一种和癌症有关的组蛋白去甲基化酶及其应用.pdf

本发明公开了一种JARID1蛋白(包括JARID1A，JARID1B，JARID1C和JARID1D)的用途，用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物；用于制备调控雄激素受体的转录活性的制剂；或用于制备检测癌症或雄激素受体的试剂盒；或用于设计和制备癌症治疗药物。本发明首次揭示JARID1蛋白是一种去甲基化酶，可去除三甲基化、二甲基化或单甲基化H3K4上的甲基，并且与癌症密切相关。

权利要求书
1.   一种JARID1蛋白或其活性片段或活性衍生物的用途，其特征在于，用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。

2.   如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的JARID1蛋白选自：JARID1A蛋白，JARID1B蛋白，JARID1C蛋白，或JARID1D蛋白。

3.   如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的去甲基化酶去除甲基化的组蛋白亚基3第4位赖氨酸上的甲基。

4.   如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的甲基化的组蛋白亚基3第4位赖氨酸上含有1个、2个或3个甲基。

5.   如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的组蛋白亚基3第4位赖氨酸的甲基化导致基因的转录异常。

6.   如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的JARID1蛋白的活性片段或活性衍生物包含JARID1的JmjC结构域，Arid结构域，JmjN结构域，锌指结构域，和PHD结构域。

7.   如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的制剂组合物中还包括：抗坏血酸维生素C，α酮戊二酸，和二价铁离子。

8.   一种去甲基化酶制剂组合物，其特征在于，所述组合物含有：
(a)有效量的JARID1蛋白；
(b)有效量的抗坏血酸维生素C，α酮戊二酸，和二价铁离子；和
(c)生物学上相容的载体。

9.   一种JARID1蛋白及其活性片段或活性衍生物、或它们的激动剂或拮抗剂的用途，其特征在于，
用于制备调控雄激素受体的转录活性的制剂；或用于制备预防或治疗癌症的药物。

10.   一种JARID1蛋白的用途，其特征在于，用于制备检测癌症的制剂或试剂盒。

说明书一种和癌症有关的组蛋白去甲基化酶及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体的，本发明涉及一种癌症相关的组蛋白去甲基化酶及其应用。
背景技术
在真核细胞的细胞核中，核小体是染色质的主要结构元件。核小体主要由四种组蛋白(H2A，H2B，H3和H4)构成。这四种组蛋白和缠绕于组蛋白的DNA共同组成了核小体。每个组蛋白都有进化上保守的N端拖尾伸出核小体外。这些拖尾是许多信号传导通路的靶位点，从而导致转录后修饰。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化等过程。尤其是组蛋白乙酰化、甲基化修饰能为相关调控蛋白提供其在组蛋白上的附着位点，改变染色质结构和活性。一般来说，组蛋白乙酰化能选择性的使某些染色质区域的结构从紧密变得松散，开放某些基因的转录，增强其表达水平。而组蛋白甲基化既可抑制也可增强基因表达。
组蛋白作为DNA缠绕成蛋白不可缺少的一个部分，同时也对基因的表达起到一种调控作用。组蛋白可以被甲基化和去甲基化。组蛋白的甲基化在调控染色体动态结构以及其转录功能上起到了重要的作用。组蛋白H3的K4、K9、K27、K36、K79和H4的K20均可被甲基化。组蛋白H3第9位赖氨酸的甲基化与基因的失活相关连；组蛋白H3第4位赖氨酸和第36位氨基酸的甲基化与基因的转录异常相关连；组蛋白H3第27位赖氨酸的甲基化与同源盒基因沉默、X染色体失活、基因印记等基因沉默现象有关；组蛋白H3第79位赖氨酸的甲基化与防止基因失活和DNA修复有关。与此同时，组蛋白的去甲基化也受到广泛的关注。
组蛋白的甲基化常发生在精氨酸的胍基或是赖氨酸的ε氨基上。每个赖氨酸有3种不同的甲基化状态，即一个甲基(一甲基)，两个甲基(二甲基)或三个甲基(三甲基)通过化学价偶联到赖氨酸侧链上的ε氨基团上，精氨酸可以被一甲基化或二甲基化。一直以来组蛋白的甲基化被认为是一种稳定的修饰，但是近来的研究证明并非如此。
直至现在，所有发现的去甲基化酶都是赖氨酸特异的且只能去除特异赖氨酸的单个甲基或两个甲基(见表1)，人们不知是否有一个能去除特异赖氨酸的所有三个甲基的组蛋白去甲基化酶存在。
表1.被证明具有组蛋白去甲基化活性的蛋白及其催化的底物

*高浓度才有活性
因此，本领域有必要寻找和研究更多的组蛋白去甲基化酶，并对其作用机制、疾病相关性以及应用进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种去甲基化酶。
本发明的另一目的在于提供所述去甲基化酶的疾病相关性及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种JARID1蛋白或其活性片段或活性衍生物的用途，用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。
在本发明的另一优选例中，所述的去甲基化酶是组蛋白去甲基化酶。
在本发明的另一优选例中，所述的JARID1蛋白选自：JARID1A(RBP-2)蛋白，JARID1B(PLU-1)蛋白，JARID1C(SMCX)蛋白，或JARID1D(SMCY)蛋白。
在本发明的另一优选例中，所述的去甲基化酶去除甲基化的组蛋白亚基3(H3)第4位赖氨酸(K4)上的甲基。
在本发明的另一优选例中，所述的甲基化的组蛋白亚基3第4位赖氨酸上含有1个、2个或3个甲基。
在本发明的另一优选例中，所述的组蛋白亚基3第4位赖氨酸的甲基化导致基因的转录异常。
在本发明的另一优选例中，所述的基因转录异常(活性变化)导致癌症。
在本发明的另一优选例中，所述的JARID1蛋白的活性片段或活性衍生物包含JARID1的JmjC结构域，Arid结构域，JmjN结构域，锌指结构域和PHD结构域。
在本发明的另一优选例中，所述的制剂组合物中还包括：抗坏血酸维生素C(AA)，α酮戊二酸(αKG)，和二价铁离子(Fe2+)。
在本发明的另一优选例中，所述的去甲基化酶用于制备调控雄激素受体的转录活性的制剂。
在本发明的另一优选例中，所述的去甲基化酶用于制备检测癌症的制剂或试剂盒。
在本发明的第二方面，提供一种去甲基化酶制剂组合物，所述去甲基化酶制剂组合物含有：
(a)有效量的JARID1蛋白；
(b)有效量的抗坏血酸维生素C，α酮戊二酸，和二价铁离子；和
