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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410790236.X (22)申请日 2014.12.18 C12P 23/00(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/13(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 芝圣 （天津） 生物科技有限公司 地址 300385 天津市西青区大寺镇青凝侯村 (72)发明人 季延滨 李涛 (74)专利代理机构 天津诺德知识产权代理事务 所 ( 特殊普通合伙 ) 12213 代理人 龚晓芳 (54) 发明。
2、名称 一种海洋微藻叶黄素的提取工艺 (57) 摘要 本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工 艺， 通过基因工程技术对高产叶黄素海洋微藻进 行分子生物学改造得到优质叶黄素生产藻种， 采 用柱层析色谱分离纯化微藻中的叶黄素， 并利用 重结晶技术对叶黄素产品进行精制。本发明的有 益效果是劳动成本低， 不受时间、 空间的限制， 产 量高， 质量好， 安全环保， 产生良好的经济与社会 效益。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104450850 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104。
3、450850 A 1/2 页 2 1.一种海洋微藻叶黄素的提取工艺， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1) 采用叶绿素荧光成像系统， 快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻， 将初步筛选的待 定微藻进行扩大培养， 利用高效液相色谱 (HPLC) 准确分析藻细胞中叶黄素含量， 最终筛选 到叶黄素含量高的优质微藻。 (2) 对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序， 并利用生物信息学软件进行基因 功能注释与进化分析。 (3) 培养海洋微藻至对数生长期中期， 利用 RNA-seq 测序技术进行基因转录水平分析， 并根据各个基因表达水平的高低， 初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶， 初步构建 该藻细。
4、胞内叶黄素的合成途径。 (4) 构建高产叶黄素基因工程藻株， 提高叶黄素合成途径关键酶的活力， 从而提高叶黄 素的合成量。 (5) 提取海洋微藻细胞总 RNA， 利用逆转录 PCR 扩增 DXS1， GGPPS,PSY,LCYE 等酶的 cRNA， 将 PCR 产物连接到载体 pMD18-T， 进行测序验证。 (6) 构建表达载体并进行表达载体转化， 得到高产叶黄素基因工程藻。 (7) 将基因工程藻进行发酵培养， 使得小球藻叶黄素的合成量达到 8-10mg/Ml， 在水平 管式光合反应器中进行扩大培养， 确定培养液流动的速度， 光照强度， CO2通入量等参数。 (8) 采用复合酶进行酶法破壁，。
5、 再利用低渗缓冲溶液， 使细胞内容物膨胀， 然后用超声 波进行辅助破碎， 提高破壁效果。 (9)使用乙醇作为携带剂， 利用均匀设计优化萃取条件， 利用HPLC以及HPLC-MS检测与 鉴定提取物中叶黄素的含量， 并计算提取率。 (10) 采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化， 用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中的总 色素， 然后采用聚苯乙烯 - 二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及其它 类胡萝卜素， 确定正己烷 - 甲醇 - 水洗脱体系的溶剂配比， 并进行梯度洗脱， 收集叶黄素组 分， 最后利用重结晶技术进行精制， 得到叶黄素纯品， 检测含量并计算提取率。 2.根据权利要求 1 所述的。
6、海洋微藻叶黄素的提取工艺， 其特征在于 ： 步骤 (6) 中构建 表达载体的方法优选为 ： 设计引物， 添加限制性酶切位点 KpnI 和 ApaI， 利用 PCR 扩增表达载体 pHYG3 自带的 启动子 beta2-tubulin promoter， 酶切后将该启动子插入到表达载体 pHYG3 多克隆位点区 域 ； 设计特异性引物， 添加限制性酶切位点 ApaI 与 NdeI， 将逆转录 PCR 扩增到的 DXS1， GGPPS， PSY， LCYE 等酶的基因并插入到位于 beta2-tubulin promoter 之后的 pHYG3 载体的 多克隆位点处， 构建高表达载体。 3.根据权。
