血管紧张素转化酶抑制二肽.pdf

【课题】提供具有抑制血管紧张素转化酶的活性，由此示血压降低作用的有用的鲣节等来源的含有二肽的组合物。【解决手段】含有鱼肉性蛋白质来源的、具有血管紧张素转化酶抑制活性的二肽的组合物，其特征在于，含有选自下列的至少1种二肽和/或它们的酸加成盐：由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽等。

权利要求书
1.  含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、具有血管紧张素转化酶抑制活性的二肽的组合物，其特征在于，含有选自下列的至少1种二肽和/或它们的酸加成盐：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

2.  权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、及
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽。

3.  权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

4.  权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

5.  权利要求1所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、和/或
它们的酸加成盐。

6.  加工食品或特定保健用食品，其特征在于，含有权利要求1～5之任一项所述的组合物。

7.  医药组合物，其特征在于，含有权利要求1～5之任一项所述的组合物。

8.  权利要求7所述的医药组合物，其中上述医药组合物是降压剂组合物。

9.  含有选自下列的至少1种二肽及/或这些的酸加成盐的组合物的制造方法：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽，
其特征在于包括：
(1)用热水提取鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质，
(2)粉碎其热水提取节上残留的水不溶性蛋白质，将得到的粉碎物分散到水分而得到的该水不溶性蛋白质的粒子和蛋白酶在pH5.0～9.0的最适条件下，于40～60℃的温度反应，由此进行该水不溶性蛋白质的酶的水解，其后，使酶反应停止，然后从得到的含水的水解反应混合物除去水不溶性的粒子，由此，收得含疏水性－亲水性高分子－低分子肽及水溶性氨基酸的水溶液，
(3)将从该水溶液由疏水性树脂柱法得到的吸附级分再装载到超滤(分子量1000)而通过透过最终纯化。

10.  组合物，其由权利要求9所述的制造方法得到。

11.  权利要求10所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、及
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽。

12.  权利要求10所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

13.  权利要求10所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

14.  权利要求10所述的组合物，其特征在于，上述组合物含有：
由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、
由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、
由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、
由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、
由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、
由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、
由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、及
由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。