(c)生物学上相容的载体。
在本发明的第三方面，提供一种JARID1蛋白、其活性片段或活性衍生物、或它们的激动剂或拮抗剂的用途，用于制备调控雄激素受体的转录活性的制剂；或用于制备预防或治疗癌症的药物。
在本发明的第四方面，提供一种JARID1蛋白的用途，用于制备检测癌症的制剂或试剂盒。
在本发明的另一优选例中，所述的癌症是前列腺癌。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A：人源的含有JmjC结构域的蛋白。在PubMed数据库搜索得到了30个人源的含有JmjC结构域的蛋白。在Vector NTI软件中，应用Clustal W算法进行分析可以得到如图所示的结果。
图1B：JARID1家族结构示意图。JARID1家族的系统进化树以及蛋白的保守结构域由NCBI CDD的搜索引擎和Vector NTI Clustal W算法分析得到，可见JARID1家族各蛋白在结构上较为保守。
图2：JARID1B为H3K4去甲基化酶。该图为免疫组化反应的结果：材料为已被Myc-JARID1B转染或未被转染的Hela细胞(混合体系)；抗体为抗H3K4、H3K9、H3K27或H3K36的单甲基化、二甲基化或三甲基化的抗体，以及抗Myc抗体。
其中，第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc抗体染色和抗甲基化赖氨酸抗体染色(A中第1、2、3行分别为H3K4三甲基化(H3K4me3)、H3K9三甲基化和H3K36三甲基化；B中第1、2、3行分别为H3K4二甲基化(H3K4me2)、H3K9二甲基化(H3K9me2)和H3K27(H3K27me2)二甲基化；C中第1、2、3行分别为H3K4单甲基化(H3K4me1)、H3K9单甲基化(H3K9me1)和H3K36单甲基化(H3K36me1)。箭头表示JARID1B表达的细胞。
图3：JmjN，Arid，JmjC，PHD和锌指是JARID1B去甲基化酶活性所必需的结构域。其中：
A，结构域去除实验的设计图；
B和D，抗甲基化H3K4的免疫组化实验：含myc-JARID1B C端缺失突变体(JARID1BΔC)的质粒转染的Hela细胞(B)，含myc-JARID1B PHD1(ΔPHD1)，JmjN(ΔJmjN)，Arid(ΔArid)，锌指(ΔZF)或JmjC(ΔJmjC)结构域缺失突变体的质粒转染的Hela细胞(D)；第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc抗体染色和抗甲基化H3K4抗体染色(B，上图：H3K4三甲基化；中图：H3K4二甲基化；下图：H3K4单甲基化；D，右侧：H3K4二甲基化)。箭头所示为表达突变体的细胞。
C，不同突变体蛋白表达的Western印迹检测。
图4：JARID1B是依赖于二价铁离子和α-酮戊二酸的双加氧酶。
A，在各种辅助因子存在的情况下，组蛋白与纯化过的JARID1BΔC蛋白(ΔC片段)发生反应(泳道2，另外泳道1为不加JARID1BΔC蛋白时的对照)，特异检测H3K4三、二和单甲基化和特异检测H3K9三甲基化的Western印迹分析。
B，组蛋白与JARID1BΔC蛋白反应(泳道2-6)(以不加JARID1BΔC蛋白的反应作为对照：泳道1)，其中：泳道2的反应在所有的辅助因子(AA、αKG和Fe(II))存在的情况下发生；泳道6中加入了EDTA；泳道3-5各缺失了一种反应辅助因子；特异检测H3K4二甲基化的Western印迹也在随后的实验中完成。以Histone作为对照。
C，组蛋白与JARID1BΔC蛋白反应(泳道2-5)(不加JARID1BΔC蛋白的反应作为对照：泳道1)，其中，泳道3-5的N-乙二酰甘氨酸(N-Oxalylglycine)含量逐渐减少，随后的Western印迹采用特异检测H3K4二甲基化的抗体(Anti-H3K4me2)；以Histone作为对照。
D，免疫组化反应：材料为转染了H499A突变体的Hela细胞；抗体为特异检测H3K4甲基化的抗体。第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc抗体染色和抗甲基化H3K4抗体染色(B，上图：H3K4三甲基化；中图：H3K4二甲基化；下图：H3K4单甲基化)。箭头所示为表达H499A突变体的细胞。
图5：JARID1B是前列腺癌治疗过程中的一种靶分子。
A，本发明人分析了Oncomine数据库中JARID1B基因表达的数据。方框内的粗横线是基因表达的平均水平，封闭的方框代表的覆盖率为95％。方框上下横线代表误差，上下两点代表基因表达的范围。每一组的病例数分别为：良性前列腺组织23例，前列腺癌64例，转移型的前列腺癌25例(P-value＝1.8E-10，correlation＝0.561)。
B，前列腺组织样品的Western印迹检测(BPH(Benign ProstateHyperplasia)代表良性前列腺癌增生；癌症1、癌症2代表两例前列腺癌)，以β-actin作为对照。
C，100ng AR和100ng PSA-荧光素酶与梯度增加的JARID1B一同转染入LNCaP细胞，经雄激素R1881(R1881)刺激(设置不经R1881刺激的反应作为对照)两天后检测荧光素酶的活性。
D，免疫共沉淀实验：泳道1和3是转染了His-JARID1B和HA-AR的293T细胞裂解液；泳道2和4为转染了His-JARID1B但未转染HA-AR的293T细胞裂解液。其中，泳道1和2为上样对照，3和4为免疫共沉淀试验后的检测结果(上图为anti-HA的检测结果，而下图为anti-His的检测结果)。
图6：斑点杂交检测抗体的特异性。把H3K4不同甲基化形式的合成多肽(H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3)点到硝酸纤维膜上，结合牢固后由特异的抗体(Anti-H3K4me1、Anti-H3K4me2、Anti-H3K4me3)进行检测。上样量分别为50ngH3K4单甲基化多肽、15ng H3K4双甲基化多肽和50ng H3K4三甲基化多肽。
图7：JARID1BΔC蛋白酶活特异性的检测。转染了含myc-JARID1B C端缺失突变体(JARID1BΔC)的质粒的Hela细胞的免疫组化实验，所使用的抗体是赖氨酸各种甲基化状态的抗体。第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc染色和抗甲基化赖氨酸染色(它们分别是H3K9单甲基化，H3K9三甲基化，H3K27三甲基化，H3K36三甲基化的检测结果)。箭头所示为表达突变体的细胞。
图8：JmjN，Arid，JmjC，PHD1和锌指是JARID1B去甲基化酶活性所必需的结构域。免疫组化实验：材料为转化了含myc-JARID1B各种结构域缺失突变体的质粒的Hela细胞，使用的抗体为特异识别H3K4三甲基化和单甲基化的两种抗体。第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc抗体染色和抗甲基化H3K4抗体染色。箭头所示为表达突变体的细胞。