7、利要求 1 所述的海洋微藻叶黄素的提取工艺， 其特征在于 ： 步骤 (6) 中表达 载体转化的方法优选为 ： 将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞， 筛选抗潮霉素 B(hygromycin B) 阳性转化子， 培养 72h， 利用 RT-PCR 检测培养过程中 GGPPS,PSY 等基因表达量的变化， 同 时利用 Western blot 检测相关酶的含量变化 ； 将阳性转化子进行液体发酵培养， 检测阳性转化子中叶黄素含量， 得到高产叶黄素基 因工程藻。 权 利 要 求 书 CN 104450850 A 2 2/2 页 3 4.根据权利要求 1 所述的海洋微藻叶黄素的提取工艺， 其。
8、特征在于 ： 步骤 (8) 中复合 酶进行酶法破壁的方法优选为 ： 选用纤维素酶， 果胶酶， 半纤维素酶等进行复配， 对微藻细胞壁进行酶解， 通过显微镜 观察破壁效果。 权 利 要 求 书 CN 104450850 A 3 1/3 页 4 一种海洋微藻叶黄素的提取工艺 技术领域 0001 本发明属于叶黄素提取领域， 尤其是涉及一种海洋微藻叶黄素的提取工艺。 背景技术 0002 在现有的技术中， 海洋微藻叶黄素的提取工艺通常是采用光自养培养模式或者异 养培养模式， 较低的胞内叶黄素含量和叶黄素产率， 同时加上微藻大规模培养较高的成本， 制约了应用微藻培养来生产叶黄素的产业化进程。 发明内容 00。
9、03 为了克服上述现有技术的不足， 本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺， 劳 动成本低， 不受时间、 空间的限制， 产量高， 质量好， 安全环保， 产生良好的经济与社会效益。 0004 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是 ： 一种海洋微藻叶黄素的提取工 艺， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： 0005 (1) 采用叶绿素荧光成像系统， 快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻， 将初步筛选 的待定微藻进行扩大培养， 利用高效液相色谱 (HPLC) 准确分析藻细胞中叶黄素含量， 最终 筛选到叶黄素含量高的优质微藻。 0006 (2) 对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序， 并利用生物信。
10、息学软件进行 基因功能注释与进化分析。 0007 (3) 培养海洋微藻至对数生长期中期， 利用 RNA-seq 测序技术进行基因转录水平 分析， 并根据各个基因表达水平的高低， 初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶， 初步 构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。 0008 (4) 构建高产叶黄素基因工程藻株， 提高叶黄素合成途径关键酶的活力， 从而提高 叶黄素的合成量。 0009 (5) 提取海洋微藻细胞总 RNA， 利用逆转录 PCR 扩增 DXS1， GGPPS,PSY,LCYE 等酶的 cRNA， 将 PCR 产物连接到载体 pMD18-T， 进行测序验证。 0010 (6) 构建表达载体并。
11、进行表达载体转化， 得到高产叶黄素基因工程藻。 0011 (7) 将基因工程藻进行发酵培养， 使得小球藻叶黄素的合成量达到 8-10mg/Ml， 在 水平管式光合反应器中进行扩大培养， 确定培养液流动的速度， 光照强度， CO2通入量等参 数。 0012 (8) 采用复合酶进行酶法破壁， 再利用低渗缓冲溶液， 使细胞内容物膨胀， 然后用 超声波进行辅助破碎， 提高破壁效果。 0013 (9)使用乙醇作为携带剂， 利用均匀设计优化萃取条件， 利用HPLC以及HPLC-MS检 测与鉴定提取物中叶黄素的含量， 并计算提取率。 0014 (10) 采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化， 用丙酮提取破壁后。
12、的小球藻细胞中 的总色素， 然后采用聚苯乙烯 - 二乙烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及 其它类胡萝卜素， 确定正己烷 - 甲醇 - 水洗脱体系的溶剂配比， 并进行梯度洗脱， 收集叶黄 说 明 书 CN 104450850 A 4 2/3 页 5 素组分， 最后利用重结晶技术进行精制， 得到叶黄素纯品， 检测含量并计算提取率。 0015 步骤 (6) 中构建表达载体的方法优选为 ： 0016 设计引物， 添加限制性酶切位点 KpnI 和 ApaI， 利用 PCR 扩增表达载体 pHYG3 自带 的启动子 beta2-tubulin promoter， 酶切后将该启动子插入到表达载体。
13、 pHYG3 多克隆位点 区域 ； 0017 设计特异性引物， 添加限制性酶切位点 ApaI 与 NdeI， 将逆转录 PCR 扩增到的 DXS1， GGPPS， PSY， LCYE 等酶的基因并插入到位于 beta2-tubulin promoter 之后的 pHYG3 载体的多克隆位点处， 构建高表达载体。 0018 步骤 (6) 中表达载体转化的方法优选为 ： 0019 将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞， 筛选抗潮霉素 B(hygromycin B) 阳性转化子， 培养 72h， 利用 RT-PCR 检测培养过程中 GGPPS,PSY 等基因表 达量的变化， 同时利用 W。
