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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201310407551.5 (22)申请日 2013.09.01 C12N 5/10(2006.01) C12N 15/85(2006.01) C40B 50/06(2006.01) C40B 40/02(2006.01) (71)申请人 翁炳焕 地址 317300 浙江省仙居县城关水阁路 1 号 仙居县人民医院 (72)发明人 翁炳焕 舒静 李晓 张燕 沈国松 黄荷凤 (54) 发明名称 重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细 胞模型及其细胞库 (57) 摘要 本发明涉及用于医学领域的重组 hTERT 构建 先天性心脏病室间隔。
2、缺损细胞模型及其细胞库， 其主要特征是以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质 粒 pCIneo-hTERT 和载体 pLXSNneo， 以 Ligation Mix 连接经 PCR 扩增、 凝胶电泳分离的 hTERT 和 pLXSNneo 酶切产物， 构建 pLXSNneo-hTERT 重组 子， 转化 DH5a 感受态细胞以纯化扩增并抽提质 粒， 以脂质体转染离体传代呈对数生长的先天性 心脏病室间隔缺损细胞， 使重组子与细胞 DNA 整 合， 并扩大培养经 G418 筛选含阳性重组子克隆， 筛选细胞形态、 生长曲线、 染色体核型、 裸鼠致瘤 试验、 细胞端粒酶活性、 hTERT mRNA 。
3、表达、 免疫组 化、 细胞增殖周期及其凋亡率符合永生细胞特性 并与原代细胞相同或相近者作为 hTERT 转染先天 性心脏病室间隔缺损细胞模型冻存于液氮， 为从 细胞水平在体外长期研究其发病机制奠定基础。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书8页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104419675 A (43)申请公布日 2015.03.18 CN 104419675 A 1/2 页 2 1. 一种用于医学领域的重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细 胞库的方法， 其主要特征是以内切酶 EcoR I 和。
4、 Xho I 双酶切质粒 pCIneo-hTERT 和载体 pLXSNneo， 以 Ligation Mix 连接经 PCR 扩增、 凝胶电泳分离的 hTERT 和 pLXSNneo 酶切产 物， 构建 pLXSNneo-hTERT 重组子， 转化 DH5a 感受态细胞以纯化扩增并抽提质粒， 以脂质体 转染离体传代呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损细胞， 使重组子与细胞 DNA 整合， 并 扩大培养经 G418 筛选含阳性重组子克隆， 筛选细胞形态、 生长曲线、 染色体核型、 裸鼠致瘤 试验、 细胞端粒酶活性、 hTERT mRNA 表达、 免疫组化、 细胞增殖周期及其凋亡率符合永生细 胞特性。
5、并与原代细胞相同或相近者作为重组 hTERT 转染的先天性心脏病室间隔缺损体外 研究细胞模型冻存于液氮， 为从细胞水平 ( 替代人体或动物直接试验 ) 在体外长期研究其 发病机制奠定基础。 2. 根据权利要求 1 所述的重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细 胞库的方法， 其特征是所指细胞模型为 (1) 细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上 皮细胞样贴壁生长 ； (2) 细胞的生长曲线如以培养时间为横轴， 细胞数量为纵轴， 在 hepato ZYME-SFM 无血清培养基中呈 “S” 特征或 “穹隆” 形成 ； (3) 细胞染色体核型为二倍体 “46， XX” 或 “4。
6、6， XY” ， 或相同于本发明采集的原代细胞 ； (4) 细胞不能在软琼脂内生长 ( 形成克 隆) ； (5)细胞为非恶化细胞， 裸鼠致瘤试验阴性 ； (6)细胞的DNA中整合了hTERT基因， 表达 hTERT 基因的 mRNA 产物 ； (7) 细胞传代至第 77 代、 培养至第 10 天时， 呈对数生长、 圆形、 梭 形、 铺满瓶底， 其细胞生长汇合率达 83以上， 此后随着传代次数的增加， 细胞生长变慢、 变 稀疏 ； (8) 用于在体外从细胞水平研究环境因素致先天性心脏病室间隔缺损的发病机制、 研究对环境有害物的耐受性并作为遗传资源贮存。 3.根据权利要求1所述的重组hTERT构建。