图9：纯化后的His-JARID1BΔC蛋白考马斯亮蓝染色结果。反应柱内的沉淀或洗脱液都分别进行了SDS-PAGE分析并由考马斯亮蓝染色。
图10：JARID1A，JARID1C和JARID1D都有H3K4去甲基化活性。免疫组化实验转化了含myc-JARID1A(上图)，JARID1C(中图)和JARID1D(下图)的质粒的Hela细胞，第1、2、3列分别为：DAPI染色、抗Myc抗体染色和抗H3K4三甲基化的抗体染色。
图11：JARID1A，JARID1C和JARID1D在前列腺组织中的表达。本发明人分析了Oncomine数据库中基因表达的数据。方框内的粗横线是基因表达的平均水平，封闭的方框代表的覆盖率为95％。方框上下横线代表误差，上下两点代表基因表达的范围。每一组的病例数分别为：良性前列腺组织23例，前列腺癌64例，转移型的前列腺癌25例。
图12：JARID1B的蛋白序列，每个字母代表一个氨基酸，JARID1B全长1544个氨基酸。
具体实施方式
本发明人通过深入的生物信息学和生物化学的分析，首次揭示JARID1蛋白可用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。JARID1蛋白可特异性针对组蛋白亚基3(H3)第4位赖氨酸(K4)发挥去甲基化作用，并且其能去除甲基化的H3K4上1个(H3K4me1)、2个(H3K4me2)或3个甲基(H3K4me3)。JARID1在细胞内的高表达可引起H3K4上的三甲基化、二甲基化以及一甲基化的缺失，但却不影响组蛋白其它赖氨酸位点的甲基化状态。并且，本发明人还发现，所述JARID1与癌症密切相关，其可作为癌症诊断和治疗的一个靶点。在此基础上完成本发明。
JARID1蛋白
JARID1蛋白是一类存在于细胞核内的蛋白，JARID1蛋白包括：JARID1A蛋白、JARID1B蛋白、JARID1C蛋白、JARID1D蛋白，这些蛋白在结构上类似(见图1B)，在序列上具有较高的同源性。JARID1蛋白含有一系列的结构域，这些结构域包括：JmjN结构域，Bright/Arid结构域，多个PHD结构域，JmjC结构域，锌指(ZF)结构域等。这一系列的结构域衍生出其一系列的功能。
在本发明中，所用的JARID1蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动物组织或细胞。此外，所述的JARID1蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组JARID1蛋白或全人工合成或半合成。优选的，本发明可采用重组的JARID1蛋白。
任何适合的JARID1蛋白均可用于本发明。所述的JARID1蛋白包括全长的JARID1蛋白或其生物活性片段。作为本发明的一种优选方式，所述的JARID1蛋白是JARID1B蛋白，其氨基酸序列可以与GenBank登录号NP_006609所示的序列基本上相同，例如其氨基酸序列见图12所示(SEQ ID NO：12)。此外，JARID1A、JARID1C和JARID1D的氨基酸序列可分别与GenBank登录号NP_00136068、GenBank登录号NP_004178和GenBank登录号NP_004644所示的氨基酸序列基本上相同。
经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的JARID1蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。JARID1蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种JARID1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，JARID1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的JARID1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长JARID1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长JARID1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。作为一种优选的方式，所述的JARID1蛋白的生物活性片段至少包括JmjC结构域；更优选的，所述的JARID1蛋白的生物活性片段包括JmjC结构域，Arid结构域，JmjN结构域，锌指结构域，和PHD结构域。
本发明也可采用经修饰或改良的JARID1蛋白(JARID1蛋白的衍生物)，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的JARID1蛋白。所述经过修饰或改良的JARID1蛋白可以是一种JARID1蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的JARID1蛋白或者基因可以是与天然存在的JARID1蛋白或基因具有一定的不同点，但也能发挥本发明所述的特异性去甲基化作用，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响JARID1蛋白的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。
任何与所述的JARID1蛋白同源性高(比如与JARID1蛋白的同源性为70％或更高，优选的，同源性为80％或更高，更优选的，同源性为90％或更高)的、且具有JARID1蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
作为本发明的一个实例，提供一种人的JARID1B蛋白，它是一条具有1544个氨基酸的蛋白，其蛋白序列参见GenBank登录号NP_006609，其蛋白序列为图12所示(SEQ ID NO：12)。
JARID1的用途
本发明人在研究中发现，JARID1可用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。更优选的，所述的去甲基化酶是组蛋白去甲基化酶。
进一步的研究显示，JARID1可特异性去除组蛋白亚基3(H3)中赖氨酸上的甲基；更优选地，JARID1可去除组蛋白亚基3(H3)第4位赖氨酸(K4)。更有甚者，JARID1不仅可去除一甲基化的H3K4上的甲基，还可去除二甲基化的H3K4或者三甲基化的H3K4上的所有甲基。
高水平的H3K4me3和H3K4me2与几乎所有活化的基因的5’端翻译区有密切关联，与转录率、活化的聚合酶II的分布几率以及组蛋白的乙酰化水平都成正性相关。因此可见，针对于H3K4me3和H3K4me2的去甲基化酶具有抑制转录的活性。