14、estern blot 检测相关酶的含量变化 ； 0020 将阳性转化子进行液体发酵培养， 检测阳性转化子中叶黄素含量， 得到高产叶黄 素基因工程藻。 0021 步骤 (8) 中复合酶进行酶法破壁的方法优选为 ： 0022 选用纤维素酶， 果胶酶， 半纤维素酶等进行复配， 对微藻细胞壁进行酶解， 通过显 微镜观察破壁效果。 0023 本发明具有的优点和积极效果是 ： 通过基因工程技术对高产叶黄素海洋微藻进行 分子生物学改造得到优质叶黄素生产藻种， 采用柱层析色谱分离纯化微藻中的叶黄素， 并 利用重结晶技术对叶黄素产品进行精制， 劳动成本低， 不受时间、 空间的限制， 产量高， 质量 好， 安全。
15、环保， 为叶黄素类药品及保健品的生产提供绿色， 安全， 高质量的叶黄素原料， 产生 良好的经济与社会效益。 具体实施方式 0024 本发明公开一种海洋微藻叶黄素的提取工艺， 包括以下步骤 ： 0025 (1) 采用叶绿素荧光成像系统， 快速高通量筛选叶绿素荧光强的微藻， 将初步筛选 的待定微藻进行扩大培养， 利用高效液相色谱 (HPLC) 准确分析藻细胞中叶黄素含量， 最终 筛选到叶黄素含量高的优质微藻。 0026 (2) 对筛选的优质高产叶黄素微藻进行基因组测序， 并利用生物信息学软件进行 基因功能注释与进化分析。 0027 (3) 培养海洋微藻至对数生长期中期， 利用 RNA-seq 测序。
16、技术进行基因转录水平 分析， 并根据各个基因表达水平的高低， 初步筛选叶黄素合成途径中的限制性关键酶， 初步 构建该藻细胞内叶黄素的合成途径。 0028 (4) 构建高产叶黄素基因工程藻株， 提高叶黄素合成途径关键酶的活力， 从而提高 叶黄素的合成量。 0029 (5) 提取海洋微藻细胞总 RNA， 利用逆转录 PCR 扩增 DXS1， GGPPS,PSY,LCYE 等酶的 cRNA， 将 PCR 产物连接到载体 pMD18-T， 进行测序验证。 0030 (6) 构建表达载体并进行表达载体转化， 得到高产叶黄素基因工程藻。 0031 (7) 将基因工程藻进行发酵培养， 使得小球藻叶黄素的合成。
17、量达到 8-10mg/Ml， 在 说 明 书 CN 104450850 A 5 3/3 页 6 水平管式光合反应器中进行扩大培养， 确定培养液流动的速度， 光照强度， CO2通入量等参 数。 0032 (8) 采用复合酶进行酶法破壁， 再利用低渗缓冲溶液， 使细胞内容物膨胀， 然后用 超声波进行辅助破碎， 提高破壁效果。 0033 (9)使用乙醇作为携带剂， 利用均匀设计优化萃取条件， 利用HPLC以及HPLC-MS检 测与鉴定提取物中叶黄素的含量， 并计算提取率。 0034 (10) 采用柱层析色谱对叶黄素进行分离纯化， 用丙酮提取破壁后的小球藻细胞中 的总色素， 然后采用聚苯乙烯 - 二乙。
18、烯苯型反相树脂进行反相层析分离叶黄素与叶绿素及 其它类胡萝卜素， 确定正己烷 - 甲醇 - 水洗脱体系的溶剂配比， 并进行梯度洗脱， 收集叶黄 素组分， 最后利用重结晶技术进行精制， 得到叶黄素纯品， 检测含量并计算提取率。 0035 步骤 (6) 中构建表达载体的方法优选为 ： 0036 设计引物， 添加限制性酶切位点 KpnI 和 ApaI， 利用 PCR 扩增表达载体 pHYG3 自带 的启动子 beta2-tubulin promoter， 酶切后将该启动子插入到表达载体 pHYG3 多克隆位点 区域 ； 0037 设计特异性引物， 添加限制性酶切位点 ApaI 与 NdeI， 将逆转。
19、录 PCR 扩增到的 DXS1， GGPPS， PSY， LCYE 等酶的基因并插入到位于 beta2-tubulin promoter 之后的 pHYG3 载体的多克隆位点处， 构建高表达载体。 0038 步骤 (6) 中表达载体转化的方法优选为 ： 0039 将构建好的表达载体通过电转化方法转化到宿主藻细胞， 筛选抗潮霉素 B(hygromycin B) 阳性转化子， 培养 72h， 利用 RT-PCR 检测培养过程中 GGPPS,PSY 等基因表 达量的变化， 同时利用 Western blot 检测相关酶的含量变化 ； 0040 将阳性转化子进行液体发酵培养， 检测阳性转化子中叶黄素含量， 得到高产叶黄 素基因工程藻。 0041 步骤 (8) 中复合酶进行酶法破壁的方法优选为 ： 0042 选用纤维素酶， 果胶酶， 半纤维素酶等进行复配， 对微藻细胞壁进行酶解， 通过显 微镜观察破壁效果。 0043 以上对本发明的一个实施例进行了详细说明， 但所述内容仅为本发明的较佳实施 例， 不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进 等， 均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。 说 明 书 CN 104450850 A 6 。