7、先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞 库的方法， 其特征是取自因其他实验所需而采集的、 并在其他实验后多余、 废弃的先天性心 脏病室间隔缺损患儿羊水脱落细胞构建之。 4. 根据权利要求 1 所述的重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其 细胞库的方法， 其特征是所用的培养液为含有 20胎牛血清、 5 10nmol L 胰岛素的 RPMI1640 或含有 20mL L 胎牛血清、 5 10nmol L 胰岛素的低糖 DMEM 培养液。 5. 根据权利要求 1 所述的重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细 胞库的方法， 其特征是用作传代培养以备脂质体转染法导入。
8、重组子的先天性心脏病室间隔 缺损组织细胞， 在原代扩增培养中， 其收集指标是细胞贴壁培养约 3 4 天、 细胞形态为梭 形、 小园形细胞不到 10、 贴壁细胞的汇合率达 75 85、 处于刚进入对数生长期时收 集细胞 ； 用作脂质体转染法导入重组子的传代先天性心脏病室间隔缺损组织细胞， 其时机 选择的指标是细胞形态为梭形、 尚未见或仅见少于 10小园形细胞、 贴壁细胞的汇合率达 55 65、 处于将进入或刚进入对数生长期时的培养细胞 ； 传代细胞系收集的指标是选 择细胞贴壁生长的汇合率达 80 85、 处于对数生长期的前期时收集细胞 ； 染色体核型分 析的细胞收集指标是细胞生长密度达 85-9。
9、5、 小园形细胞占 10以上、 处于对数生长期 的细胞。 6.根据权利要求1所述的重组hTERT构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞 库的方法， 其特征是以 0.01胶原酶 II 消化贴壁生长的先天性心脏病室间隔缺损组织细 胞， 作染色体核型分析时， 每 5mL 培养液中加入 250ug ml 秋水仙素 100ul， 混匀后置 37 权 利 要 求 书 CN 104419675 A 2 2/2 页 3 培养箱 4 小时。 7. 根据权利要求 1 所述的重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细 胞库的方法， 其特征是细胞库的构建包括 (1) 筛选经鉴定后符合永生化细胞特性。
10、并与原 代细胞相同或相近的重组 hTERT 转染的先天性心脏病室间隔缺损细胞 ； (2) 作传代、 扩大 培养， 取生长状态良好、 处于对数生长期的不同世代的贴壁细胞 ； (3) 经消化、 终止、 离心 (1200rmin， 6min)步骤收获细胞 ； (4)用含二甲亚砜的冻存液配制密度为5105个ml 的细胞悬液 ； (5) 按照 4， 0.5h ； -20， 2h ； -70， 过夜 ； 入 -196液氮的程序冻存细胞 ； (6) 可再生性地长期保存 hTERT 转染的先天性心脏病室间隔缺损细胞模型， 备作遗传资源 和科研材料。 权 利 要 求 书 CN 104419675 A 3 1/8。
11、 页 4 重组 hTERT 构建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细 胞库 技术领域 0001 本发明涉及重组 hTERT( 端粒酶逆转录酶催化亚基 ) 或 hTERT 介导构建先天性心 脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库， 主要用于新生儿出生缺陷干预研究领域， 为先天性 心脏病室间隔缺损的体外研究提供细胞模型并保存其科研资源。 背景技术 0002 先天性心脏病室间隔缺损是发病率最高的出生缺陷之一， 已成为严重的社会问 题。我国每年新发先天性心脏病 11.2 万 -16.0 万例， 将造成经济损失 109 亿 -156 亿 ； 先天 性心脏病的治疗费每年高达 120 亿元， 给社会和家庭造成了严。