此外，本发明人在研究中还发现，在JARID1的各个结构域中，JmjC结构域，JmjN结构域，Arid结构域，锌指结构域，和PHD结构域是JARID1发挥去甲基作用所必需的。本发明的优选实施例证明了这一点。当选择性地缺失JmjC结构域，JmjN结构域，Arid结构域，锌指结构域，或PHD结构域时，JARID1丧失了去甲基化酶的活力。
此外，本发明人在研究中还发现，JARID1是一种癌症相关的蛋白。在本发明的优选实施例中证明，在良性的前列腺增生中JARID1B的表达很低，前列腺癌越严重，JARID1B的表达就越高。此外，在良性前列腺增生组织中，JARID1A和JARID1C的表达有限，在前列腺癌中也是有限的，然而其表达量在转移型前列腺癌中明显升高。这说明JARID1与癌症的发生和发展有关联。因此提示JARID1可作为癌症诊断和治疗的一个靶位点。
此外，本发明人还鉴定了JARID1B可与雄激素受体(Androgen Receptor，AR)之间发生相互作用以及可调节雄激素受体的转录活性。调节JARID1B的表达可调控雄激素受体的转录活性，并且呈剂量依赖性。通过免疫共沉淀发现，JARID1B与雄激素受体可发生直接的相互作用。
基于本发明人的上述新发现，本发明提供JARID1蛋白(包括：JARID1A蛋白、JARID1B蛋白、JARID1C蛋白、JARID1D蛋白，或它们的活性片段或活性衍生物)的用途，用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。
作为本发明的更优选的方式，所述的去甲基化酶是组蛋白去甲基化酶。
作为本发明的更优选的方式，所述的去甲基化酶去除甲基化的组蛋白亚基3(H3)第4位赖氨酸(K4)上的甲基。
作为本发明的更优选的方式，所述的甲基化的组蛋白亚基3第4位赖氨酸上含有1个(H3K4me1)、2个(H3K4me2)或3个甲基(H3K4me3)。
并且，由于所述的JARID1蛋白是一种癌症相关的蛋白，其还可用于制备检测癌症的制剂或试剂盒。作为一种优选的实施方式，其可用于制备检测前列腺癌的制剂或试剂盒。
并且，由于JARID1与雄激素受体可发生相互作用且可调控雄激素受体的转录活性，因此其可用于制备调控雄激素受体的转录活性的制剂。已有的研究已经表明，前列腺癌的发生或发展与雄激素受体的活性密切相关；并且，目前在本领域中通常都采用调节雄激素受体的药物来治疗前列腺癌。因此提示，可通过调节JARID1的生物学活性来调节雄激素受体的转录活性，进而可以达到治疗前列腺癌的效果。
JARID1蛋白的调节剂及其用途
任何可调节JARID1蛋白的活性、调节JARID1蛋白的稳定性、调节JARID1蛋白的表达、调节JARID1蛋白有效作用时间、或调节JARID1蛋白的转录或翻译的物质均可用于本发明，作为调节JARID1蛋白活性或表达的有效物质。
通过调节JARID1蛋白活性或表达来调节甲基化的组蛋白特定亚基的特异位点上的甲基数量，从而可调节诸如基因的转录等事件；或者，通过调节JARID1蛋白活性或表达来调节雄激素受体的转录状况；或者，通过改变JARID1的活性或表达可以达到治疗癌症的效果。
组合物
本发明提供了一种组合物，它含有有效量(如0.0001-20％；优选的，为0.001-10％)的所述的JARID1B蛋白，以及生物学上相容的载体。
本发明人在研究中发现，所述的JARID1B蛋白发挥酶活需要外源的抗坏血酸维生素C、二价铁离子(Fe(II)离子)、或α酮戊二酸作为辅因子。因此，更优选地，本发明所述的组合物中还含有有效量(如0.00001-10％；优选的，为0.0001-5％)的抗坏血酸维生素C，α酮戊二酸，Fe(II)离子，或它们的组合；最优选的，所述的组合物中同时含有抗坏血酸维生素C，α酮戊二酸和Fe(II)离子。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和生物学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
术语“生物学上相容”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“生物学上相容的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。
试剂盒
本发明还提供一种检测癌症或检测雄激素受体的试剂盒，它包括特异性扩增JARID1基因、转录本的引物；或检测JARID1蛋白表达水平的制剂(如抗JARID1蛋白的特异性抗体)。作为一种优选的方式，所述的癌症是前列腺癌。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液、抗体等。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示JARID1蛋白可用作去甲基化酶或用于制备去甲基化酶制剂组合物。并且JARID1可特异性去除三甲基化、二甲基化或单甲基化的H3K4上的甲基。本发明还克服了现有技术中没有找到针对三甲基化的H3K4的去甲基化酶的缺陷。
(2)首次发现JARID1与癌症(特别是前列腺癌)密切相关，可作为一种新的癌症诊断和治疗的靶点。
(3)首次发现JARID1B可调控雄激素受体的转录活性，因此可通过调节JARID1B的表达或活性来调节雄激素受体的活性，从而可以改变癌症的生长和治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
I.材料和方法
本发明具体实施方式中使用到以下的材料和方法，这些材料和方法并非用于对本发明的限制。并且，常规的PCR、连接、感受态细胞的制备、质粒转化和提取、免疫沉淀、免疫组化等操作可参照分子克隆实验指南。
抗体及其来源
H3K4单甲基化抗体(Abcam 8895)、H3K4二甲基化抗体(Abcam 7766)、H3K4三甲基化抗体(Abcam 8580)、H3K9单甲基化抗体(Abcam 9045)、H3K9二甲基化抗体(Upstate 07-212)、H3K9三甲基化抗体(Abcam 8898)、H3K27单甲基化抗体(Upstate 07-448)、H3K27二甲基化抗体(Upstate 07-452)、H3K36单甲基化抗体(Abcam 9048)、H3K36二甲基化抗体(Upstate 07-274)、H3K36三甲基化抗体(Abcam 9050)、抗H3抗体(Abcam 1791)、抗Flag抗体(SigmaF7425-0.2MG)、抗Myc抗体(Calbiochem OP10)和(Sigma c-3956)、抗AR(N-20)抗体(Santa Cruz，sc-816)、羊抗兔IgG(Jackson)、羊抗鼠IgG(Jackson)、驴抗兔(Molecular Probes Alexa 594)和羊抗鼠(Molecular Probes Alexa488)、α-Flag M2亲和胶(Sigma A2220)。
化学试剂
无水α-酮戊二酸二钠盐(Sigma Cat# 75892)，N-oxalyglycine(AlexisBiochemicals Cat# 270-412-M010)、抗坏血酸(Sigma Cat# F1543)、Ni-NTA柱(25ml)(Qiagen Cat# 30210)。