15.  加工食品或特定保健用食品，其含有权利要求10～14之中任一项所述的组合物。

16.  医药组合物，其含有权利要求10～14之中任一项所述的组合物。

17.  权利要求16所述的组合物，其中上述医药组合物是降压剂组合物。

说明书血管紧张素转化酶抑制二肽
【技术领域】
本发明涉及具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性，由此示血压降低作用的有用的15种二肽及含有其的肽组合物。得到本发明的二肽、及肽组合物的制法是将热水提取鱼肉性蛋白质、特别是鲣节时作为残渣残留的不溶性蛋白质由蛋白NY100(天野酶)酶水解而得到的二肽吸附到疏水性树脂之后，由含水醇脱离、再使透过超滤膜(分子量1000)，该强的ACE抑制活性级分可作为血管紧张素转化酶抑制剂及血压降低剂的有效成分利用。期待本发明的ACE抑制活性高的二肽及含有所述二肽的肽组合物对于高血压症的治疗或预防有用。
【背景技术】
高血压症是代表性的生活习惯病，在日本该患者数是包括预备军在内，有5490万人(厚生劳动省：2006年国民健康－营养调查结果)。另外，根据2012年的WHO的调查，报告世界人口的4分之一是高血压症或其预备军。高血压症自觉症状少，也被称为沉默杀手，已知引起脑出血、蛛网膜下出血、脑梗塞、心肌梗塞、心绞痛、肾硬化症等各种的并发症，对于高血压症的发症机制进行着各种各样的研究。
作为血压的调节系统，与升压相关的肾素－血管紧张素系统和与降压相关的激肽释放酶－激肽系统发挥重要的作用。在肾素－血管紧张素系统中，从肝脏分泌的血管紧张素原由在肾脏生产的肾素变成血管紧张素I，再者由血管紧张素转化酶(ACE)变换为血管紧张素II。此血管紧张素II使血管平滑肌收缩，使血压升高。另一方面，降压系统的激肽释放酶作用于激肽原而产生缓激肽。此缓激肽有扩张血管，降低血压的效果，ACE有分解此缓激肽的作用。如此，已知ACE由作为升压肽的血管紧张素II的产生和作为降压肽的缓激肽的灭活的两 个作用而与血压的升高相关。
从而，通过抑制此ACE的酶活性抑制血压的升高成为可能。作为此ACE抑制活性物质开发的作为脯氨酸衍生物的卡托普利(D-2-甲基-3-巯基丙酰-L-脯氨酸)或依那普利等被广泛用于高血压症的治疗。但是，制药的情况中，由服用确认作为副作用的干咳，在QOL方面有问题也是事实。另外，已知停药就反弹。
从而，有要从天然物调查有降压作用的成分，或者从天然物纯化，活用的动向。其中，最近报告，食品原料蛋白质的酶分解物的肽有ACE抑制活性。例如，对于明胶的胶原酶分解物(专利文献1)、酪蛋白的胰蛋白酶分解物(专利文献2、专利文献3及专利文献4)、沙丁鱼肌肉的胃蛋白酶分解物(专利文献5)、鲣节的嗜热菌蛋白酶分解物(专利文献6)、芝麻蛋白的嗜热菌蛋白酶分解物(专利文献7)、κ-酪蛋白的胃蛋白酶等的分解物(专利文献8)等有多数的报告。这些肽由于天然物来源的血管紧张素转化酶抑制剂从食品或食品原料得到，所以期待成为低毒性、且安全性高的降压剂。
微生物或各种食品中也发现ACE抑制物质，作为降压剂的实用化被探讨(非专利文献1)。
然后，对于有ACE抑制活性的肽的制造法也有几个报告(专利文献9、10、11、12、13、14、15)。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：特开昭52-148631号公报
专利文献2：特开昭58-109425号公报
专利文献3：特开昭61-36226号公报
专利文献4：特开昭61-36227号公报
专利文献5：特开平3-11097号公报
专利文献6：特开平4-144696号公报
专利文献7：特开平8-231588号公报
专利文献8：特开平8-269088号公报
专利文献9：特开平6-7188号公报
专利文献10：专利第2794094号公报
专利文献11：专利第2873318号公报
专利文献12：特开2006-347937号公报
专利文献13：特开2001-240600号公报
专利文献14：特开平6-298794号公报
专利文献15：特开2010-155788号公报
【非专利文献】
非专利文献1：末网邦男、发酵和工业、46卷(No.3)、179～182页(1988)
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
食品原料来源的有ACE抑制活性的肽在副作用、毒性等的安全性的方面问题少，能作为通常的食品摄取成为大的益处。
但是，上述的报告的肽的多种是其构成氨基酸数是5个以上的(专利文献1、2、3、4、5、8)。这些氨基酸残基数多的肽被摄取后，容易地被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的消化酶分解，它们的ACE抑制活性在活体中消失，或另外，在不分解时也因其分子结构大而难以吸收。
再者，对于ACE抑制肽组合物或其制法，在专利文献9中，从超滤膜(分子量3000～10000)透过液得到由低分子成分的逆渗透膜除去的级分的有血压降低作用的ACE抑制肽混合物，但以由盐、游离氨基酸的除去的抑制活性的升高作为目的，不至分级分离，明确不进行在逆渗透膜的具体性的成分肽的追迹。在专利文献10中，可从无花果来源的分子量10000以下的物质由柱层析分离纯化、得到作为目的的寡肽，但可合成制造，其单离方法终始，具体而言不至可从天然物产业上有效的工业生产，仅示超滤膜10000的纯化。专利文献11有是玉米醇溶蛋白或麸粉的嗜热菌蛋白酶水解物，由分子量是10000 以下的级分的含有量以固体成分基准是30％以上的凝胶过滤或超滤得到的方法，但未示分子量10000透过液中含的分子量1000以下的含有量是95％的根据。专利文献12中得到含有畜肉蛋白质来源的血压降低肽，将肌球蛋白、肌动蛋白用AMANOS等的酶水解的肽的组合物，但对于纯化而言，仅止于实验室规模，记载有单离肽的合成。其工业上大量生产只不过谈及了一般酶制备方法。另外，在抑制肽的纯化中使用树脂，但以结构确定作为其目的。专利文献13记载了将蛋白质的ACE抑制酶分解物使用平均细孔直径3nm以下的活性炭处理的方法，可不使ACE抑制活性降低而除去苦味或气味。不以抑制活性的升高作为目的。专利文献14提案使接触合成树脂而向非吸附级分除去苦味肽的方法，记载在非吸附级分上残留抑制活性。另一方面，在本发明中，在吸附级分确认高ACE抑制活性，在非吸附级分示ACE不抑制活性，再者可在超滤的透过液中得到消化抗性更优良的低分子的ACE抑制活性肽。
再者得到的ACE抑制活性肽可通过装载到HPLC，以一次的HPLC操作，纯化、单离、鉴定高抑制活性二肽。一般而言，在从酶分解物的肽的单离中，需要多次、5次左右的柱操作，因而被指烦琐，这证实，本发明的ACE抑制肽以很好的精度分级分离，提示不要的肽的存在少。再者，本发明的ACE抑制肽是ACE抑制活性高的肽的集合体，所以，示高的降压效果的效价。
从而，本发明的课题是提供，经口摄取时难以由消化酶分解，难失在体内的ACE抑制活性的，能直接小肠粘膜吸收的、有高ACE抑制活性的二肽和含有其的肽组合物。
再者，本发明提供含有一种以上上述的二肽的血管紧张素转化酶抑制剂或血压降低剂或饮食用组合物(饮食料或特定保健用食品)。
如上述一样，天然有机物及食品来源的血管紧张素转化酶抑制物质，由于具有对人体的安全性，因此重要性高，对于生活习惯病预防也是大的研究课题。
本发明为了解决此课题而进行，在食品原料中发现通过有效地抑 制血管紧张素转化酶来抑制血压升高的新颖且安全的物质，明确该抑制物质的结构的同时，开发在品质及价格方面适度的浓缩法，旨在提供含血管紧张素转化酶抑制物质的食品原料。
【解决课题的技术方案】
考虑将热水提取鲣节之后作为残渣残留的水不溶性蛋白质用作为蛋白酶的蛋白NY100(天野酶)水解而得到的生成分解物中是否存在解决上述问题的肽，探索是否该生成分解物之中含有氨基酸数是2个以下、且有ACE抑制活性的肽。
结果，在作为鲣节热水提取残渣的水不溶性蛋白质的由蛋白NY100(天野酶)的水解生成物中发现具有下述的氨基酸序列、并且有ACE抑制活性的5种二肽，成功单离这些二肽，从而完成本发明。