12、重的心理负担和精神痛苦， 已严重影响我国的人口质量， 已成为社会发展的沉重负担和可持续发展的严重障碍。 0003 先天性心脏病等出生缺陷的研究及干预已成为我国政府行为， 党中央 决定 自 2006 年开始实施 “出生缺陷干预工程” ； 中华人民共和国主席令 1994 年 10 月 27 日第 三十三号 公布我国自 1995 年 6 月 1 日起施行 ( 出生缺陷 ) 产前诊断的有关法规标准 ； 全 国人民代表大会相继颁布了 中华人民共和国母婴保健法 、中华人民共和国母婴保健法 实施办法 等一系列法规， 促进了出生缺陷产前诊断、 干预工作的开展 ； 在 国民经济和社会 发展的第十一个五年规划纲要。
13、 中强调加大出生缺陷干预力度， 改善出生人口素质 ； 在 国 家中长期科学和技术发展规划纲要 (2006-2020 年 ) 中将出生缺陷的研究列为优先主题。 0004 目前认为先天性心脏病室间隔缺损是遗传和环境因素等复杂关系相互作用的结 果， 主要包括 . 胎儿发育的环境因素 ： 如妊娠前三个月患病毒或细菌感染尤其是风疹病 毒， 其次是柯萨奇病毒， 其出生的婴儿先天性心脏病的发病率较高。其它如羊膜的病变， 胎 儿受压， 妊娠早期先兆流产， 母体营养不良、 糖尿病、 苯酮尿、 高血钙， 放射线和细胞毒性药 物在妊娠早期的应用， 母亲年龄过大等均有使胎儿发生先天性心脏病的可能。 遗传因素 ： 多数。
14、的先天性心脏病是由多个基因与环境因素相互作用所形成。 其他因素 ： 与地区、 性别 也有关系。 0005 近年来， 对先天性心脏病等出生缺陷的研究主要是针对遗传、 生物、 物理、 化学因 素与发病 ( 率 ) 的关系进行流行病学方面的调查研究。但是， 由于没有可在体外长期培养 的、 可用于先天性心脏病发病机制研究的永生细胞模型及其细胞库， 就难以从细胞水平在 体外研究先天性心脏病室间隔缺损细胞受物理、 化学、 生物、 遗传等影响的基因突变、 基因 表达、 功能改变、 生理特性、 生物传导等机制， 从而严重限制了先天性心脏病室间隔缺损出 生缺陷的进一步研究。 0006 国外文献报道， 猴肾病毒4。
15、0(SV40)可以使某些人类细胞发生永生化。 Poul in DL、 Kung AL 和 Sullivan CS 等研究表明， SV40T 抗原基因的导入能加快转化细胞的生长速率， 永生化细胞在体外多次传代后， 仍具有相对稳定的增殖特性和功能状态， 同时也能保留其 原始细胞的许多分化表型， 可以用于转基因动物模型及人类和动物某些种类的细胞模型的 建立， 据此可以借助于研究转基因永生化细胞及动物模型而在体外研究原始细胞的特性， 说 明 书 CN 104419675 A 4 2/8 页 5 从而研究其发病机制。 0007 但最近有研究发现， SV40Tag 转染的细胞伴随着 DNA 损伤修复机制的。
16、丢失、 核型的 不稳定性以及少数细胞致瘤性转化。此外， 长期体外培养发现部分转染 SV40Tag 的细胞只 是延长了寿命， 或仅仅渡过了衰老期(MI期)， 多数细胞会最终进入危机期(M2期)而死亡， 说明细胞并未获得永生化。同时 SV40 病毒具有致瘤性， 与某些肿瘤的发生、 发展有关， 因此 SV40Tag 转染的细胞对某些研究也存在一定程度的限制性。 0008 国外研究表明， 导入外源性 hTERT 可以使细胞保持正常表型及分化特征。近年来 已利用 hTERT 成功建立了某些细胞的永生化细胞系， 基本保持染色体稳定、 分化正常、 接触 抑制、 无致瘤性等相对 “正常” 的生长特征。可以用于。
17、人类和动物某些种类的细胞模型的建 立， 对借助于研究转基因永生化细胞模型而研究原始细胞的特性， 从而研究其发病机制， 具 有重要的意义。 0009 在口腔医学领域， 日本学者 Kamata、 Fujita 和 Fujii 转染 hTERT 建立了永生化人 牙龈成纤维细胞、 牙周细胞、 牙髓细胞系和牙囊细胞系， 细胞群体倍增数达 150 次以上， 细 胞均表现原有的生物学特性， 诱导培养后都可以表达来源细胞的相关蛋白。Kitagawa 等转 染 hTERT 建立了人成牙骨质细胞系， 细胞倍增达 200 次以上， 细胞分化标志物如碱性磷酸 酶、 I 型胶原等表达稳定。因研究工作的需要， 几乎每种疾。
18、病都有各自的细胞模型。如糖尿 病细胞模型、 癌细胞细胞模型、 转基因细胞模型、 绝经期综合症细胞模型、 子宫内膜细胞模 型、 癫痫细胞模型、 电子细胞模型、 酒精性痴呆细胞模型、 脑水肿细胞模型。等等。 0010 但是， 至今尚未见有关以 hTERT 构建可用于在体外从细胞水平研究先天性心脏病 室间隔缺损发病机制的永生细胞模型及其细胞库的文献报道， 也无法开展相关项目的研 究。为了解决上述问题， 本发明人提出了本发明。 发明内容 0011 本发明的目的是要提供重组 hTERT( 端粒酶逆转录酶催化亚基 ) 或 hTERT 介导构 建先天性心脏病室间隔缺损细胞模型及其细胞库的方法， 另一目的是为。
