性超敏反应。此外，抗体经由Fc区与各种细胞上的受体结合，其中在抗体Fc区上的Fc受体结合部位与细胞上的Fc受体(FcR)结合。存在许多针对不同抗体类别为特异性的Fc受体，这些抗体包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要且多样的生物学应答，包括抗体包被的颗粒的吞食和破坏、免 疫复合物的清除、抗体包被的靶细胞被杀伤细胞溶解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎症介质释放、免疫球蛋白产生的胎盘转运和控制。在优选的实施方案中，抗PNAG抗体或其片段与Fcγ受体结合。在替代性实施方案中，抗PNAG抗体可以包含缺乏一种或多种效应子功能(例如ADCC活性)和/或不能与Fcγ受体结合的恒定区。
本发明的某些实施方案包括其中在一个或多个恒定区结构域中的至少一个氨基酸已经被缺失或以别的方式被改变以提供期望生物化学特征的抗PNAG抗体，所述生物学特征例如为：当与大致具有相同免疫原性的完整的、未改变的抗体比较时，减弱或增强的效应子功能、以非共价方式二聚体化的能力、增强的定位在肿瘤部位的能力、缩短的血清半衰期、或延长的血清半衰期。例如，供在本文中描述的诊断和治疗方法中使用的某些抗体或其片段为结构域缺失的抗体，其包含与免疫球蛋白重链类似、但缺乏一个或多个重链结构域的至少一部分的多肽链。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个整个结构域将被缺失，比如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。
在某些其它实施方案中，抗PNAG抗体包含从不同的抗体同种型衍生的恒定区(例如，来自人IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4的两种或更多种的恒定区)。在其它实施方案中，抗PNAG抗体包含嵌合铰链(即，包含从不同的抗体同种型的铰链结构域(例如来自IgG4分子的上铰链结构域和IgG1中间铰链结构域)衍生的铰链部分的铰链)。在一个实施方案中，抗PNAG抗体包含来自人IgG4分子和在该分子的核心铰链区中的Ser228Pro突变(EU编号)的Fc区或其部分。
在某些抗PNAG抗体中，可以使用本领域已知的技术将Fc部分突变为增加或降低效应子功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可以降低循环修饰抗体的Fc受体结合，由此增强肿瘤定位。在其它情况下可能的是，与本发明一致的恒定区修饰调节补体结合，因而降低血清半衰期和结合细胞毒素的非特异性缔合。但可以利用恒定区的其他修饰来改变二硫键或寡糖部分，其允许由于抗原特异性或柔性增加所致的定位增强。使用公知的免疫技术，无需过度实验，可以容易地测量和量化所述修饰产生的生理学特征概貌、生物利用度和其它生物化学效应，诸如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。
在某些实施方案中，在抗PNAG抗体中采用的Fc结构域是一种Fc变体。 如本文中使用的，术语“Fc变体”指相对于所述Fc结构域从其中衍生的野生型Fc结构域具有至少一个氨基酸取代的Fc结构域。例如，其中该Fc结构域从人IgG1抗体衍生，所述人IgG1Fc结构域的Fc变体相对于所述Fc结构域包含至少一个氨基酸取代。
Fc变体的(一个或多个)氨基酸取代可以位于该Fc结构域内的任何位置(即，任何EU惯例的氨基酸位置)。在一个实施方案中，Fc变体包含在位于铰链结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH2结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH3结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。在另一个实施方案中，Fc变体包含在位于CH4结构域或其部分中的氨基酸位置处的取代。
抗体可以采用任何在效应子功能和/或FcR结合方面赋予改进(例如，减弱或增强)的领域公认的Fc变体。所述Fc变体可以包括，例如，在国际PCT公开WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2、和WO06/085967A2或美国专利Nos.5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253；和7,083,784中公开的氨基酸取代的任何一种，各自通过提述并入本文。在一个示例性实施方案中，抗PNAG抗体可以包括含有在EU位置268处(例如H268D或H268E)的氨基酸取代的Fc变体。在另一个示例性实施方案中，抗PNAG抗体可以包含在EU位置239(例如S239D或S239E)和/或EU位置332(例如I332D或I332Q)处的氨基酸取代。