即，本发明提供是含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者，其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、具有血管紧张素转化酶抑制活性的二肽的组合物，且以含有选自由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽的至少1种二肽及/或它们的酸加成盐作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮 氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽及由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质来源的、由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及/或它们的酸加成盐作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有上述任一项中记载的组合物作为特征的加工食品或特定保健用食品。
另外，本发明涉及以含有上述任一项中记载的组合物作为特征的医药组合物、例如降压剂组合物。
本发明的别的发明涉及含有选自由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽的至少1种二肽及/或这些的酸加成盐的组合物的制造方法，其特征在于包括：
(1)用热水提取鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干、或者其他杂节的鱼肉性蛋白质，
(2)粉碎其热水提取节上残留的水不溶性蛋白质，将得到的粉碎物分散到水分而得到的该水不溶性蛋白质的粒子与蛋白酶在pH5.0～9.0的最适条件下，于40～60℃的温度反应，由此进行该水不溶性蛋白质的酶的水解，其后，使酶反应停止，然后从得到的含水的水解反应混合物除去水不溶性的粒子，由此，收得含疏水性－亲水性高分子－低分子肽及水溶性氨基酸的水溶液，
(3)使从该水溶液由疏水性树脂柱法得到的吸附级分再经历超滤(分子量1000)，通过透过最终纯化。
另外，本发明涉及以含有由上述制造方法得到的、由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽及由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有由上述制造方法得到的、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有由上述制造方法得到的、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明涉及以含有由上述制造方法得到的、由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽及由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽作为特征的组合物。
另外，本发明也涉及含有由上述制造方法得到的组合物的加工食品、特定保健用食品或医药组合物、例如降压剂组合物。
本发明人进行各种研究，作为其结果，推测鲣蛋白质之中存在血管紧张素转化酶抑制物质，于是判断，此鲣节蛋白质中的血管紧张素转化酶抑制物质是具有吸附到逆相分配系统树脂的性质的物质。再者，也知在超滤(分子量1000)膜透过液中得到具有消化抗性的高活性级分。此抑制物质被判断为，将以鲣节作为原料由热水提取得到的不溶性蛋白质残渣用蛋白酶、优选为，食品工业用的蛋白酶、特别是，蛋白NY100(天野酶)分解，使吸附到疏水性吸附树脂，由含水有机溶剂溶出，再者，由超滤膜(分子量1000)处理而以高收量得到ACE抑制透过级分，并且可简单地浓缩，然后，对得到的抑制物质中的各 成分，使用UPLC层析，单离ACE抑制活性强的成分，进行该成分的抑制活性值(IC50值)的测定及结构解析时，具有以此成分表示的氨基酸序列，并且是具具有血管紧张素转化酶抑制活性的二肽。
用于作为达成上述的目的的手段，提供以选自由色氨酸-亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由亮氨酸-色氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-异亮氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-酪氨酸的氨基酸序列组成的二肽、由色氨酸-天冬酰胺的氨基酸序列组成的二肽、由缬氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-酪氨酸的序列组成的二肽、由色氨酸-甲硫氨酸的序列组成的二肽、由甲硫氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由丝氨酸-色氨酸的序列组成的二肽、由天冬酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由谷氨酰胺-色氨酸的序列组成的二肽、由甘氨酸-色氨酸的序列组成的二肽或由丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽的血管紧张素转化酶抑制肽为主的血管紧张素转化酶抑制物质，另外，提供将鲣节热水提取残渣蛋白质用蛋白酶、例如，蛋白NY-100(天野酶)分解后，立即吸附到疏水性吸附树脂，用含水有机溶剂溶出，在超滤膜(分子量1000)透过液中有高的ACE抑制活性作为特征的血管紧张素转化酶抑制物质。一般而言，超滤膜处理要求数天，所以关于其使用，腐败的问题未被解决，现在也未见在食品的使用的例。作为课题，从降低温度，降低pH，设备费用、运行成本的问题、盐酸的使用导致的品质的问题未见明确的解决法。另外，有联用超滤膜(分子量10000)和逆渗透膜的，但不像本发明一样进行正确的分子量分级分离。改良这方面，通过用50％乙醇溶液进行疏水性树脂处理的脱离，提供除去无抑制活性的级分和游离氨基酸而使纯化第1阶段的ACE抑制活性升高，再者，接下来，在通过由醇存在下的超滤膜(分子量1000)处理工序的透过液中确认高活性成分，从无腐败的稳定的制造工序得到的ACE抑制肽。
疏水性吸附树脂即芳香族系修饰型树脂(例如，三菱化学制：SEPABEADS SP207)是向芳香环化学导入溴的芳香族系(苯乙烯-二 乙烯基苯系)合成吸附剂，其由于细孔表面的疏水吸附性强，从而认为对于亲水性高的有机物(疏水性低的物质)也发挥优良的吸附性能，也可用于氨基酸分离纯化、蛋白质除去、天然提取物纯化、发酵液预处理等。
本发明中使用的二肽可由鲣节热水提取残渣蛋白质的酶分解法、由有机化学合成方法阶段性地导入氨基酸的方法、利用水解酶的逆反应的肽合成法、基因工程学方法等制造。
对于由作为鲣节热水提取残渣的水不溶性蛋白质的酶分解法制造上述的二肽的方法进行说明。作为原料的鲣节蛋白质，对于使用对其再进行纯化的热水提取不溶性级分的情况进行说明。
作为作用酶，优选为，可举出食品工业用途的蛋白酶。例如，可举出蛋白NY100(天野酶)。其中，蛋白NY100(天野酶)是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)来源的，最适pH是7.0、最适温度是55℃。另一方面，底物浓度是只要在反应时可搅拌混合的范围内即可，优选在容易搅拌的蛋白质浓度2～30％(w/v)的范围内进行。添加量随效价而不同，但通常是每蛋白质0.01重量％以上、优选为0.1～10重量％是适当的。反应的pH、温度使用最适pH、最适温度附近即可，pH5.0～9.0、优选为5.0～7.5、温度40～60℃优选为45～55℃是适当的。反应中的pH的调节根据需要由氢氧化钠水溶液、盐酸等进行。
由于酶反应时间随酶的添加量、反应温度、反应pH而不同，不是恒定的，但通常是1～50小时左右。
酶分解反应的停止可根据由水解物的加热、pH的变化的酶的失活等公知的方法进行。接下来将水解液固液分离(例如离心分离、过滤等)，将分离液由超滤、凝胶过滤等分别，从而得到含有例如分子量是10000以下的级分的液。在此液中含有本发明的二肽，接下来再分别此液或其浓缩物(例如喷雾干)而可得到含有目的二肽的组合物。
本二肽的酸加成盐可由常规方法制造。例如可通过使本二肽(含碱性氨基酸残基的二肽)和相对于其1当量的适当的酸在水中反应， 冷冻干燥而得到。
含有本二肽或其酸加成盐的组合物有ACE抑制作用、进而血压降低作用，从而期待对于以人为首的哺乳动物的高血压症的治疗、预防有效。
含有本二肽或其酸加成盐的组合物直接，或者通常与至少1种制药辅助剂用于制药组合物。
含有本二肽或其酸加成盐的组合物非经口的(即，静脉注射、直肠施用等)或经口施用，可制剂为适宜于各施用方法的形态。
作为注射剂的制剂形态通常包含灭菌水溶液。上述形态的制剂另外可含有缓冲剂pH调节剂(磷酸氢钠、柠檬酸等)、张度剂(氯化钠、葡萄糖等)、保存剂(对羟基安息香酸甲酯、p-羟基安息香酸丙酯等)等的水以外的其他制药辅助剂。该制剂可由通过细菌保持滤器的过滤、向组合物的杀菌剂的混入、组合物的照射或加热灭菌。该制剂另外作为杀菌固体组合物制造，用时也可溶解于灭菌水等而使用。