质粒构建
pcDNA-JARID1B(JARID1B cDNA克隆于pcDNA3.1(-)/MYC-His A)，由英国癌症研究中心的Joyce Taylor-Papadimitriou提供(或参见文献The Journalof Biological Chemistry 274：15633)。含有缺失突变体的质粒的构建方法如下(所有PCR扩增片段和片段插入位点均已经过测序确认)：
质粒pcDNA-JARID1B经过EcoR V和Xho I双酶切并线形化处理后，补平后经自连接环化，形成含JARID1B C端缺失突变体的质粒。
以pcDNA-JARID1B为模板，PCR扩增-132到93的基因片段，引物序列如下：
GTACATGACCTTACGGG(SEQ ID NO：1)；
ATAGCGGCCGCTCGGGTGGAGGCAGGAACT(SEQ ID NO：2)。
PCR扩增产物经Xho I和Not I双酶切后，连入经过Xho I和Not I双酶切处理的pcDNA-JARID1B，形成含JARID1B JmjN功能域缺失突变体的质粒。
以pcDNA-JARID1B为模板，PCR扩增-132到933和1066到1800两段基因片段，引物序列分别如下：
-132到933片段引物：
GTACATGACCTTACGGG(SEQ ID NO：1)；
ATAGGATCCGACATACAGGTCCACAGCAT(SEQ ID NO：3)。
1066到1800片段引物：
ATAGGATCCTGTTTGGCTCAGGAATGTAG(SEQ ID NO：4)；
GCAGAAGTTAACAGCCTCAG(SEQ ID NO：5)。
PCR扩增片段先分别亚克隆到T载体，分别经Xba I/BamH I(对应于含有-132到933片段)和BamH I/Hpa I(对应于含有1066到1800片段)双酶切后，连入经过Xba I和Hpa I双酶切处理的pcDNA-JARID1B，三片段连接，形成含JARID1B PHD功能域缺失突变体的质粒。
以pcDNA-JARID1B为模板，PCR扩增-132到1464的基因片段，引物序列如下：
GTACATGACCTTACGGG(SEQ ID NO：1)；
ATACAACCAAGGAAGTTTC(SEQ ID NO：6)。
PCR扩增产物经Xba I和Hpa I双酶切后，连入经过Xba I和Hpa I双酶切处理的pcDNA-JARID1B，形成含JARID1B Jmjc功能缺失突变体的质粒。
以pcDNA-JARID1B为模板，PCR扩增-132到1502和1491到1800两段基因片段，引物序列分别如下：
-132到1502片段引物：
GTACATGACCTTACGGG(SEQ ID NO：1)；
TCAATTGCCCAACAGAATGAAGAAAAGCACATTCC(SEQ ID NO：7)。
1491到1800片段引物：
TTGGGCAATTGAAGACCACTGGAGC(SEQ ID NO：8)；
GCAGAAGTTAACAGCCTCAG(SEQ ID NO：9)。
PCR扩增片段先亚克隆到T载体，经Xba I/Mfe I(对应于含有-132到1502片段)和Mfe I/Hpa I(对应于含有1491到1800片段)双酶切后，连接到经XbaI和Hpa I双酶切处理的pcDNA-JARID1B，三片段连接，形成H499A功能域缺失突变体。
细胞转染和Western印迹
Hela、LNCaP、293T细胞(购自ATCC)在Iscove’s DMEM(10％FBS)培养基中生长。细胞转染使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)。前列腺组织由上海第六人民医院提供(已经得到院组织评定组许可)。
Western印迹：细胞或组织用SDS上样缓冲液制成匀浆，经SDS-PAGE胶分离后，用相应的抗体染色后由ECL曝光成像。
免疫组化
Hela细胞被培养在培养皿中的盖玻片上，第二天进行转染。转染72h后，细胞由PBS清洗一次后，4％多聚甲醛浸泡10min，然后再由预冷的PBS清洗，后经含有0.2％Triton X-100的预冷PBS浸泡5min。细胞由封闭缓冲液(含有1％BSA的PBS)清洗三次后封闭1个小时，而后与一抗混合反应30min。PBS清洗三次后，细胞与二抗混合反应1个小时。PBS清洗，DAPI(1∶4000)染色。PBS清洗两次后荧光萃灭封片剂(Vector Laboratories)封片，荧光显微镜观察。
His-JARID1BΔC蛋白的表达纯化
以pcDNA-JARID1B为模板，PCR扩增1到2250的基因片段，引物序列如下：
ATAGGATCCATGGAGGCGGCCACCACACT(SEQ ID NO：10)；和
ATACTCGAGAAGCTTCAATGCATTCATC(SEQ ID NO：11)。
PCR扩增产物经Xho I和BamH I双酶切后，连入经过Xho I和BamH I双酶切处理的pET28a(+)(Novagen)，形成含His-ΔC JARID1B的pET28a(+)-ΔC-JARID1B。该cDNA转入Rosetta大肠杆菌菌株(Novagen)，37℃、250转/秒培养。当OD达到0.5-0.6时加入0.05mM，01mM，0.5mM，1mM的IPTG在16℃诱导蛋白表达过夜。收集菌体并重悬于裂解缓冲液，200W超声25次(超声2s，停15s)。将上清装入平衡过的镍柱，用2ml漂洗缓冲液1(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑，pH8.0)洗2次，0.5ml漂洗缓冲液2(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、40mM咪唑，pH8.0)洗4次，0.5ml漂洗缓冲液3(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、60mM咪唑，pH8.0)洗1次。重组蛋白用0.1ml洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑，pH8.0)分12次洗脱。
去甲基化检测
组蛋白或者具有不同甲基化形式的合成多肽和His-JARID1BΔC蛋白在去甲基化缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.3，150mM NaCl，50μM(NH4)2Fe(SO4)2+6(H2O)，1mM α-酮戊二酸，2mM抗坏血酸)中反应3个小时(37℃)。5-10μg的His-JARID1BΔC蛋白与2.5-5μg的组蛋白在如上所述的100μl体系中进行去甲基化反应，经SDS-PAGE上样缓冲液终止后由Western印迹检测。
II.实施例
实施例1运用生物信息学分析方法鉴别包含JmjC结构域的人源蛋白
本发明人运用生物信息学方法分析了人源的包含JmjC结构域的蛋白基因序列，因为JmjC结构域已经被证明是组蛋白去甲基化酶催化活性结构域。