在某些实施方案中，抗PNAG抗体可以包括包含改变该抗体的抗原依赖性效应子功能，尤其是该抗体的循环半衰期的氨基酸取代的Fc变体。当与缺乏这些取代的抗体比较时，这样的抗体展示出增加的或减少的与FcRn的结合，因此分别具有延长的或缩短的血清半衰期。具有提高的对FcRn的亲 和力的Fc变体被预期具有更长的血清半衰期，并且这样的分子在其中期望施用的抗体的长半衰期的治疗哺乳动物的方法(例如用于治疗慢性病或失调)中非常有用。相比之下，具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体被预期具有更短的半衰期，并且这样的分子可用于例如缩短的循环时间可能是有利的向哺乳动物的施用，例如用于体内诊断成像，或在初始抗体在长时间存在于循环中时具有毒副作用的情况下。并且，具有降低的FcRn结合亲和力的Fc变体不太可能穿过胎盘，因而在治疗孕妇疾病或失调中也是有用的。此外，其中可能期望FcRn结合亲和力降低的其它应用包括：其中期望定位于脑、肾脏、和/或肝脏的那些应用。在一个示例性实施方案中，改变的抗体展示出降低的从脉管系统跨过肾小球上皮的转运。在另一个实施方案中，改变的抗体展示出降低的从大脑跨过血脑屏障(BBB)进入血管间隙的转运。在一个实施方案中，具有改变的FcRn结合的抗体包含具有一个或多个氨基酸取代的Fc结构域，所述取代位于Fc结构域的“FcRn结合环”之内。FcRn结合环由氨基酸残基280-299(根据EU编号)组成。改变FcRn结合活性的示例性氨基酸取代公开于通过提述并入本文的国际PCT公开No.WO05/047327中。在某些示例性实施方案中，抗体或其片段包含具有一个或多个下列取代的Fc结构域：V284E、H285E、N286D、K290E和S304D(EU编号)。
在其它实施方案中，在本文中描述的诊断和治疗方法中使用的抗体具有的恒定区，例如IgG1或IgG4重链恒定区，被改变而降低或消除糖基化。例如，抗体还可以包含具有改变该抗体的糖基化的氨基酸取代的Fc变体。例如，所述Fc变体可以具有降低的糖基化(例如，N-或O-连接的糖基化)。在一个示例性实施方案中，Fc变体包含降低的通常可见于氨基酸位置297(EU编号)处的N-连接聚糖的糖基化。在另一个实施方案中，抗体具有在糖基化基序(例如含有氨基酸序列NXT或NXS的N-连接的糖基化基序)附近或之内的氨基酸取代。在一个具体的实施方案中，抗体包含具有在氨基酸位置228或299(EU编号)处的氨基酸取代的Fc变体。在更具体的实施方案中，抗体包含具有S228P和T299A突变(EU编号)的IgG1或IgG4恒定区。
赋予降低或改变的糖基化的示例性氨基酸取代公开于通过提述并入本文的国际PCT公开No.WO05/018572中。在优选的实施方案中，抗体或其片段被修饰而消除糖基化。这样的抗体或其片段可以被称为“agly”抗体或其片段，(例如“agly”抗体)。虽然不受理论的束缚，据信“agly”抗体或其片段可 以具有改进的体内安全性和稳定性特征。示例性的agly抗体或其片段包含缺乏Fc效应子功能的IgG4抗体去糖基化的Fc区，由此消除Fc介导的对正常生命器官的毒性的可能。而在其它实施方案中，抗体或其片段包含改变的聚糖。例如，抗体可以具有降低数量的在Fc区的Asn297处的N-聚糖上的岩藻糖残基，即，被无岩藻糖基化。在另一个实施方案中，抗体可以具有改变数量的在Fc区的Asn297处的N-聚糖上的唾液酸残基。
iii)共价连接
可以修饰抗PNAG抗体，例如通过将分子与所述抗体共价连接，使得共价连接不阻碍该抗体与它的同源表位特异性结合。例如，但并非限制于，可以通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、经由已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其他蛋白质上等来修饰抗体或其片段。可以通过已知的技术进行众多化学修饰的任何一种，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等等。另外，衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。
可以进一步将抗体或其片段与异源多肽在N或C端重组融合，或者与多肽或其它成分化学结合(包括共价和非共价结合)。例如，抗PNAG抗体可以与在检测分析中用作标记的分子和效应子分子(诸如异源多肽、药物、放射性核素、或毒素)重组融合或结合。参见，例如，PCT公开WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利No.5,314,995；和EP 396,387。