经口施用剂制剂为适宜于由胃肠器官的吸收的形。锭剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂、粉末剂可包含常用的制药辅助剂、例如结合剂(糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基纤维素等)、赋形剂(乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨糖醇、甘氨酸等)、润滑剂(硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、氧化硅等)、崩解剂(马铃薯淀粉、羧甲基纤维素等)、湿润剂(月桂基硫酸钠等)。锭剂可由常规方法包被。经口液剂可为水溶液等，可为干产物。那样的经口液剂也可包含常用的添加剂，例如保存剂(p-羟基安息香酸甲基或丙基、山梨酸等)。
含有本ACE抑制剂的组合物或含有血压降低剂中的本二肽或其酸加成盐的组合物的量可变动，但通常是5～10％(w/w)、特别是10～60％(w/w)是适当的。本ACE抑制剂或血压降低剂的施用量是对于人施用时，作为有效成分0.01～50mg/kg/日是适当的。
另外，含有本二肽的组合物有即便大量地摄取，也不给活体恶影响的益处，从而直接，或者加各种的营养分等，或者含在食品中而也 可作为具有血压降低作用、高血压预防的功能的功能性食品、健康食品食。即，可作为例如加各种维生素类、矿物类等的营养分，例如营养饮料、豆浆、汤等的液状的食品或各种形状的固体食品、还有粉末状而直接或添加到各种食品而使用。作为功能性食品、健康食品的本ACE抑制剂或血压降低剂中的有效成分的含有量、摄取量可各自与上述制药中的含有量、施用量同样。
作为上述的二肽的有机化学合成法有液相法、固相法的2种，均可根据常规方法、例如泉屋信夫、加藤哲夫、青柳东彦及胁道典著、“肽合成的基础和实验”、丸善株式会社、1985、进行。在液相法中，例如，将应位于本二肽的C末端的氨基酸的羧基用苄基(Bzl)、t-丁基(t-Bu)等保护的氨基酸和应位于该C末端氨基酸的邻位的氨基酸的α-氨基用t-丁基氧基羰基(Boc)、苄基氧基羰基(Z)等保护的氨基酸溶解于二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺等，使它们在二环己基碳二亚胺(DCC)及1-羟基苯并三唑(HOBT)的存在下通常于室温反应一夜。接下来，将生成物的氨基保护基由常规方法除去之后的二肽衍生物，根据需要，使氨基与保护的第3氨基酸同样地反应，除去氨基保护基，根据需要重复相同的顺序而得到本二肽衍生物。在反应的氨基酸有羟基、胍基或咪唑基时，这些基团一般应先于上述反应进行保护。醇性羟基的保护基包含Bzl、t-Bu等、苯酚性羟基的保护基包含Bzl等、胍基的保护基包含甲苯磺酰基(Tos)等、咪唑基的保护基包含Tos等。最终反应结束后，除去全部的保护基而得到本二肽。这些的保护基的导入及除去可由常规方法进行。
另一方面，关于固相法，近年广泛使用使用肽合成仪的方法，例如可使用Applied Biosystems公司制的430A型肽合成仪制造本三肽。即，基本上，位于本二肽的C末端的氨基酸结合的苯基乙酰胺甲基(PAM)树脂L-Xaa-O-CH2-PAM(Xaa)自氨基酸残基(可从Applied Biosystems公司得到)的N侧，将用Boc保护氨基的α-氨基酸(Boc-氨基酸)由肽键和Boc的除去的重复阶段性地延长。Boc-氨基酸付于DCC的使用所致的以其对称的无水物作为中间体而经由的延长反应。 在上述Boc-氨基酸或L-Xaa-O-CH2-PAM中，在有与反应无关的反应性官能团时，一般应由适当的保护基保护。在使用430A型肽合成仪的合成系统中，除了氨基酸原料之外，使用以下的试剂及溶剂：N,N-二异丙基乙基胺(TFA中和剂)、TFA(Boc切断)、MeOH(生成尿素系化合物的溶解及除去)、HOBT(0.5M HOBT/DMF)、DCC(0.5M DCC/二氯甲烷(DCM)、DCM及DMF(溶剂)、中和剂(70％乙醇胺、29.5％甲醇)(废液的中和)。氨基酸原料及这些试剂及溶剂装填到指定的场所。肽合成仪自动地进行这些的使用。反应温度及时间的调节也自动地进行，但反应温度通常是室温。由上述顺序得到保护了二肽中的反应性基的二肽-O-CH2-PAM。上述固相肽合成的实际的操作由Applied Biosystems公司的430A型肽合成仪根据使用者手册进行。
得到的反应性官能团被保护的二肽-O-CH2-PAM由常规方法、例如上述“肽合成的基础和实验”或430A型肽合成仪使用者手册中记载的方法、例如，作为捕获由保护基的切断生成的阳离子的清除剂硫代苯甲醚及/或乙烷二巯基的存在下由TFA和三氟甲磺酸(TFMSA)(TFA是TFMSA的稀释剂)共处理，切断树脂及保护基，由此得到作为目的的二肽。
本发明的二肽也可如上所述由有机合成制造。但是，为了向经口摄取的食品或药品添加而发挥ACE抑制活性的目的，将鲣节等来源的蛋白质用蛋白NY100(天野酶)分解，还有，在单离纯化而得到时，优选制造为含上述15种二肽的至少一种的经口摄取可能的组合物。
作为原料，可使用鲣、鲣荒节、鲣枯节、宗田鲣、宗田鲣节、沙丁鱼、沙丁鱼节、竹荚鱼、竹荚鱼节、鲭、鲭节、煮干他杂节等的鱼肉、及它们的热水提取物残渣。
由蛋白NY100(天野酶)的分解而得到本发明的二肽时，对于原料鲣节蛋白质，首先作为预处理，优选进行由加热处理的氨基酸、水溶性蛋白质的除去。另外，为了使蛋白NY100(天野酶)酶分解变得有效率，优选将原料细细粉碎后在水中搅拌－悬浮。另外，虽然得到 的蛋白质是难溶性的，但为了酶反应加苛性钠至成最适的pH，使均一地分散－悬浮－溶解。向其加蛋白质每100g、0.1～10重量％的蛋白NY100(天野酶)，pH5.0～9.0、于40～55℃温度，经0.5～30小时、一边加搅拌操作，一边进行蛋白质分解之后，由加热处理(98℃、15分钟)，使酶的活性失活。由震动筛选器除去分解液后，未分解蛋白质由滗析器、德拉伐耳离心机、超高速离心机(15000旋转/分)或过滤处理(硅藻土过滤：Hyflo Super硅藻土等)等除未分解物、沉淀物，将得到的滤液使用苛性钠或盐酸中和后，浓缩。在如此得到的鲣节肽中各自含0.0005重量％～0.5重量％由丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸及丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。
作为含有本发明的二肽的组合物，得到上述的蛋白NY100(天野酶)酶分解物或可将其用再高度多孔聚合物树脂(疏水性吸附树脂)或离子交换树脂等处理而除去高分子的蛋白质或单体的氨基酸、再者盐类，通过超滤除去高分子肽，得到丰富地含有本发明的二肽的粗纯化品，可将其直接使用。以下，将这样的分解物及粗纯化物总称为富含二肽的组合物。
在由纯化得到含有本发明的肽的组合物时，将上述浓缩物由凝胶过滤柱层析、使用离子交换树脂或高度多孔聚合物树脂的层析、亲和性层析等，集合有ACE抑制活性的本发明的肽分级分离，再者，将此活性级分利用使用ODS柱等的逆相柱的高效液相层析等的通常的肽纯化法可纯化为大致纯粹的各肽。再有，本发明的二肽不限于鲣节及鲣节热水提取残渣物，除鲣、鲣热水提取残渣物、宗田鲣、宗田鲣节、宗田、宗田热水提取残渣物之外、也可从鱼肉蛋白质由上述所示的方法得到。二肽或丰富地含其的组合物的ACE抑制活性可用例如试验例1中记载的方法测定。
在由化学合成得到本发明的肽时，可由用于通常的肽合成的固相法或液相法之任何的方法合成。由合成得到的本发明的肽可用使用逆相高效液相层析、使用离子交换树脂或高度多孔聚合物树脂的层析、 亲和性层析等的通常的纯化法纯化。再者由超滤除去高分子肽，可得到ACE抑制活性的升高和有消化抗性的肽。
由于如此得到的二肽或丰富地含其的组合物的ACE抑制作用的比活性强，可作为极其有用的ACE抑制剂使用。再者从肠道的吸收也常对热比较稳定，所以也可应用于各种食物的形态及药品制剂之任何。
从而，在本发明中提供当添加配合一种以上上述二肽或含有其的组合物而成时的，可期待血管紧张素转化酶抑制作用的发挥的饮食用组合物(饮食料)。和/或提供含有一种以上上述二肽而成的血管紧张素转化酶抑制剂和血压降低剂。
含有本发明的二肽的组合物在食品、药品等中使用、配合时，可使用从鲣节热水提取残渣蛋白质的由蛋白NY100(天野酶)酶的分解物充分地纯化二肽，或者也可使用由化学合成得到的合成品。但是，本发明的肽由于稳定并且ACE抑制活性强，如上所述将粗纯化品或蛋白NY100(天野酶)酶分解物直接作为丰富地含二肽的组合物使用而可得到充分的ACE抑制活性。