本发明人从PubMed上找到30个候选基因，将它们分成七大组，见图1A。除了那些已经被证明具有组蛋白去甲基化活性的蛋白家族(第二组中的JHDM1，第三组中的JHDM2，以及第六组中的JMJD2)(图1A或表1)，本发明人预测第五组的JARID1蛋白家族是一组新型的区别于以往已鉴定的去甲基化酶具有不同赖氨酸特异性的去甲基化酶。
在JARID1蛋白家族有四个蛋白(见图1B)中，本发明人发现JARID1B具有可去除H3K4三甲基、二甲基和一甲基的功能，JARID1A，JARID1C和JARID1D也有同样的功能，具体的验证见后续的实施例。
实施例2 JARID1B的体内去甲基化活性
为了证明本发明人的假设，把带Myc标记的JARID1B载体(pcDNA-JARID1B)转染到Hela细胞，然后运用特异抗H3K4三甲基(H3K4me3)抗体通过免疫组化的方法来检测组蛋白赖氨酸的甲基化状况是否受到影响。
与相邻没有转染的细胞相比，外源表达的Myc-JARID1B导致了H3K4me3完全丢失，见图2A第1行。然而JARID1B的高表达却不能影响H3K9me3(图2A第2行)以及H3K36me3(图2A第3行)的水平。这些数据表明，JARID1B是一个H3K4me3特异的去甲基化酶。
为了检测JARID1B是否也具有去除H3K4的一甲基和二甲基作用，本发明人用其它抗组蛋白修饰的特异抗体免疫染色了Myc-JARID1B转染成功的细胞。发现JARID1B高表达的细胞也能导致H3K4二甲基(H3K4me2)(图2B第1行)以及H3K4一甲基(H3K4me1)(图2C第1行)的甲基丢失，而相邻没有转染载体的细胞发出的强烈的H3K4me2和H3K4me1信号作为阴性对照。该去甲基化酶针对于H3K4的去二甲基化和去一甲基化是特异性的，因为高表达的JARID1B对H3K9me2(图2B第2行)，H3K27me2(图2B第3行)，H3K9me1(图2C第2行)以及H3K36me1(图2C第3行)没有作用。
综上结果表明，JARID1B是一个H3K4特异的能去除三、二以及一甲基的组蛋白去甲基化酶。
JARID1B具有去除H3K4三甲基、二甲基以及一甲基的去甲基化能力是非常令人惊奇的，因为以往所有鉴定的组蛋白去甲基化酶仅仅能从特异的赖氨酸去除一个甲基或二个甲基。为了进一步确认本发明人使用的抗体是特异的，运用合成的具有特异甲基化状态的短肽作为抗原，用前述使用的抗体做了点免疫印记反应，结果显示针对于不同甲基化状态的短肽抗体是特异的，见图6。
此外，本发明人还用不同批号的抗体，运用免疫组化的方法来进一步鉴定，证明所使用的甲基化特异的抗体是特异的。
实施例3 JmjN，Arid，JmjC，PHD和锌指结构域是酶活所必须的
JARID1B是一个具有1544个氨基酸的蛋白，由一系列的结构域构成(见图3A)。
为了鉴定哪一个结构域是去甲基化功能所必需的，本发明人首先鉴定了包含JmjN、Arid、PHD1、JmjC以及锌指结构域的N末端片段(ΔC)是否具有酶活力。
结果发现，这个片段的高表达导致了H3K4的三甲基、二甲基以及一甲基的丢失(见图3B)；却对H3K9me1，H3K9me3，H3K27me3和H3K36me3的甲基化水平没有作用(见图7)，这些结果表明特异的酶活性是位于该蛋白的N末端，去除C末端不影响其去甲基化酶活性。
为了进一步定位哪一个结构域是对去甲基化活性所必须的，本发明人构建了JARID1B的被预测具有功能的结构域缺失突变体。不同突变体蛋白(包括ΔJmjN，ΔJmjC，ΔArid，ΔZF，ΔC，ΔPHD1，His499Ala)表达的Western印迹见图3C所示。
本发明人通过免疫组化方法检测了这些突变体的体内活性，结果发现，JmjN，Arid，JmjC，锌指和PHD1的缺失突变体(ΔPHD1，ΔJmjN，ΔArid，ΔZF，ΔJmjC)丧失了去甲基化酶活性(图3D，图8)。这些数据表明，JmjN，Arid，JmjC，锌指和PHD1结构域是去甲基化酶活性所必需的。所述结果也说明了JARID1B具有与其它已鉴定包含JmjC结构域去甲基化酶活力相似的结构必需性。
实施例4 JARID1B是一个铁离子和α酮戊二酸所依赖的加双氧化酶
为了鉴定酶的化学机制，本发明人运用JARID1BΔC片段(ΔC片段)进行了体外的生化实验，因为这个片段保留了特异的全酶活性。
纯化的JARID1BΔC片段(图9)跟组蛋白孵育后，用免疫印迹分析来检测对赖氨酸的去甲基作用。在各种辅因子存在的情况下，JARID1BΔC片断能降低H3K4的三甲基、二甲基以及一甲基水平，但对H3K9的三甲基情况没有影响(图4A)，这些表明JARID1B直接催化去甲基化作用，而JARID1BΔC片断保留了特异的全酶活性。
为了测定JARID1B是否是一个属于Cupin超家族Fe(II)的加双氧化酶，本发明人进行了每次缺失一种辅因子的情况下进行催化反应。发现在缺失抗坏血酸维生素C(AA)、α酮戊二酸(αKG)、Fe(II)离子或存在EDTA螯合的情况下都会导致酶活性的剧烈降低(图4B)。当用一种可以替代α酮戊二酸的酶活辅助作用的α酮戊二酸类似竞争物——N-乙二酰甘氨酸(N-oxalylglycine)加入反应体系中，发现该酶的去甲基化作用得到抑制，而且这种抑制作用是呈剂量依赖性的(图4C)。这些数据揭示了JARID1B是一个铁离子和α酮戊二酸依赖的加双氧化酶。
已有研究显示，含有JmjC结构域的JMJD2A的晶体结构表明酶催化活性结构域是个具有八个β-折叠的果子冻状(Jellyroll)的结构，其中三个供螯合铁离子的氨基酸残基是保守的而且是去甲基化酶活性所必须的。在JARID1B中对应的这三个氨基酸残基是His499，Glu501和His587。为了鉴定这个结构是酶活所必须的，本发明人将His499突变成丙氨酸(His499Ala)。在转染和没转染该突变体载体的细胞的H3K4me3、H3K4me2以及H3K4me1的水平均没有变化(图4D)，说明His499Ala是去甲基化酶活性需要的。这些数据进一步证明了JARID1B是一个铁离子依赖的加双氧化酶。
实施例5在前列腺癌中JARID1B是上调的且调控了雄激素受体的功能
JARID1B又名PLU-1，在正常成人组织中是极低表达的。本发明人在实验中发现，JARID1B在前列腺癌中也是高表达的。
本发明人搜索了包含数万个基因芯片癌症档案数据的Oncomine数据库(参见The Proceeding of National Academy of Sciences USA 101：811和Neoplasia6：1)。Oncomine数据库的分析得出，在良性前列腺增生组织中JARID1B的表达是有限的，但在前列腺癌中是显著上调表达的(图5A)，其表达量在转移型前列腺癌中更高。
此外，本发明人也检测了JARID1B在有限的前列腺冰冻组织中的表达水平，检测到JARID1B在前列腺癌组织中是高表达的，相比较而言在良性前列腺增生组织样品中却检测不到JARID1B的表达(图5B)。这些数据提示，JARID1B与前列腺癌的发生与发展有关联。