使用本领域已知的方法，抗PNAG抗体可以与异源多肽融合，以增加体内半衰期或用于在免疫测定中使用。例如，在一个实施方案中，PEG可以与抗PNAG抗体结合以增加它们的体内半衰期。Leong，S.R.，等，Cytokine16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30:512(2002)。
而且，抗PNAG抗体可以与标志序列诸如肽融合以促进它们的纯化或检测。在优选的实施方案中，标志氨基酸序列为六组氨酸肽，诸如提供在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif.，91311)中的标签等，其中许多可商购获得。如在Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:821-824(1989)中描述的，例如，六组氨酸使得融合蛋白便于纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于，相应于从流感病毒血凝素蛋白衍生的表位 (Wilson等，Cell 37:767(1984))的“HA”标签和“flag”标签。
抗PNAG抗体可以非结合形式使用或可以与多种分子中的至少一种结合，例如，以改进所述分子的治疗特性，促进靶标检测，或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，可以在纯化之前或之后标记或结合抗PNAG抗体。具体而言，抗PNAG抗体可以结合于治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂、或PEG。
本发明进一步涵盖与诊断剂或治疗剂结合的抗PNAG抗体。可以在诊断上使用抗PNAG抗体，用于例如监测免疫细胞失调(例如CLL)的发展或进展，作为临床试验程序的一部分，例如用于确定给定治疗和/或预防方案的效力。可以通过将抗PNAG抗体与可检测的物质偶联来促进检测。可检测的物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、利用各种正电子发射计算机断层显像的正电子发射金属、和非放射性顺磁金属离子。参见，例如，美国专利No.4,741,900关于可以与用作根据本发明的诊断剂的抗体结合的金属离子。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的实例包括链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素(dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素、和水母荧光素；并且适合的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
用于在本文中公开的诊断和治疗方法中使用的抗PNAG抗体可以与细胞毒素(诸如放射性同位素、细胞毒性药物、或毒素)治疗剂、细胞生长抑制剂、生物毒素、前药、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂、免疫活性配体(例如，淋巴因子或其它抗体，其中产生的分子与肿瘤细胞和效应细胞诸如T细胞两者结合)、或PEG结合。
在另一个实施方案中，用于在本文中公开的诊断和治疗方法中使用的抗PNAG抗体可以与降低肿瘤细胞生长的分子结合。在其它实施方案中，公开的组合物可以包含与药物或前药偶联的抗体或其片段。还有本发明的其他实施方案包括与特异性生物毒素(诸如蓖麻毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素或白喉毒素)或它们的细胞毒性片段结合的抗体或其片段的用途。选择使用哪种结合的或未结合的抗体将取决于癌症的类型和阶段、辅助治疗的使用 (例如，化学疗法或外部照射)和患者的状况。应当理解的是，鉴于本文中的教导，本领域的技术人员会容易地做出这样的选择。
应当理解的是，在先前的研究中，已经成功地使用了用同位素标记的抗肿瘤抗体来破坏动物模型以及在一些情况下在人类中的肿瘤细胞。示例性的放射性同位素包括:90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re和188Re。放射性核素通过产生电离辐射起作用，其引起细胞核DNA中的多条链断裂，导致细胞死亡。用来产生治疗结合物的同位素通常产生具有短路径长度的高能量α-或β-粒子。这样的放射性核素杀死在它们附近的细胞，例如，该结合物已经附着或已经进入的肿瘤细胞。它们对非定位的细胞具有很少的作用或没有作用。放射性核素基本上是非免疫原性的。