本发明的饮食用组合物(饮食料)是，将含有上述二肽之一种以上的组合物作为二肽作为1次的摄取量添加0.001mg～100mg、优选为0.01mg～20mg而制造。本发明的肽组合物是容易处理、且稳定的固体-粉末，向水的溶解性也好。另外，从胃肠道的吸收也好。从而，向食品的添加的时期、及方法无特别的限制，作为粉末状、溶液状、悬浮液状等，在食品制造的原料阶段、中间工序、最终工序以食品领域惯用的方法添加是可能的。通过将含有本发明的二肽的饮食用组合物暂时性、断续性、继续性或日常摄取，抑制血管紧张素转化酶，例如血压降低作用是可能的。作为食品的形态，可举出固体状、半流动状、流动状等。作为固体状食品，可举出片状、片或胶囊等的锭剂、颗粒粉末等的形态之一般食品及健康食品。作为半流动状食品，糊状、胶状、凝胶状等的，另外，作为流动状食品，可举出汁、清凉饮料、茶饮料、饮料剂等的形态之一般食品及健康食品。将食物作为营养饮 料或调味料，通过继续摄取本发明的二肽，也可抑制血压的升高。
作为根据本发明的ACE抑制剂或降压剂的形的医药组合物以与上述饮食用组合物同样的量含有含有本发明的二肽的组合物。本发明的医药组合物，为了抑制患者的血管紧张素转化酶，例如发挥血压降低作用，也可暂时性地施用给高血压症状的患者，或者由于本发明的医药组合物的有效成分是天然物来源的，也可继续安全地使用。可由本发明的医药组合物治疗或预防高血压。医药组合物的形态优选锭剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆等的经口施用剂。作为非经口施用用的制剂，可举出用于通过静脉、动脉、皮下、肌肉施用的、或者用于从鼻腔吸入的无菌的液剂。液剂也可为用时可溶解的干燥固体。注射用制剂可使有效成分的二肽溶解于生理盐水，由通常的无菌操作制造成注射用制剂。
在本发明手段中，作为原料使用鲣节，由其热水提取处理，除去氨基酸及水溶性蛋白质，得到不溶性蛋白质残渣。将此鲣节热水提取残渣蛋白质由蛋白NY100(天野酶)酶进行酶分解处理。
接下来，将此酶分解后的液，在进行在使吸附能力有效率方面有效的，震动筛选器、德拉伐耳离心机、夏普勒斯离心机、硅藻土过滤处理之后，装载到填充疏水性吸附树脂的柱，流过其柱内而进行吸附。
吸附到疏水性吸附树脂的血管紧张素转化酶抑制物质使用含水乙醇等的含水有机溶剂溶出。
由此溶剂进行溶出时，也为了有效进行吸附的前述的抑制物质的由上述溶剂的溶出，在供给该溶剂之前，由水的供给，进行使溶解于水的物质溶出的处理是有效的。即，酶分解物水溶液优选为柱的约2～10倍容量，装载到柱之后，接下来，使通过柱的约2～10倍量的水。使非吸附级分全部溶出。再者，以乙醇50％浓度进行脱离，得到目的吸附级分。
由乙醇溶液溶出的含血管紧张素转化酶抑制物质的级分是，将其溶出液装载到超滤(分子量1000)，减压浓缩高抑制活性透过液级分，通过喷雾干燥(喷雾干)，以粉末的形态得到以粉剂的血管紧张素转 化酶抑制肽作为主体的食品原料的制品。
以此血管紧张素转化酶抑制肽为主的食品原料是将前述的溶出液，使用高效液相层析进行成分的单离，通过用乙腈－三氟醋酸等度溶出，纯化－单离为血管紧张素转化酶抑制活性强的成分而得到的形态。
【发明效果】
通过本发明，以经长的饮食经验而安全性被验证的食材的鲣节作为原料，由与蛋白NY100(天野酶)的反应，可得到具有血管紧张素转化酶抑制活性的15种二肽、及含有其中至少1种的组合物。另外也判断，可通过使酶分解物吸附到疏水性吸附树脂，用含水有机溶剂溶出来生产高活性的肽级分。再者，向超滤(分子量1000膜)通液循环，知得到具有消化抗性的高ACE抑制肽。再者，知在动物实验中以少量表达降压作用。得知含由本制法得到的二肽的鲣节肽是作为日常摄取的食品安全有效性高的原料，对于今后的高龄化社会也是非常地有意义的食品原料，也期待向特定保健用食品、功能性食品等的利用。本制法可在工业规模的功能性原料的生产上广泛的活用。
【附图说明】
【图1】是显示实施例7的本发明的肽组合物的对SHR的血压降低作用的坐标图。
【图2】是将显示图1的血压降低作用的坐标图经％变换之后的坐标图。
【图3】是显示实施例7的本发明的肽组合物的对SHR的收缩期血压的降低作用的坐标图。
【图4】是以心率显示实施例7的本发明的肽组合物的对SHR的血压降低作用的坐标图。
【实施方式】
【试验例1】
如以下一样进行ACE抑制活性测定。即，含有如上所述得到的本二肽及所述二肽的组合物的ACE抑制活性通过将Cheung和Cushman的方法(Biochemical Pharmacology，20,1637(1971))的缓冲液从磷酸缓冲液变为硼酸缓冲液的方法测定。
即，使LabbitLang丙酮粉末5g溶解于0.1M硼酸钠缓冲液(pH8.3)50ml，在40000G、40分钟的条件下离心分离，将该上清液再用羟基磷灰石纯化，得到1单位/mg蛋白质的血管紧张素转化酶液。或者，使用LabbitLang来源纯化ACE(Sigma公司、0.25单位)。
将本二肽组合物的各浓度的溶液0.030ml各自放入试管，接下来，加上述血管紧张素转化酶液0.1ml，于37℃反应5分钟。接下来，作为底物，添加马尿酰组氨酰亮氨酸(肽研究所、Bz-Gly-His-Leu·H2O、最终浓度5mM、含NaCl300mM)0.25ml，于37℃30分钟反应。其后，添加1N盐酸0.25ml而使反应停止之后，加1.5 ml的醋酸乙酯，用涡旋混合器搅拌20秒钟之后，进行离心分离(3000旋转、5分钟)，分取醋酸乙酯层1ml。加热105℃、30分钟(ALUMIBLOCK)后，溶解于蒸馏水3ml，测定在醋酸乙酯中提取的马尿酸的在228nm的吸收值，将其作为酶活性。
由下式算出抑制率。A：不含抑制剂时的228nm吸收值B：抑制剂添加的情况的228nm吸收值。另外将抑制率50％时的本二肽的浓度作为IC50值。抑制率＝[1-(A-a)/(B-b)]×100
A：添加样品
a：添加样品、代替酶添加缓冲液
B：代替样品添加蒸馏水
b：代替样品添加蒸馏水、代替酶添加缓冲液
【实施例1】
【(a)有ACE抑制活性的肽组合物的工业生产(1)】
向鲣节蛋白质1000kg加水10000L，加热处理(95℃、35分钟)后，除去氨基酸、水溶性蛋白质，向得到的热水提取残渣1153kg(蛋白质576kg)加水2884L，用6N苛性钠调节到pH7后，添加蛋白NY100 (天野酶)酶2.0wt％(每蛋白质酶量)，一边进行搅拌，一边于50℃反应20小时。反应后，加苛性钠将pH调节到6.8，于98℃加热15分钟而使酶失活。其后，将未分解蛋白质由震动筛选器、德拉伐耳离心机、离心机除去，将上清用硅藻土过滤、清澄化，得到分解液(蛋白质200kg)。ACE抑制活性IC50值是0.136mg/ml(蛋白质)。
将此肽200kg装载到疏水性层析。
接下来记疏水性层析的实施条件。
柱装载量：50kg
柱：SP-207(1000L容量柱；日本练水)
溶出液：0,50％浓度的乙醇溶液
流速：2000L/小时
循环：4个循环
从填充疏水性吸附树脂的柱的溶出是根据醇浓度进行2次分级分离，分取各8000L的2个级分。对各级分用试验例1的方法测定ACE抑制活性的结果，0％或50％乙醇溶出级分的ACE抑制活性值IC50各自未检测，是0.047 mg/ml。重复分取4个循环，得到蛋白质量74.9kg。
接下来，使由疏水性层析得到的ACE抑制活性级分(50％乙醇溶出级分)通过超滤膜(GE公司制模块7.9英寸×40英寸×2条、过滤面积48.4m2；分子量1000、压1.8MPa；型号GE8040F1002)，在非透过液得到20倍浓缩液。测定非透过液和透过液的ACE抑制活性，在透过液得到0.034mg/ml、在非透过液得到0.110mg/ml的值。
减压浓缩透过液，喷雾干燥，大量生产蛋白质量47.6kg的粉末。收支表示于表1。
【表1】工业生产中的每纯化过程的蛋白收支和ACE抑制比活性和全活性
工序收量(kg-蛋白质)ACE抑制活性(IC50)(μg-蛋白质/ml)回收率(％)分解液200136.25100树脂吸附液7447.42107树脂非吸附液125未检测0非透过液27110.2816.9透过液4733.6496.4
另外，为了确认经口摄取时的由活体内的消化酶的分解的程度，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、及胰凝乳蛋白酶对透过液及非透过液进行人工消化(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶4小时分解)。结果示于表2。
【表2】由透过液和非透过液的人工消化试验的液的ACE抑制活性值的变化