19、在体外从细胞水平 研究先天性心脏病室间隔缺损的发病机制提供 hTERT 介导先天性心脏病室间隔缺损细胞 模型及其细胞库。 0012 本发明的目的是这样实现的 ： 以内切酶EcoR I和Xho I双酶切质粒pCIneo-hTERT 和载体pLXSNneo， 以Ligation Mix连接经PCR扩增、 凝胶电泳分离的hTERT和pLXSNneo酶 切产物， 构建 pLXSNneo-hTERT 重组子， 转化 DH5a 感受态细胞以扩增、 纯化并挑取耐氨苄青 霉素菌落抽提质粒， 以脂质体转染法导入离体传代呈对数生长的先天性心脏病室间隔缺损 细胞， 使重组子与细胞的DNA整合， 并扩大培养经6418。
20、筛选的阳性重组子的克隆， 筛选细胞 形态、 生长曲线、 染色体核型、 裸鼠致瘤试验、 转染细胞端粒酶活性、 hTERT mRNA 表达产物、 免疫组织化学染色、 细胞增殖周期及细胞凋亡率符合永生化细胞特性并与原代细胞相同或 相近者作为 hTERT 介导先天性心脏病室间隔缺损体外研究细胞模型冻存于液氮中， 为从细 胞水平在体外长期研究先天性心脏病室间隔缺损的发病机制奠定基础。 0013 本发明以 PCR 扩增、 琼脂糖凝胶电泳提纯 hTERT， 经基因载体 pLXSNneo 和脂质体 转染法导入先天性心脏病室间隔缺损细胞而构建其细胞模型， 其组织细胞用 0.01胶原 酶 II 消化而不用常规的胰。
21、蛋白酶消化， 以仅使引起细胞粘连的胶原被消化或使细胞悬浮， 说 明 书 CN 104419675 A 5 3/8 页 6 减少了细胞壁的蛋白质被消化而伤及细胞， 使细胞培养的成功率由一般的约 85提高到 95以上 ； 选用了含 20mL L 胎牛血清、 5 10nmol L 胰岛素的特定培养基， 使细胞不 会生长过快而影响 hTERT 基因的整合， 也不会因缺少营养或细胞生长刺激因子而使细胞在 未达到要求的汇合率、 未进入对数生长期前就过早死亡， 或对数生长期缩短 ； 制备的细胞系 在 -196液氮中冻存 1 个月后复苏培养， 均能生长出贴壁细胞 ； 在作细胞系染色体鉴定时， 秋水仙素的用量及。
22、作用时间是常规的510倍， 使染色体分裂相增加， 足以计数和分析 ； 此 外， 与SV40相比， 以hTERT构建细胞模型更可以使细胞保持正常表型及分化特征， 更能保持 染色体稳定、 分化正常、 接触抑制、 无致瘤性及渡过 M2 危机期等生长特征， 对在体外从细胞 水平研究先天性心脏病室间隔缺损的病理机制具有更大的意义。 附图说明 0014 图 1 是本发明制备的先天性心脏病室间隔缺损细胞模型 ( 贴壁生长 ) 图。 0015 如图1， 细胞传代至第77代、 培养至第10天时， 呈对数生长、 圆形、 梭形、 铺满瓶底， 其细胞生长汇合率达 83以上， 此后随着传代次数的增加， 细胞生长变慢、 。
23、变稀疏。 具体实施方式 0016 1、 hTERT 的提取 ： 酶切 pClneo-hTERT ： hTERT 位于质粒 pClneo-hTERT 的 EcoRI 与 SalI 位点之间， pLXSNneo 载体多克隆位点 (MCS) 含 EcoRI 与 XhoI 酶切位点。市售购买 pCIneo-hTERT 质粒， 溶解于适量的超净 H2O 或 TE 缓冲液中， 加 2uL10 酶切缓冲液和 18uL H2O， 加限制性内切酶 EcoR I 和 Xho I 各 0.5ul， 37温育 1h， 75加热 15min， 灭活酶， 加 入 5uL 电泳加样缓冲液 ( 也可通过加入 0.5mol L。
24、 EDTA) 终止反应， 按常规 PCR 法扩增 hTERT 后， 收取扩增物以备电泳。 hTERT 电泳 ： 取电泳级琼脂糖以电泳缓冲液配成 10 琼脂糖凝胶， 倒入已封好的凝胶灌制平台上， 插上样品梳， 待胶凝固后从制胶平台上除去封 带， 拔出梳子， 放入加有足够电泳缓冲液的电泳槽中， 缓冲液高出凝胶表面大约 1mm， 用适量 的 10 加样缓冲液制备 hTERT 酶切样品， 然后用移液器将样品加入样品孔中， 同时做合适 的标准对照物， 接通电极， 使 hTERT 向阳极移动， 在 1-10V cm(80V) 凝胶的电压下电泳至 足够分离 hTERT 片段的距离时 (30min)， 关闭电。