VI.抗PNAG抗体的药物制剂和施用方法
制备和向受试者施用抗PNAG抗体或其片段的方法是本领域的技术人员公知的或者易于确定。抗体或其片段的施用途径可以是口服、肠胃外、经吸入或局部施用。如本文中使用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。肠胃外施用的静脉内、动脉内、皮下和肌肉内形式通常是优选的。虽然所有这些施用形式在范围之内予以清楚考虑，但施用形式将会是注射溶液，尤其是对于静脉内或动脉内注射或滴注而言。通常，适合的用于注射的药物组合物包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。然而，在与本文中的教导相容的其它方法中，可以将多肽直接递送到不利的细胞群体部位，由此增加患病组织对治疗剂的暴露。
用于肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液、和乳剂。非水溶剂溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油、和可注射的有机酯类诸如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。在主题发明中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M且优选0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的盐水。其他常用的肠胃外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、或固定油。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂，诸如基于林格氏葡萄糖的那些，等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如像抗菌剂、 抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等等。更具体地说，适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在可溶于水的情况下)或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的即用即配的无菌粉末。在这样的情况下，该组合物必须是无菌的并且应该是流体，其程度是存在容易的可注射性。在制造和储存条件下它应该是稳定的，并且会优选保持对抗微生物诸如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、和液态聚乙二醇等等)、和其适合的混合物的溶剂或分散介质。可以通过例如使用包衣诸如卵磷脂借助于维持在分散体情况下所需的粒径和通过使用表面活性剂而维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂诸如对羟基苯甲酸、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现预防微生物作用。在许多情况下，优选的是包括等张剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或在组合物中的氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
在任何情况下，可以通过将活性化合物(例如抗体本身或与其他活性剂的组合)并入需要量的适当溶剂中然后无菌过滤来制备无菌注射溶液，其中所述溶剂根据需要具有本文中列举的成分之一或其组合。通常，通过将活性化合物并入无菌载体中来制备分散体，所述无菌载体含有基础分散介质和所需要的以上列举的其它成分。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加上任何其他期望的成分的先前无菌过滤的溶液的粉末。进行注射剂的制备，填充到诸如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶的容器中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，可以将这些制剂包装为试剂盒并以试剂盒的形式销售，诸如在共同未决的美国序列No.09/259,337和美国序列No.09/259,338中描述的试剂盒，这些文献各自通过提述并入本文。这样的制造物品优选地具有指示有关化合物可用于处理具有或有风险获得含PNAG的微生物生物膜的受试者的标签或包装说明书。