从透过液的ACE抑制活性示高的值，推定消化酶抗性的可能性。非透过液的ACE抑制活性(IC50)示1.6倍的强的值，但不及透过液的值。
在下述的条件(表3)进行由HPLC法的分子量的分析，结果示于表4。
【表3】HPLC法的分析条件
柱Superdex肽(直径10mm/长度300mm)移动相30％乙腈(0.1％TFA)流速0.5ml/分检测UV(214nm)
【表4】由HPLC法的各级分的分子量分级分离
 酶分解液树脂脱离非透过液树脂脱离透过液最大分子量500050001500分子量1000以下面积(％)66.7840.1279.75
结果，分解液和树脂脱离非透过液的最大分子量均为5000。
作为目的的树脂脱离透过液的最大分子量是1500，其中分子量 1000以下的比例是79.75％。
二肽的纯化中的回收率示于下表5～表7。
【表5】树脂吸附及超滤膜中的色氨酸-亮氨酸的纯化收支
 回收率(％)未回收(％)蛋白质收率(％)树脂处理100040超滤膜处理901063
由酶过滤液的树脂处理，蛋白质40％的收率，色氨酸-亮氨酸100％的回收率。
再者，由超滤膜处理，蛋白质63％的收率、浓缩液侧1/20倍的液量，色氨酸-亮氨酸的损失率是10％。从而，纯化蛋白质收率是25.2％、色氨酸-亮氨酸的回收率是90％。
【表6】树脂吸附及超滤膜中的缬氨酸-色氨酸的纯化收支
 回收率(％)未回收(％)蛋白质收率(％)树脂处理100039.98超滤膜处理901067.66
由酶过滤液的树脂处理，蛋白质39.98％的收率，缬氨酸-色氨酸100％的回收率。
再者，由超滤膜处理，蛋白质67.66％的收率、浓缩液侧1/20倍的液量，缬氨酸-色氨酸的损失率是10％。从而，纯化蛋白质收率是27.05％、缬氨酸-色氨酸的回收率是90％。
【表7】树脂吸附及超滤膜中的丙氨酸-色氨酸的纯化收支
 回收率(％)未回收(％)蛋白质收率(％)树脂处理100039.98超滤膜处理901067.66
由酶过滤液的树脂处理，蛋白质39.98％的收率，丙氨酸-色氨酸100％的回收率。
再者，由超滤膜处理，蛋白质67.66％的收率、浓缩液侧1/20倍的液量，丙氨酸-色氨酸的损失率是10％。从而，纯化蛋白质收率是 27.05％、丙氨酸-色氨酸的回收率是90％。
鲣节肽的大量生产的制造规模示于表8。
【表8】鲣节肽的工业生产的规模
生产量(kg)规模1规模2规模3日产60139278月产180417833年产2160500010000
结果，知规模1、2、3之任何中均可工业生产。
【(b-1)5种二肽的单离-1】
鲣节的蛋白NY100酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸的二肽。
鲣节的蛋白NY100酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的5％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸 发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，再者，进行移动相0.1％TFA中的1.25％CH3CN的再层析，进行级分的氨基酸分析及TOF MS解析，确证级分的肽是缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺二肽。
鲣节热水提取残渣的蛋白NY100(天野酶)，THERMOASE PC10F(大和化成)酶分解物中的单离的5种二肽的ACE抑制活性值示于表9。
【表9】单离的肽的ACE抑制活性值
 ACE抑制活性(IC50；μM)色氨酸-异亮氨酸33.05亮氨酸-色氨酸22.97色氨酸-亮氨酸25.14缬氨酸-酪氨酸11.02色氨酸-天冬酰胺580.2
【(b-2)5种二肽的单离-2】
鲣节的蛋白NY100酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是缬氨酸-色氨酸、色氨酸-酪氨酸、色氨酸 -甲硫氨酸、甲硫氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸。
使移动相的浓度变化，分取峰而确认上述得到的级分的进一步单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的10％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
HPLC分析的结果，知是95％以上的纯度。
鲣节热水提取残渣的蛋白NY100(天野酶)酶分解物中的单离的5种二肽的ACE抑制活性值示于表10。
【表10】单离的肽的ACE抑制活性值
 ACE抑制活性(IC50；μM)缬氨酸-色氨酸1.60色氨酸-酪氨酸57.00色氨酸-甲硫氨酸36.48甲硫氨酸-色氨酸3.80异亮氨酸-色氨酸2.00
【(b-3)5种二肽的单离-3】
鲣节的蛋白NY100酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分 各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是由丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸、丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。
鲣节热水提取残渣的蛋白NY100(天野酶)酶分解物中的单离的5种二肽的ACE抑制活性值示于表11。
【表11】单离的肽的ACE抑制活性值
 ACE抑制活性(IC50；μM)丝氨酸-色氨酸22.10天冬酰胺-色氨酸25.00谷氨酰胺-色氨酸32.60甘氨酸-色氨酸30.00丙氨酸-色氨酸10.00
如上所述，确认在实施例1中得到的组合物中含有表9～11中列举的二肽。
【实施例2】
【(a)有ACE抑制活性的肽组合物的工业生产】
向鲣节蛋白质1000kg加水10000L，加热处理(95℃、35分钟)后，除氨基酸、水溶性蛋白质，向得到的热水提取残渣1774kg(蛋白质886kg)加水4436L，用6N苛性钠调节到pH 7后，添加THERMOASE PC10F(大和化成)酶1.0wt％(每蛋白质酶量)，一边进行搅拌，一边于50℃反应17小时。反应后，加苛性钠将pH调节到6.8，于98℃加热15分钟而使酶失活。其后，将未分解蛋白质由震动筛选器、德拉伐耳离心机、离心机除去，将上清用硅藻土过滤，得到酶分解液(蛋白质200kg)。ACE抑制活性IC50值是0.204mg/ml(蛋白质)。
将此肽200kg装载到疏水性层析。
接下来记疏水性层析的实施条件。
柱装载量：50kg
柱：SP-207(1000L容量柱；日本练水)
溶出液：0,50％浓度的乙醇溶液
流速：2000L/小时
循环：4个循环
从填充疏水性吸附树脂的柱的溶出是根据醇浓度进行2次分级分离，分取各8000L的2个级分。对各级分用试验例1的方法测定ACE抑制活性的结果，0％或50％乙醇溶出级分的ACE抑制活性值IC50各自未检测，是0.071mg/ml。重复分取4个循环，得到蛋白质量74.0kg。
接下来，使由疏水性层析得到的ACE抑制活性级分(50％乙醇溶出级分)通过超滤膜(GE公司制模块7.9英寸×40英寸×2条、过滤面积48.4m2；分子量1000、压1.8MPa；型号GE8040F1002)，在非透过液得到20倍浓缩液。测定非透过液和透过液的ACE抑制活性，在透过液得到0.050mg/ml、在非透过液得到0.165mg/ml的值。
减压浓缩透过液，喷雾干燥，大量生产蛋白质量71.4kg的粉末。收支示于表12。
【表12】工业生产中的每纯化过程的蛋白收支和ACE抑制比活性和全活性
工序收量(kg-蛋白质)ACE抑制活性(IC50)(μg-蛋白质/ml)回收率(％)分解液200204.00100树脂吸附液7471.13106树脂非吸附液126未检测0非透过液25.9165.4216.0透过液48.150.4697.3
另外，为了确认经口摄取时的由活体内的消化酶的分解的程度，用胃蛋白酶、胰蛋白酶、及胰凝乳蛋白酶，对透过液及非透过液进行人工消化(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶4小时分解)。结果示于表13。
【表13】由透过液和非透过液的人工消化试验的液的ACE抑制活性值的变化