雄激素受体在前列腺癌的发生与发展中起到了至关重要的的作用。为了检测JARID1B是否调控了雄激素受体，本发明人运用了常规的荧光素酶报告基因检测法进行验证。结果发现，JARID1B的转染增强了雄激素受体的转录活性而且呈现出剂量依赖性(图5C)。
此外，本发明人也采用免疫共沉淀的方法来检测了JARID1B与雄激素受体在体内是相互作用的(图5D)。因此提示JARID1B是一个有希望的前列腺癌的治疗靶点。
实施例6 JARID1A，JARID1C，JARID1D的体内去甲基化活性
由于JARID1A，JARID1C，JARID1D与JARID1B在氨基酸序列和功能结构域非常相似，在论证了JARID1B的去甲基化功能的同时，本发明人预测JARID1A，JARID1C，JARID1D也会有与JARID1B相同的组蛋白去甲基化酶活性。
为了证明本发明人的假设，把带有Myc标记的JARID1A，JARID1C，JARID1D载体转染到Hela细胞，然后运用特异性抗H3K4三甲基(H3K4me3)抗体通过免疫组化的方法来检测组蛋白赖氨酸的甲基化状况是否受到影响。在实验过程中，重组载体的构建、细胞的转染以及免疫组化等方法同前述针对JARID1B的相应方法。
与相邻没有转染的细胞相比，外源表达的Myc-JARID1A((图10第1行)，myc-JARID1C(图10第2行)，myc-JARID1C(图10第3行)都导致了H3K4me3完全丢失。这些数据表明，JARID1A，JARID1C和JARID1D也有和JARID1B同样的去甲基化酶活性。
实施例7 JARID1A，JARID1C，JARID1D在前列腺癌中的表达
本发明人搜索了包含数万个基因芯片癌症档案数据的Oncomine数据库(参见The Proceeding of National Academy of Sciences USA 101：811和Neoplasia6：1)。Oncomine数据库的分析得出，在良性前列腺增生组织中JARID1A和JARID1C的表达是有限的，在前列腺癌中也是有限的(图11)，但其表达量在转移型前列腺癌中明显升高。相反，JARID1D在良性前列腺增生组织有一定的表达，但随着癌症的发展，其表达明显的下调。
上述结果提示，JARID1A，JARID1C，JARID1D与癌症的发生和发展是有关联的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国科学院上海生命科学研究院
<120>一种和癌症有关的组蛋白去甲基化酶及其应用
<130>070766
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>1
gtacatgacc ttacggg                   17
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>2
atagcggccg ctcgggtgga ggcaggaact     30
<210>3
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>3
ataggatccg acatacaggt ccacagcat      29
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
ataggatcct gtttggctca ggaatgtag           29
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
gcagaagtta acagcctcag                     20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
atacaaccaa ggaagtttc                      19
<210>7
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
tcaattgccc aacagaatga agaaaagcac attcc    35
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
ttgggcaatt gaagaccact ggagc               25
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
gcagaagtta acagcctcag              20
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
ataggatcca tggaggcggc caccacact    29
<210>11
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>11
atactcgaga agcttcaatg cattcatc     28
<210>12
<211>1544
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>12
Met Glu Ala Ala Thr Thr Leu His Pro Gly Pro Arg Pro Ala Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro Gly Pro Leu Gly Glu Phe Leu Pro Pro Pro Glu Cys
            20                  25                  30
Pro Val Phe Glu Pro Ser Trp Glu Glu Phe Ala Asp Pro Phe Ala Phe
        35                  40                  45
Ile His Lys Ile Arg Pro Ile Ala Glu Gln Thr Gly Ile Cys Lys Val
    50                  55                  60
Arg Pro Pro Pro Asp Trp Gln Pro Pro Phe Ala Cys Asp Val Asp Lys
65                  70                  75                  80
Leu His Phe Thr Pro Arg Ile Gln Arg Leu Asn Glu Leu Glu Ala Gln
                85                  90                  95
Thr Arg Val Lys Leu Asn Phe Leu Asp Gln Ile Ala Lys Tyr Trp Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Gly Ser Thr Leu Lys Ile Pro His Val Glu Arg Lys Ile Leu