25、源。 hTERT 纯化与回收 ： 从琼脂糖中分离 hTERT 条带 ： 在长波紫外光源下将含目标 hTERT 片段的凝胶条带切下装入透析袋中， 向透析 袋内加入 2ml 电泳缓冲液， 使之浸没凝胶， 并排空汽泡， 将透析袋水平放入电泳槽 ( 长度方 向与电泳平行 )， 加入适量缓冲液将透析袋浸没 ( 约 6-7mm)， 接通电源， 150 伏电洗， 在紫外 灯下观察待hTERT全部移出凝胶， 改变电场方向继续通电1分钟， 从透析袋中吸出缓冲液于 1 5ml Eppendorf 管中， 加入 1.5 倍体积正丁醇， 混匀抽提去 EB， 在台式离心机上最高速 2 分钟， 吸去上层正丁醇溶液， 如此。
26、重复二次， 自下层 hTERT 的溶液中加入等体积酚氯仿 (2 个 ) 抽提 2 次， 上清转入另一 Eppendorf 管中加入 1 10 倍体积 3M NaAc、 2 倍体积预冷无 水乙醇， 于 20过夜， 12000g， 4下离心 10 分钟， 得 hTERT 沉淀， 弃上清， 加入 70乙醇洗 涤 2 次后弃干乙醇， 加入 50l TE 溶解 hTERT。此外， 还可用低熔点琼脂糖凝胶法、 hTERT 滤膜插片法等将目的 hTERT 片段从凝胶中分离、 纯化出来。 0017 2、 hTERT 与 pLXSNneo 载体的连接 ： 取 9l 上述纯化的 hTERT 成份 (0.1-5g)。
27、、 Ll10mmol/L ATP、 10ul Ligation Mix或大肠杆菌DNA连接酶、 2ul pLXSNneo空载体混合， 说 明 书 CN 104419675 A 6 4/8 页 7 15温育 24h， 构建 pLXSNneo-hTERT 重组子。 0018 3、 pLXSNneo-hTERT 重组子的纯化、 扩增、 鉴定 ： 大肠杆菌感受态的制备 ： 其基本 方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌， 使之进入感受态得以转化， 用CaCl2 制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞， 常用于成批制备感受态细菌， 本法适用于大多数 大肠杆菌菌株， 操作过程简述如下 ： 从 3。
28、7培养 16 20h 的新鲜平板中挑取一个单菌落 ( 如大肠杆菌 DH52)， 或 1ml 新鲜的 16 20h 过夜培养物， 转到一个含有 i00mlLB 培养基的 1L 或 500ml 烧瓶中， 于 37剧烈振摇培养约 2 3h( 旋转摇床 200 300r min)， 每隔 2030min测量OD600值0.4， 在无菌条件下将细菌转移到一个， 用冰预冷的50ml聚丙烯 离心管中， 在冰上放置1020min， 于4用SorvallGS2转头(或与其离心管相配的转头) 以 4000r min 离心 10min， 以回收细胞， 倒数培养液， 将管倒置 1min 以使最后残留的痕量 培养液流尽。
29、， 以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀， 放于冰上， 于4用SorvallGS3 转头(或与其相应的转头)以4000rmin离心10min， 以回收细胞， 倒出培养液， 将管倒置 1min 以使最后残留的痕量培养液流尽， 每 50ml 初始培养物用 2ml 冰预冷的 0.1M CaCl2重 悬每份沉定， 此时， 可以迅速将细胞分装成小份， 液氮中冰冻， -70贮存备用。以感受态 大肠杆菌纯化、 扩增 pLXSNneo-hTERT 重组子 ： 用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中 各取 200l 转移到无菌的微量离心管中， 每管加 DNA 或连接反应混合物 ( 体积 10l，。
30、 DNA50ng)， 轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min， 将离心管放到预加温到40的循 环水浴中的试管架上， 放置 90s 2min， 不要摇动试管， 快速将管转移到冰浴中， 使细胞冷 却 1 2min， 每离心管加 8001SOC 培养基， 用水浴将培养基加温到 37， 然后将管转移到 37摇床上， 温育 45min 使细菌复苏， 并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因， 将适当体 积 ( 每 90mm 平板可达 2001) 已转化的感受态细胞转移到含 200mmol/L MgSO4 和相应抗 生素的 SOB 培养基上， 将平板置于室温至液体被吸收， 倒置平皿， 于 37培养， 1。