从透过液的ACE抑制活性示高的值，推定消化酶抗性的可能性。非透过液的ACE抑制活性(IC50)示1.5倍强的值，但不及透过液的值。
在下述的条件(表14)进行由HPLC法的分子量的分析，结果示于表15。
【表14】HPLC法的分析条件
柱Superdex肽(直径10mm/长度300mm)移动相30％乙腈(0.1％TFA)流速0.5ml/分检测UV(214nm)
【表15】由HPLC法的各级分的分子量分级分离
 酶分解液树脂脱离非透过液树脂脱离透过液最大分子量500050001500分子量1000以下面积(％)66.840.179.8
结果，酶分解液和树脂脱离非透过液的最大分子量均为5000。
作为目的的树脂脱离透过液的最大分子量是1500，其中分子量1000以下的比例是79.8％。
鲣节肽的大量生产的制造规模示于表16。
【表16】鲣节肽的工业生产的规模
生产量(kg)规模1规模2规模3日产61139278月产183417833年产2196500010000
结果，知规模1、2、3之任何均可工业生产。
【(b-1)5种二肽的单离-1】
鲣节的THERMOASE PC10F(大和化成)酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸的二肽。
鲣节的THERMOASE PC10F(大和化成)酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的5％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，再者，进行移动相0.1％TFA中的1.25％CH3CN的再层析，进行级分的氨基酸分析及TOF MS解析，确证级分的肽是缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺二肽。
【(b-2)5种二肽的单离-2】
鲣节的THERMOASE PC10F(大和化成)酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是由缬氨酸-色氨酸、色氨酸-酪氨酸、色氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。
【(b-3)5种二肽的单离-3】
鲣节的THERMOASE PC10F(大和化成)酶分解液的柱吸附后进行醇脱离级分的超滤膜透过液(鲣节肽)中的二肽的单离。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
在上述条件下，每30秒钟各分取1个级分。从各级分，减压下蒸发干燥后，作为ACE抑制活性测定用样品，根据上述的方法，测定ACE抑制活性。结果，在肽的级分确认强的ACE抑制活性。对级分各自进行冷冻干燥，得到微量的肽。对于级分，进行氨基酸分析及TOF MS解析，确证各级分的肽是由丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸、丙氨酸-色氨酸的序列组成的二肽。
【实施例3】
由合成法的肽的合成：
使用Applied Biosystems公司的肽自动合成机(ABI 430模型)，根据程序，自C端依次由BOC法延长肽链而进行目的保护肽树脂的合成。
向树脂上的肽的构建结束之后，干燥保护肽树脂。得到的保护肽的脱保护基和肽的从树脂载体的切离由无水氟化氢处理 (HF/p-Creso18：2 v/v、60分钟)进行。得到的粗肽由90％醋酸提取，由冷冻干燥作为粉末固体得到。再者，将得到的粗肽装载到使用ODS柱的高效液相层析仪而进行纯化，得到目的肽。
柱：YMC-Pack ODS-A(30mmID×250mmL、YMC)
移动层：缓冲液A：5％CH3CN、0.1％TFA
BuferB：40％CH3CN、0.1％TFA
梯度：0～10min：0％缓冲液B
10～90min：0～100％缓冲液B
流速：20ml/min
检测：UV220nm
纯化肽的纯度使用ODS柱的高效液相层析检验。
柱：Zorba×300SB-C18(4.6mmID×150mmL、Agilent Technologies)
移动层：缓冲液A：1％CH3CN、0.1％TFA
缓冲液B：60％CH3CN、0.1％TFA
梯度：0～25min：0～100％缓冲液B
流速：1ml/min
检测：UV220nm
【(i-1)色氨酸-亮氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-Leu(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-Trp2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到色氨酸-亮氨酸纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是94.06％。
【(i-2)亮氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-Trp(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-Leu2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到亮氨酸-色氨酸纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是88.84％。
【(i-3)色氨酸-异亮氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-Ile(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-Trp2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到色氨酸-异亮氨酸纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是95.00％。
【(i-4)缬氨酸-酪氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-Tyr(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-Val2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到缬氨酸-酪氨酸纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是95.00％。
【(i-5)色氨酸-天冬酰胺二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-Asn(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-Trp2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到色氨酸-天冬酰胺二肽纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是95.00％。
【(ii-1)缬氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-缬氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到缬氨酸-色氨酸的纯化物。
【(ii-2)色氨酸-酪氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-酪氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-色氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到色氨酸-酪氨酸的纯化物。
【(ii-3)色氨酸-甲硫氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-甲硫氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到甲硫氨酸-色氨酸的纯化物。用上述的方法测定纯化物的纯度的结果是95.00％。
【(ii-4)甲硫氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)， 使用氨基酸衍生物Boc-甲硫氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到色氨酸-甲硫氨酸的纯化物。
【(ii-5)异亮氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-异亮氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到异亮氨酸-色氨酸的纯化物。
【(iii-1)丝氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-丝氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到丝氨酸-色氨酸的纯化物。
【(iii-2)天冬酰胺-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-天冬酰胺2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到天冬酰胺-色氨酸的纯化物。
【(iii-3)谷氨酰胺-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-谷氨酰胺2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到谷氨酰胺-色氨酸的纯化物。
【(iii-4)甘氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-甘氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到甘氨酸-色氨酸的纯化物。
【(iii-5)丙氨酸-色氨酸的二肽的合成】
出始氨基酸树脂载体使用Boc-色氨酸(BrZ)树脂(0.5mmol)，使用氨基酸衍生物Boc-丙氨酸2mM延伸肽链。用上述的方法进行纯化，得到丙氨酸-色氨酸的纯化物。
【实施例4-1】
使用实施例1(b-1)中得到的二肽单离体，制造下述的组成的出 汁饮料。
【(a)原料及配合量】
鲣节热水提取液(面露)500ml和在实施例1(b-1)单离的5种二肽的混合品(色氨酸-亮氨酸的二肽43mg、亮氨酸-色氨酸的二肽的30mg、色氨酸-异亮氨酸e的二肽16mg、缬氨酸-酪氨酸的二肽36mg、色氨酸-天冬酰胺的二肽40mg)。
【(b)制造方法】
鲣节的热水提取(95℃、35分钟开)后，进行硅藻土过滤，将该滤液冷却到常温。向得到的冷却后的提取液，加上述5种二肽的混合物而搅拌、使溶解。由此制造出汁饮料。
【实施例4-2】
使用实施例1(b-2)中得到的二肽的单离体，制造下述的组成的出汁饮料。
【(a)原料及配合量】
鲣节热水提取液(面露)500ml和在实施例1(b-2)单离的5种二肽的混合品(缬氨酸-色氨酸的二肽58.89mg、色氨酸-酪氨酸的二肽的13.40mg、色氨酸-甲硫氨酸的20.00mg、甲硫氨酸-色氨酸的二肽13.16mg、异亮氨酸-色氨酸的二肽39.20mg)。
【(b)制造方法】
鲣节的热水提取(95℃、35分钟开)后，进行硅藻土过滤，将该分解液冷却到常温。向得到的冷却后的提取液，加上述5种二肽的混合物而搅拌、使溶解。由此制造出汁饮料。
【实施例4-3】
使用实施例1(b-3)中得到的二肽的单离体，制造下述的组成的出汁饮料。
【(a)原料及配合量】
鲣节热水提取液(面露)500ml和在实施例1(b-3)单离的5种二肽的混合品(丝氨酸-色氨酸的二肽19.10mg、天冬酰胺-色氨酸的二 肽的23.30mg、谷氨酰胺-色氨酸的31.72mg、甘氨酸-色氨酸的二肽86.30mg、丙氨酸-色氨酸的二肽55.68mg)。
【(b)制造方法】
鲣节的热水提取(95℃、35分钟开)后，进行硅藻土过滤，将该分解液冷却到常温。向得到的冷却后的提取液，加上述5种二肽的混合物而搅拌、使溶解。由此制造出汁饮料。
【实施例5】
【(a)从将鲣节蛋白质热水提取残渣用蛋白NY100酶分解的反应混合物的二肽的定量】
向鲣节蛋白质160g加水2000ml，进行热水提取(95℃、35分钟)。向得到的残渣(不溶性蛋白质)加10倍量水后，调节到pH7，使蛋白NY100(天野酶)酶于50℃反应20小时，调节到pH6.8，加热(98℃、15分钟)后，进行震动筛选器、滗析器、德拉伐耳离心机、夏普勒斯离心机处理、硅藻土过滤，进行减压浓缩、喷雾干燥。
将上述的粉末装载到疏水性层析仪，水250ml溶出后，在50％乙醇250ml溶出得到高活性的级分。再者，在超滤(分子量1000膜)的透过级分的减压浓缩(固体40％)液后，使经历喷雾干燥(入口温度150～200℃、出口温度50～90℃)，得500mg高活性的粉末品。
以上述粉末品(鲣节肽)作为原料使用，得到配合这的500mg的功能性食品。作为加工食品也在饮料、锭剂、汤等中使用。配合鲣节肽的食品原料的配合比例示于表17。
【表17】配合鲣节肽的加工食品(锭果)的配合例
原材料名配合量(kg)鲣节肽50甜味料10甜菊糖5酸味料100麦芽糖糊精500香料50
对于鲣节肽的锭果－锭剂－胶囊制造，鲣节肽、食品原料计量后， 混合－造粒－打锭－包被工序后，测定ACE抑制活性、二肽量而制品化规格品。
【实施例6-1】
如以下一样进行色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸、缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺的定量。即，从粉末品或其加工品如以下一样实施本二肽的定量。
【Sep-Pak C18预处理】
将鲣节提取残渣酶分解物、及其加工食品各自秤量25mg、加工食品5g，装载到Sep-Pak C18筒，除去水溶性级分后，将吸附级分用50％乙醇溶液溶出的液作为样品。
Sep-Pak C18处理，将从如上述一样得到的样品回收的ACE抑制纯化肽8000μg溶解于100μl的纯化水，2000μg/25μl装载到使用C-18柱的高效液相层析仪，将肽分级分离。接下来记条件。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
将合成品的色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸作为标准品装载1μg/μl。色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸的溶出时间各自是28.61、20.65、20.32分钟。
定量的结果，色氨酸-亮氨酸、亮氨酸-色氨酸、色氨酸-异亮氨酸的含量是在鲣节肽中各自含43mg、30mg、16mg。
将合成品的缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺作为标准品1μg/μl，在下述的柱条件下装载。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的5％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺的溶出时间是9.56分钟。再者在下述的条件下再进行层析。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的1.25％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺的溶出时的时间各自是35.60分钟、28.92分钟。
从自鲣节肽单离的二肽和标准品的峰面积算出定量值。
定量的结果，缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-天冬酰胺的含量是在鲣节肽中含36mg、40mg。
【实施例6-2】
如以下一样进行缬氨酸-色氨酸、色氨酸-酪氨酸、色氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸的定量。即，从粉末品或其加工品，如以下一样实施本二肽的定量。
【Sep-Pak C18预处理】
将鲣节提取残渣酶分解物、及其加工食品各自秤量25mg、加工食品5g，装载到Sep-Pak C18筒，除去水溶性级分后，将吸附级分用50％乙醇溶液溶出的液作为样品。
Sep-Pak C18处理，将从如上述一样得到的样品回收的ACE抑制纯化肽8000μg溶解于100μL的纯化水，2000μg/25μL装载到使用C-18柱的高效液相层析仪，将肽分级分离。接下来记条件。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
将合成品的缬氨酸-色氨酸、色氨酸-酪氨酸、色氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸作为标准品装载1μg/μL。缬氨酸-色氨酸、色氨酸-酪氨酸、色氨酸-甲硫氨酸、甲硫氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸的溶出时间各自是10.52、11.21、13.84、15.57、16.82分钟。
定量的结果如下表18所示。
【表18】鲣节肽中的本发明的二肽量
 定量值(mg/100g鲣节肽)缬氨酸-色氨酸58.89色氨酸-酪氨酸13.40色氨酸-甲硫氨酸20.00甲硫氨酸-色氨酸13.16异亮氨酸-色氨酸39.20
【实施例6-3】
如以下一样进行丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸、丙氨酸-色氨酸的定量。即，从粉末品或其加工品，如以下一样实施本二肽的定量。
【Sep-Pak C18预处理】
将鲣节提取残渣酶分解物、及其加工食品各自秤量25mg、加工食品5g，装载到Sep-Pak C18筒，除去水溶性级分后，将吸附级分用50％乙醇溶液溶出的液作为样品。
Sep-Pak C18处理，将从如上述一样得到的样品回收的ACE抑制纯化肽8000μg溶解于100μL的纯化水，2000μg/25μL装载到使用C-18柱的高效液相层析仪，将肽分级分离。接下来记条件。
柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1mmID×100mmL、1.7μm)
移动层：0.1％TFA中的15％CH3CN
流速：0.2ml/min
温度：40℃
检测：UV 200-300nm
将合成品的丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸、丙氨酸-色氨酸的标准品装载1μg/μL。丝氨酸-色氨酸、天冬酰胺-色氨酸、谷氨酰胺-色氨酸、甘氨酸-色氨酸、丙氨酸-色氨酸的溶出时间各自是8.12、8.28、8.38、8.75、8.92分钟。
定量的结果如下表19所示。
【表19】鲣节肽中的本发明的二肽量
 定量值(mg/100g鲣节肽)丝氨酸-色氨酸19.10天冬酰胺-色氨酸23.30谷氨酰胺-色氨酸31.72甘氨酸-色氨酸86.30丙氨酸-色氨酸55.68
【实施例7】
【ACE抑制肽的工厂制造】
将鲣节蛋白质21.9kg于95℃热水提取35分钟，将可溶性蛋白质5.5kg用于出汁(面露)。将作为副产物得到的作为鲣节热水提取残渣的水不溶性蛋白质16.4kg作为原料使用，加水、调节到pH7，将其于50℃由蛋白NY100(天野酶)酶分解20小时。将酶分解反应混合物筛选(100网目)、德拉伐耳离心机(3层连续排出离心机)、夏普勒斯离心机(超离心机15000旋转/分)、硅藻土过滤(Hyflo Super硅藻土：Hyflo Super硅藻土0.4％)后，得到过滤液。通过将此过滤液喷雾干燥(喷雾干燥机、入口温度150～200℃、出口温度90℃以下)，可得到粉末品(10kg)。另外，对于此粉末品而言，血管紧张素转化酶抑制活性的IC50是136.25μg/ml。
使上述的过滤液(蛋白质10kg)溶解于600L的水，填充疏水性吸附树脂(SEPABEADS SP-207、三菱化学)而装载到预先用水平衡化的柱进行吸附，接下来用600L的水溶出之后， 用50％乙醇液600L进行溶出。
其中使用的疏水性吸附树脂使用苯乙烯-二乙烯基苯系统树脂，但逆相分配系统树脂是，除了十八烷基氧化硅(株式会社YMC)之外、也可使用任何逆相分配系统树脂、疏水性吸附树脂。另外，溶出中使用乙醇不限于此。
再者，使上述得到的50％乙醇溶出级分通过超滤膜(GE公司制模块2.4英寸×40英寸×2条、过滤面积5m2；分子量1000膜；型号2540F1072)，将透过液减压浓缩(固体量40％)、喷雾干(喷雾干燥机)，得到鲣节肽。
在50％乙醇溶出级分确认高活性，因此认为血管紧张素转化酶抑制肽有吸附到疏水性吸附树脂的性质。另外，在超滤分子量1000膜透过液确认高的活性，在非透过级分的人工消化液示活性的升高，推定在例分子肽中存在活性强的肽。根据上述进行纯化，在本发明中，由柱层析和超滤处理可以工业生产规模高收量、有效得到血管紧张素转化酶抑制活性高的物质。
【实施例8】
【鲣节肽的动物实验静脉注射试验】
将雄大鼠(SHR/Izm)由氨基甲酸酯·α-氯醛糖(1g/kg、50mg/kg)混合液的腹腔内施用麻醉，背位固定。血压经与插入右大腿动脉的套管连接的压变换器(P23×L、Spectramed公司)及血压计(2238、日本电三荣株式会社)记录。心率通过由血压脉波驱动瞬时型计数单位(1321、日本电三荣株式会社)来测定。这些参数记录到书写记录计(RECTI-HORIZ-8K、日本电三荣株式会社)。由左大腿静脉持续注入日本药局方生理食盐液(大塚制药工场株式会社)，由该部位使用微注射器施用试验物质。试验物质使用实施例7中得到的鲣节肽。
【表20】各组的构成及施用量单次施用的情况：名组3例
试验组施用量(mg/kg)浓度(mg/ml)施用容量(ml/kg)动物数低用量0.11.00.13中用量0.33.00.13高用量1.010.00.13
结果，由鲣节肽0.1、0.3、1.0mg/kg的静脉注射，确认降压降低(表21、表22、表23)。
【表21】使用实施例7的鲣节肽的SHR的麻醉下静脉内施用中的血压降低作用(0.1mg/kg的静脉注射)