用于治疗以上描述的病症的本发明的稳定的抗体或其片段的有效剂量取决于许多因素而变化，这些因素包括施用手段、目标部位、患者的生理状态、该患者是人还是动物、施用的其他药物、以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，该患者是人，但是非人类哺乳动物，包括转基因哺乳动物也可以治疗。可以使用本领域技术人员已知的常规方法逐步调节治疗剂量以使得 安全性和有效性最佳化。
对于用抗体进行被动免疫，剂量范围可以，例如，按宿主体重计，从大约0.0001到100mg/kg，更普遍地0.01到5mg/kg(例如，0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，1mg/kg，2mg/kg，等等)。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在范围1-10mg/kg之内，优选地至少1mg/kg。居间于以上范围内的剂量也应在本发明的范围之内。
可以对受试者每天、隔天、每周或根据任何通过实证分析确定的其它时间表施用这样的剂量。示例性的治疗必须经过长时期例如至少六个月施用多个剂量。另外的示例性治疗方案必须每两周一次或每月一次或每3到6个月一次施用。示例性的剂量方案包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体，在此情况下施用的每一抗体的剂量可落入指示的范围。
可以在多种场合下施用抗PNAG抗体或其片段。在单次剂量之间的间隔可以例如为每天一次、每周一次、每月一次或每年一次。如通过测量患者体内的多肽或靶分子的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，剂量被调整为实现一定的血浆抗体或毒素浓度，例如1-1000ug/ml或25-300ug/ml。或者，可以将抗体或其片段作为持续释放制剂施用，在此情况下，需要的施用频率更低。剂量和频率取决于患者体内的抗体的半衰期而变化。一般而言，人源化抗体显示出最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人类抗体。在一个实施方案中，可以未结合的形式施用抗体或其片段。在另一个实施方案中，可以结合形式多次施用抗体。仍然在另一个实施方案中，抗体或其片段的施用可以为未结合的形式，然后为结合形式，或反之亦然。
施用的剂量和频率可以取决于治疗是预防性的还是治疗性的而变化。在预防性应用中，可以向还没有处于疾病状态的患者施用含有本发明抗体或其混合物的组合物，以增强患者的抵抗力。这样的量被定义为“预防有效量“。在这个用途中，精确的量同样取决于患者的健康和全身免疫状态，但是一般范围为每剂量从0.1到25mg，尤其是每剂量0.5到2.5mg。相对低的剂量是在长时期中以相对更不频繁的间隔施用的。一些患者在其后半生都继续接受治疗。
在治疗性应用中，有时需要较短间隔的较高剂量(例如每剂量从大约1 到400mg/kg的抗体，其中对于放射免疫结合物更常使用的剂量为从5到25mg，而对于细胞毒素药物结合的分子剂量更高)，直到疾病的进展减轻或终止时为止，并且优选地直到患者显示出疾病的症状部分或完全缓解时为止。此后，可以对患者施用预防性方案。
在一个实施方案中，可以用编码抗PNAG抗体的核酸分子(例如，在载体中)治疗受试者。编码多肽的核酸的剂量范围为每位患者大约10ng到1g，100ng到100mg，1ug到10mg,或30-300ug的DNA。用于感染性病毒载体的剂量为每剂量从10个到100个或更多的病毒粒子。
对于预防性和/或治疗性治疗，可以通过肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌肉内方式施用治疗剂。对于抗体施用，肌肉注射或静脉输注是优选的。在一些方法中，将治疗性抗体或其片段直接注射到颅内。在一些方法中，将抗体或其片段作为持续释放组合物或装置诸如MedipadTM装置施用。
任选地可以将抗PNAG抗体与有效治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性)的失调或病症的其它药剂组合。优选的其它药剂为本领域公认的并且以标准方式施用用于特定失调的那些药剂。
90Y标记抗体的有效单次治疗剂量(即，治疗有效量)的范围在大约5与大约75mCi之间，更优选地在大约10和大约40mCi之间。131I标记抗体的有效单次治疗非骨髓去除剂量的范围在大约5与大约70mCi之间，更优选地在大约5和大约40mCi之间。131I标记抗体的有效单次治疗去除剂量(即，可能需要自体骨髓移植)的范围在大约30与大约600mCi之间，更优选地在大约50和小于大约500mCi之间。由于相对于鼠抗体更长的循环半衰期，与嵌合修饰抗体结合，碘131标记的嵌合抗体的有效单次治疗非骨髓去除剂量的范围为在大约5和大约40mCi之间，更优选地小于大约30mCi。例如111In标记的成像标准通常小于大约5mCi。