31、2 16h 后 可出现菌落。 筛选、 扩增重组子 ： 用无菌牙签或灭菌接种针挑选单个菌落接种于5mL无菌 的 LB 培养基或丰富培养基 ( 如超级肉汤或 TB 超级肉汤培养基 ) 中， 培养过夜后， 再加入到 500mL含LB培养基(含有适当抗生素)的2L烧瓶中， 再于37培养至饱和状态(OD6004， 为提高产量， 应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度， 振摇速度应大于 400r min)， 要求 4下， 6000g 离心 10min， 用 4mL GTL 溶液重悬沉淀， 并转移到一个容积 20mL 的高速离心管中 ( 细菌沉淀可以在 -20或 -70无限期保存 )， 加入 1m。
32、L 新配的 含 25mg mL 溶菌酶的 GTE 溶液， 重悬沉淀， 于室温放置 10min， 加入 10mL 新配 NaOH SDS 溶液， 并且轻轻混匀直至液体变得均一、 清亮而粘稠， 于冰上放置 10min， 加入 7.5mL 乙酸溶 液， 用吸管轻轻搅拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀， 于冰上放置 10min， 于 4， 20000g 离 心 10min， 将上清轻轻倒入至另一个干净的离心管中， 如果有可见的飘浮物可用数层纱布过 滤， 加入 0.6 倍体积的异丙醇， 颠倒混匀， 室温放置 5 10min， 于室温， 1500g 离心 10min， 加入2mL70乙醇轻轻洗涤沉淀， 然后短。
33、暂快速离心， 吸去乙醇， 并真空干燥(沉淀可在4 长期保存 )。重组质粒的鉴定与扩增 ： 挑取平皿上的单菌落， 接种于 3ml 含 100ug ml 氨苄青霉素 LB 培养基中， 37， 250r min 摇床中培养， 14h 后收集培养物， 4、 10000r min离心5min， 按试剂盒说明书小量提取并纯化重组质粒 ； 以EcoRI和HindIII双酶切重组 质粒反应体系 ： 限制性内切酶各 0.5ul、 10buffer2ul、 重组质粒 10ul、 加水补足至 20ul， 37酶切 1h。酶切产物于 80V 电压条件下进行 0.8琼脂糖电泳， 时间 30min， 凝胶成像系 说 明 。
34、书 CN 104419675 A 7 5/8 页 8 统拍照 ； 按常规测定重组质粒的序列 ； 重组质粒经酶切、 测序鉴定准确后， 将含有该质粒的 细菌接种至 LB 培养液中， 扩增培养， 按大剂量质粒抽提试剂盒说明书进行大剂量质粒抽提 纯化， 紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度后备用。 0019 4、 pLXSNneo-hTERT 重组子导入先天性心脏病室间隔缺损细胞及其阳性克隆的筛 选 ： 先天性心脏病室间隔缺损细胞的收集与培养 ： 以无菌操作提取在作其他实验或其他 检查后多余、 废弃的先天性心脏病室间隔缺损患儿的羊水脱落组织细胞， 以细胞终浓度约 为 1105 mL 备用， 取上述呈单个分。
35、散的细胞或经处理后成为单个分散的细胞接种于含 5 10nmol L 胰岛素、 20胎牛血清的 RPMI1640 液中或接种于含 20胎牛血清、 5 10nmolL胰岛素的低糖DMEM细胞培养基中， 置于37， 体积分数5CO2培养箱内， 细胞 贴壁培养约 3 4 天、 细胞形态为梭形、 小园形细胞不到 10、 贴壁细胞的汇合率达 75 85、 处于刚进入对数生长期时， 即考虑收集培养细胞， 先吸干净培养瓶中的培养液， 加入 1-2ml0.01的胶原酶 II 液或胰酶 ( 以消化液能覆盖整个瓶底为准 )， 静置 2-10min( 显微 镜下动态监测 )， 吸去胶原酶 II 液， 加入低糖 DME。
36、M 或 RPMI1640 培养液， 用吸管吸取瓶内培 养液， 反复吹打瓶壁细胞， 形成细胞悬液， 转入离心管离心沉淀， 去上清液， 细胞沉淀用上述 培养液清洗2次后， 制成悬液， 用作重组子导入。 pLXSNneo-hTERT重组子的导入 ： 方法1 ： 在上法分离所得细胞中， 选用脂质体转染法， 将上述 2105个细胞接种于 35mm 培养皿中， 在 37 CO2培养箱培养 24 36h， 使细胞生成单层、 形态为梭形、 尚未见或仅见少于 10小 园形细胞、 贴壁细胞的汇合率达 55 65、 处于将进入或刚进入对数生长期时， 转染重 组子pLXSNneo-hTERT， 在1.5ml微量离心管。