【表22】使用实施例7的鲣节肽的SHR的麻醉下静脉内施用中的血压降低作用(0.3mg/kg的静脉注射)

【表23】使用实施例7的鲣节肽的SHR的麻醉下静脉内施用中的血压降低作用(1.0mg/kg的静脉注射)

【实施例9】
鲣节肽的动物实验经口施用试验-1
动物：SHR/Izm
例数：32只
测定项目：血压(收缩期血压)及心率
测定时间：在施用前、施用后2、4、6、8及24小时测定。
测定方法：由尾套法(大鼠－小鼠用血压计、MK-2000、室町机械株式会社)，非见血地测定。进行每回5次的测量，血压采用除去其中的最低及最高值的3次的平均值。心率采用所采用的血压测定时的心率的平均值。
测定时、由于大鼠乱闹等而测出异常值时，则该测定数据不包括在测定次数内，进行追加测定。
【表24】各组的构成及施用量
试验组施用量(mg/kg)浓度(mg/ml)施用容量(ml/kg)动物数溶剂对照组1)00108低用量10.1108中用量30.3108高用量101108
1)：施用注射用水。
结果，由实施例7的鲣节肽(样品C)1、3、10mg/kg的施用确认降压作用(图1、图2)。
【鲣节肽的动物实验经口施用试验-2】
动物：SHR/Izm
例数：24只
测定项目：血压(收缩期血压)及心率
测定时间：在施用前、施用后2、4、6、8及24小时测定。
测定方法：尾套法(由大鼠－小鼠用血压计、MK-2000、室町机械株式会社)，非见血地测定。采用3次的平均值。心率采用所采用的血压测定时的心率的平均值。各组的构成及施用量如表25所示。
【表25】各组的构成及施用量
试验组施用量(mg/kg)浓度(mg/ml)施用容量(ml/kg)动物数溶剂对照组1)00108低用量0.30.03108中用量10.1108
1)：施用注射用水。
结果，由实施例7的鲣节肽0.3、1mg/kg的施用确认降压作用(图3、4、以及表26、27及28)。
【表26】使用NY100的自然发症高血压大鼠的降压作用
个体别数据1
试验编号：SR11307
血压-心率测定值
动物种-性别：大鼠/SHR/Izm-♂
试验组：介质对照组

【表27】使用NY100的自然发症高血压大鼠的降压作用
个体别数据2
试验编号：SR11307
血压-心率测定值
动物种-性别：大鼠/SHR/Izm-♂
试验组：NY100-0.3组

【表28】使用NY100的自然发症高血压大鼠的降压作用
个体别数据3
试验编号：SR11307
血压-心率测定值
动物种-性别：大鼠/SHR/Izm-♂
试验组：NY100-1.0组

*：与介质对照组的显著差异p≤0.05(Tukey-Kramer的检验)
【比较例】
除了不进行超滤之外，与实施例1同样，得到酶分解物、将其作为比较例。
【试验例2：与比较例对比本发明的组合物的显著性】
在作为本发明的组合物的由实施例1中的超滤得到的透过液与比较例之间，进行ACE抑制活性、及对由对SHR的单次施用试验的血压的降压度的对比试验。结果示于下述表29。
【表29】实施例1的透过级分(本发明的组合物)和比较例(对照)的ACE抑制活性及向SHR的单次施用降压作用比较

*与对照组的显著差异p≤0.05(Tukey-Kramer的检验)
本发明的鲣节肽中存在的二肽的抑制活性值和其他二肽的抑制活性值的比较例示于下表30。
【表30】由本法得到的二肽和其他肽的ACE抑制活性比较值
 ACE抑制活性IC50(μM)本发明二肽 色氨酸-异亮氨酸33.05亮氨酸-色氨酸22.97色氨酸-亮氨酸25.14缬氨酸-酪氨酸11.02色氨酸-天冬酰胺580.2缬氨酸-色氨酸1.60色氨酸-酪氨酸57.00色氨酸-甲硫氨酸36.48甲硫氨酸-色氨酸3.80异亮氨酸-色氨酸2.00丝氨酸-色氨酸22.10天冬酰胺-色氨酸25.00谷氨酰胺-色氨酸32.60甘氨酸-色氨酸30.00丙氨酸-色氨酸10.00  二肽(非本发明的) 脯氨酸-甘氨酸17000异亮氨酸-苯丙氨酸930缬氨酸-脯氨酸420甘氨酸-天冬氨酸9200
本发明的组合物中含有的二肽，总的来说，相比不包含在本发明的二肽ACE抑制活性值更高。在其中也是，缬氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸及甲硫氨酸-色氨酸与其他二肽比较示特别高的值。
分析本发明的肽的鲣节肽中的贡献率，示下表31的结果。
【表31】由本法得到的二肽的鲣节肽中的贡献率(％)
 贡献率(％)缬氨酸-色氨酸4.031异亮氨酸-色氨酸2.040甲硫氨酸-色氨酸0.343色氨酸-酪氨酸0.021色氨酸-甲硫氨酸0.054丝氨酸-色氨酸0.099天冬酰胺-色氨酸0.099谷氨酰胺-色氨酸0.048甘氨酸-色氨酸0.366丙氨酸-色氨酸0.672
鲣节肽中的贡献率是，由缬氨酸-色氨酸、异亮氨酸-色氨酸及丙氨酸-色氨酸示高的值，并且也证实鲣节肽被纯化。