虽然已经获得大量关于131I和.90Y的临床经验，其它放射性标记是本领域已知的，并且已经用于相似的目的。仍然有其他放射性同位素用于成像。例如，与本发明范围相容的其它放射性同位素包括但不限于123I、125I、32P、57Co、64Cu、67Cu、77Br、81Rb、81Kr、87Sr、113In、127Cs、129Cs、132I、197Hg、203Pb、206Bi、177Lu、186Re、212Pb、212Bi、47Sc、105Rh、109Pd、153Sm、188Re、199Au、225Ac、211A 213Bi。在这个方面，α、γ和β发射 体也与本发明相容。此外，鉴于本公开，人们认为本领域的技术人员可以容易地确定哪种放射性核素与所选择的治疗过程相容，无需过度实验。为此，已经在临床诊断中使用的其它放射性核素包括125I、123I、99Tc、43K、52Fe、67Ga、68Ga、以及111In。同样，已经用多种放射性核素标记了抗体，以便可能在靶向免疫疗法中使用(Peirersz等，Immunol.Cell Biol.65:111-125(1987))。这些放射性核素包括188Re和186Re及199Au和67Cu，但是使用范围要小一些。美国专利No.5,460,785提供了关于这样的放射性核素其它资料，将其通过提述并入本文。
如前文论述的，可以施用药学上有效量的抗体或其片段，用于体内治疗哺乳动物失调。在这方面将会理解的是，所公开的抗体或其片段将被配制为便于活性剂的施用并促进其稳定性。优选地，根据本发明的药物组合物包含药学上可接受的无毒性的无菌载体，诸如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等等。出于本申请的目的，与治疗剂结合或未结合的药学上有效量的抗体应该保持为产生足以实现与靶标有效结合并实现益处(例如，缓解疾病或失调的症状，或者检测一种物质或细胞)的量。在肿瘤细胞的情况下,多肽将优选地能够与选定的在肿瘤细胞或免疫反应细胞上的免疫反应抗原相互作用，并使这些细胞的死亡增加。当然，可以单剂量或多剂量施用本发明的药物组合物以提供药学上有效量的多肽。
与本公开的范围一致，可以根据上述治疗方法以足以产生治疗效果或预防效果的量向人或其它动物施用抗PNAG抗体。可以常规剂型向这些人或其它动物施用抗PNAG抗体，所述常规剂型是通过根据已知的技术将抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂组合制备的。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性是由与其相组合的活性成分的量、施用途径和其它公知的变量所支配的。本领域技术人员将进一步认识到，包含根据本发明的一种或多种多肽的混合物可被证明是特别有效的。
VII.治疗或预防牵涉含有PNAG的微生物生物膜的感染的方法
本发明提供了通过向需要的受试者施用包含一种或多种抗PNAG抗体或其抗原结合片段的药物组合物治疗或预防含有PNAG的细菌生物膜的方法。
在某些实施方案中，向受试者施用与一种或多种其它治疗剂相组合的包 含一种或多种抗PNAG抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一个具体的实施方案中，一种或多种其它治疗剂与包含一种或多种抗PNAG抗体的药物组合物同时施用。适合的其他治疗剂包括抗细菌剂(例如抗生素)。适合的抗细菌剂包括但不限于，青霉素G、青霉素V、氨苄青霉素、阿莫西林、巴氨西林、环己西林、依匹西林、海他西林、匹氨西林、甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、羧苄西林、替卡西林、avlocillin、美洛西林、哌拉西林、阿德诺西林、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢唑林、头孢呋辛酯、头孢孟多、头孢尼西、头孢西丁、头孢噻肟、头孢唑肟、cefinenoxine、头孢曲松、拉氧头孢、头孢替坦、头孢哌酮、头孢他啶、亚胺培南、克拉维酸盐、特美汀、舒巴坦、新霉素、红霉素、甲硝唑、氯霉素、克林霉素、林可霉素、万古霉素、甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲恶唑、氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类和利福平。(参见，例如，Goodman和Gilman's，Pharmacological Basics of Therapeutics，8th Ed.，1993，McGraw Hill Inc.)