37、中制备下列溶液 ： 管A， 将pLXSNneo-hTERT重组 子溶于i00l无血清培养液中 ； 然后取管B， 将20l Lipofectamine溶于80l无血清培 养液中， 将管 A 和管 B 混匀， 室温下置 45min， 吸去细胞培养液后， 再用无血清培养液洗涤细 胞 2 次， 在 Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT 混合物中加入 1ml 无血清培养液， 轻轻混匀， 再 滴加至细胞培养皿内， 然后加入 1ml 无血清培养液， 在 CO2培养箱培养 10h， 吸出转染液， 加 4ml 完全培养液继续培养 16h， 弃去培养液， 更换浓度为 400mgL-1的 G41。
38、8 培养液继续培养， 8 10 天后选择单个细胞集落进行亚克隆， 扩大培养后再加大 G418 浓度到 800mgL-1， 将 能在高浓度的 6418 环境中稳定生长的克隆进行传代扩增。方法 2 ： 吸取 1 10-1 40 细 胞悬液， 配制成终浓度为1105/mL细胞悬液， 接种于培养瓶内， 选择低糖DMEM或RPMI1640 培养基， 其中含20mLL胎牛血清、 10nmolL胰岛素， 培养48h后， 使细胞生成单层、 细胞 形态为梭形、 尚未见或仅见少于 10小园形细胞、 贴壁细胞汇合率达 55 65、 处于将 进入或刚进入对数生长期时， 采用脂质体转染的方法， 将重组子 pLXSNne。
39、o-hTERT 转染至先 天性心脏病室间隔缺损细胞内， 用含 700mg L G418 的培养液筛选 1wk， 将 G418 浓度改为 300mg L， 至出现阳性克隆， 将其转移至新培养瓶进行扩大、 传代培养 ； 方法 3 ： 将上述的 细胞悬液以低糖 DMEM 或 RPMI1640 培养液配成 5108 L 终浓度的细胞悬液接种于 24 孔 培养板， 待细胞长至 90左右融合时用于转染， 将 0.2g 含量的重组子 pLXSNneo-hTERT， 用 DMEM 或 RPMI1640 调整体积为 50l， 室温放置 5min ； 脂质体 6l， 用 DMEM 调整体积为 50l， 室温放置 。
40、5min， 两种试剂轻轻混匀， 室温放置 20min， 将 24 孔板内的细胞用 DMEM 洗 3次， 每孔加培养液100l， 加Lipofectamine-pLXSNneo-hTERT混合液， 轻轻在细胞表面铺 均匀， 于37CO2培养箱放置6h， 随后用0.01gL胶原酶将细胞消化， 转入6孔板内， 加入 完全培养基， 次日加 G418 抗生素要使终浓度为 500mg L， 直到有单克隆细胞长出。约 10d 说 明 书 CN 104419675 A 8 6/8 页 9 后有单克隆细胞集落长出， 挑取并置于 24 孔板内继续培养， 以 300mg L 的 G418 维持并稳 定传代扩增培养。。
41、以此建立可在体外反复传代的先天性心脏病室间隔缺损细胞模型 ( 细胞 系 )。 0020 5、 pLXSNneo-hTERT 转染先天性心脏病室间隔缺损细胞模型的传代、 扩增 ： 收集上 述经脂质体转染法导入 pLXSNneo-hTERT 的阳性单克隆细胞集落， 以低糖 DMEM 或 RPMI1640 培养基配成约 1105 mL 的细胞悬液， 接种于数瓶 20 50cm2培养瓶中， 加入 5mL 含 20mL L 胎牛血清、 10nmol L 胰岛素的低糖 DMEM 或 RPMI1640 培养基， 至细胞贴壁生长、 汇合率达 80 85、 处于对数生长期的前期时收集细胞， 再按上述步骤传代培养。
42、， 如此反 复传代接种、 培养， 记录代数并观察细胞生长特点， 如图1， 细胞传代至第77代、 培养至第10 天时， 呈对数生长、 圆形、 梭形、 铺满瓶底， 其细胞生长汇合率达 83以上， 此后随着传代次 数的增加， 细胞生长变慢、 变稀疏。其中对数生长是指细胞生长速度快， 细胞数量的增加与 培养时间呈倍增关系， 通常按常规按种细胞进行培养时， 培养12天便可在显微镜下找到 生长的单个细胞 ； 4 5 天时可见细胞集落， 贴壁生长细胞铺盖培养瓶底的 1 3， 培养 7 13天时可见贴壁生长细胞铺盖培养瓶底的23以上， 甚至细胞重叠、 几乎不留空隙(汇合 率达95100)， 细胞光亮， 无颗粒。
43、、 无粗糙感等老化现象， 也可据细胞计数与培养时间的 关系来判断 ； 死亡的细胞少， 每周因死亡而漂浮的细胞少于 10 通过台盼蓝染色法鉴别 死细胞和活细胞， 因为正常的活细胞， 胞膜结构完整， 能够排斥， 使台盼蓝不能够进入胞内 ； 而丧失活性的细胞， 胞膜的通透性增加， 可被台盼蓝染成蓝色， 可判断为细胞已经死亡， 方 法是每周吸取一定量的细胞培养悬液， 与台盼蓝染色剂混合后置室温 5 10 分钟， 然后制 成细胞薄片， 在显微镜下计数 1000 个细胞总数， 计算着色的死细胞和不着色的活细胞的百 分比 。 0021 6、 先天性心脏病室间隔缺损细胞模型生物学特性的鉴定 ： 使用 pLXS。