本领域技术人员将能够通过常规实验来确定什么有效的无毒性量的抗体(或其它治疗剂)将会用于治疗PNAG相关疾病或失调的目的。例如，治疗活性量的多肽可以根据诸如受试者的年龄、性别、医学并发症(例如，免疫抑制状态或疾病)和体重、以及所述抗体在受试者中引出期望的反应的能力而变化。可以调整施用方案，以提供最佳治疗反应。例如可以每天施用几个分次剂量，或者该剂量可以如治疗情况的紧急事件所指示而按比例减少。然而，通常，有效剂量预期在大约每天每千克体重0.05到100毫克，更优选地从大约每天每千克体重0.5到10毫克的范围内。
可以根据患者的需要调整抗PNAG抗体的精确施用时间。在抑制含有PNAG的微生物生物膜在受试者体内形成的预防性治疗的情况下，可以在暴露于形成生物膜的微生物(例如，在入住医院时或在医疗程序开始时)之前的任何时间施用所述抗PNAG抗体。例如，可以在暴露于形成生物膜的微生物之前0到240小时之间，例如大约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、2324、30、40、60、80、90、100、110、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、2010、220、230、和/或240小时施用抗PNAG抗体。
VIII.实施例
通过下列实施例进一步例示了本发明，这些实施例不应该解释为进一步的限制。序列表、附图和所有参考文献的内容，在本申请各处引证的专利和公开的专利申请都清楚地通过提述并入本文。
实施例1.F598对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制
使金黄色葡萄球菌(ATCC 33592)在TSB培养基中生长过夜，调整为1E+07CFU/ml。然后将细菌等分到含有5或20ug/ml浓度的F598或人IgG对照的MBEC平板(MBEC AssaysTM，Innovotech)中，温育5.5h。在温育期之后，去除MBEC平板的栓(peg)，清洗，通过利用发光(BacTiter-GloTMMicrobial Cell Viability Assay,Promega)将形成的生物膜的量进行定量。在这个实验中，F598显示出清楚的抵抗金黄色葡萄球菌体外生物膜产生的保护作用。具体地说，F598显示了超过50％的对金黄色葡萄球菌生物膜产生的抑制(在5和20μg/ml分别为43+/-8％和37+/-3％)(参见图1)。
实施例2.F598对表皮葡萄球菌(临床分离株1457)生物膜的抑制
使表皮葡萄球菌(临床分离株1457)在多孔平板中在25、50、100、或200μg/ml的F598或人IgG1对照存在下的TSB培养基中生长8h。然后清洗孔，用结晶紫染色。通过测量在波长490nm处的样品吸光度将生物膜定量。在这个实验中，F598显示出清楚的抵抗表皮葡萄球菌1457体外生物膜产生的剂量依赖性保护作用。具体地说，在25μg/ml时，生物膜形成为对照的40％(0.2对0.5OD)，并且在200μg/ml时，生物膜形成为对照的20％(0.1对0.5OD)(参见图2)。
实施例3.F598对表皮葡萄球菌(临床分离株RP62A)生物膜的抑制
使表皮葡萄球菌(临床分离株RP62A)在多孔平板中在19、38、或76μg/ml的F598或PBS缓冲液对照存在下的TSB培养基中生长8h。然后清洗孔，用结晶紫染色。通过测量在波长490nm处的样品吸光度将生物膜定量。在这个实验中，F598显示出清楚的抵抗表皮葡萄球菌RP62A体外生物膜产生的剂量依赖性保护作用。具体地说，19、38、和76μg/ml的F598分别减少了36、60和76％的生物膜形成(相对于相应的PBS对照)(参见图3)。