44、Nneo-hTERT 建立细胞模型后， 鉴定的关键问题有 ： 一是要求该细胞具有持续的增殖能力 ； 二是要求其 形态、 基本生理功能等表型保持不变。观察细胞形态 ： 在倒置光学显微镜下每日观察细 胞是否呈典型的上皮细胞样贴壁生长， 是否呈梭形、 或小园形生长。 本细胞系传代扩增培养 的细胞形态与正常人成纤维细胞形态无明显差异 ； 观察细胞生长曲线 ： 取生长较好的转 染细胞， 采用0.25胰蛋白酶液消化， 制成细胞悬液， 经计数， 分别取1.4104细胞接种于30 个含 15FBS 低糖 DMEM 培养基培养瓶。每天取 2 瓶细胞进行计数， 计算均值， 连续观察直至 细胞数量明显下降， 培养3。
45、天后每隔2天给未计数的细胞换液， 采用同样方法观察转染细胞 在 hepato ZYME-SFM 无血清培养基中的生长情况。结果以培养时间为横轴， 细胞数量为纵 轴 ( 对数 )， 描绘在半对数座标上制成曲线后即成该细胞的生长曲线， 永生化细胞系呈典型 的 “S” 特征或 “穹隆” 形成 ； 检查染色体 ： 通过分析染色体核型， 如果染色体核型为二倍 体 “46， XX， ， 或 “46， XY” ， 或相同于本发明采集的原代细胞， 则说明该细胞系没有发生恶性 转化(同时可用流式细胞仪分析细胞系中是否出现异常的DNA群体， 如果没有， 也说明细胞 系未出现瘤性特征 )。染色体核型分析方法是 ： 。
46、在细胞生长密度达 85-95 ( 其中小园形 细胞占 10 )、 处于对数生长期的培养物中按 5mL 培养液中加入预热的 250ug ml 秋水仙 素 100ul， 混匀后置 37培养箱 4 小时， 吸干培养液， 加入预热的 2-3mL EDTA- 胰酶消化液， 37作用 5 分钟， 终止消化， 洗下贴壁细胞， 经离心、 低渗、 固定、 制片、 G 显带后分析染色体 核型 ； 软琼脂集落生长试验 ： 将细胞以5104ml接种于直径为35mm软琼脂平皿内， 观 说 明 书 CN 104419675 A 9 7/8 页 10 察三周后， 未发现克隆形成， 说明本实验的永生化细胞不能在软琼脂内形成克。
47、隆， 符合永生 化特点 ； 裸鼠致瘤试验 ： 将永生化细胞以3107接种裸鼠背部皮下， 2个月后， 4只裸鼠均 未见肿瘤形成， 证明此细胞为非恶化细胞 ； 转染细胞 hTERT mRNA 表达产物测定 ： 按试剂 盒做 PCR 扩增后电泳， 检出 hTERT mRNA 条带。如以免疫组织化学检测， hTERT 转染的细胞 核内染色可见大量棕色颗粒， 表明 hTERT 已整合入细胞内 ； 转染细胞端粒酶活性 ： 收集细 胞系， 按试剂盒说明制备裂解液， 作PCR扩增和电泳分析， 以302nm紫外光观察结果， 可见呈 端粒酶阳性条带。 流式细胞术检测 ： 检测第19代细胞系中合成、 分裂的细胞比例。
48、， 如果其 增殖能力明显比未建系的正常细胞增强， 说明是 hTERT 整合、 表达的结果 ； 另外以流式细胞 术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率， 本细胞系的细胞增殖指数较转染前后无明显改变， 转 染后细胞凋亡率较转染前明显降低。 0022 所以， 本发明的细胞模型为细胞在倒置光学显微镜下呈梭形或小园形的上皮 细胞样贴壁生长 ； 细胞的生长曲线如以培养时间为横轴， 细胞数量为纵轴， 在 hepato ZYME-SFM 无血清培养基中呈 “S” 特征或 “穹隆” 形成 ； 为先天性心脏病室间隔缺损细胞， 染色体核型为二倍体 “46， XX” 或 “46， XY” ， 或相同于本发明采集的原代细胞 ； 细胞不能在 软琼脂内生长 ( 形成克隆 ) ； 细胞为非恶化细胞， 裸鼠致瘤试验阴性 ； 细胞的 DNA 中整 合了 hTERT 基因， 表达 hTERT 基因的 mRNA 产物 ； 细胞传代至第 77 代、 培养至第 10 天时， 呈对数生长、 圆形、 梭形、 铺满瓶底， 其细胞生长汇合率达 83以上， 此后随着传代次数的增 加， 细胞生长变慢、 变稀疏 ； 用于在体外从细胞水平研究环境因素致先天性心脏病室间隔 缺损的发病机制、 研究对环境有害物的耐受性并作为遗传资源贮存。 0023 7、 hTERT 介导先天性心脏病室间隔。