        115                 120                 125
Asp Leu Phe Gln Leu Asn Lys Leu Val Ala Glu Glu Gly Gly Phe Ala
    130                 135                 140
Val Val Cys Lys Asp Arg Lys Trp Thr Lys Ile Ala Thr Lys Met Gly
145                 150                 155                 160
Phe Ala Pro Gly Lys Ala Val Gly Ser His Ile Arg Gly His Tyr Glu
                165                 170                 175
Arg Ile Leu Asn Pro Tyr Asn Leu Phe Leu Ser Gly Asp Ser Leu Arg
            180                 185                 190
Cys Leu Gln Lys Pro Asn Leu Thr Thr Asp Thr Lys Asp Lys Glu Tyr
        195                 200                 205
Lys Pro His Asp Ile Pro Gln Arg Gln Ser Val Gln Pro Ser Glu Thr
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Ala Arg Arg Ala Lys Arg Met Arg Ala Glu Ala Met Asn
225                 230                 235                 240
Ile Lys Ile Glu Pro Glu Glu Thr Thr Glu Ala Arg Thr His Asn Leu
                245                 250                 255
Arg Arg Arg Met Gly Cys Pro Thr Pro Lys Cys Glu Asn Glu Lys Glu
            260                 265                 270
Met Lys Ser Ser Ile Lys Gln Glu Pro Ile Glu Arg Lys Asp Tyr Ile
        275                 280                 285
Val Glu Asn Glu Lys Glu Lys Pro Lys Ser Arg Ser Lys Lys Ala Thr
    290                 295                 300
Asn Ala Val Asp Leu Tyr Val Cys Leu Leu Cys Gly Ser Gly Asn Asp
305                 310                 315                 320
Glu Asp Arg Leu Leu Leu Cys Asp Gly Cys Asp Asp Ser Tyr His Thr
                325                 330                 335
Phe Cys Leu Ile Pro Pro Leu His Asp Val Pro Lys Gly Asp Trp Arg
            340                 345                 350
Cys Pro Lys Cys Leu Ala Gln Glu Cys Ser Lys Pro Gln Glu Ala Phe
        355                 360                 365
Gly Phe Glu Gln Ala Ala Arg Asp Tyr Thr Leu Arg Thr Phe Gly Glu
    370                 375                 380
Met Ala Asp Ala Phe Lys Ser Asp Tyr Phe Asn Met Pro Val His Met
385                 390                 395                 400
Val Pro Thr Glu Leu Val Glu Lys Glu Phe Trp Arg Leu Val Ser Thr
                405                 410                 415
Ile Glu Glu Asp Val Thr Val Glu Tyr Gly Ala Asp Ile Ala Ser Lys
            420                 425                 430
Glu Phe Gly Ser Gly Phe Pro Val Arg Asp Gly Lys Ile Lys Leu Ser
        435                 440                 445
Pro Glu Glu Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Gly Trp Asn Leu Asn Asn Met
    450                 455                 460
Pro Val Met Glu Gln Ser Val Leu Ala His Ile Thr Ala Asp Ile Cys
465                 470                 475                 480
Gly Met Lys Leu Pro Trp Leu Tyr Val Gly Met Cys Phe Ser Ser Phe
                485                 490                 495
Cys Trp His Ile Glu Asp His Trp Ser Tyr Ser Ile Asn Tyr Leu His
            500                 505                 510
Trp Gly Glu Pro Lys Thr Trp Tyr Gly Val Pro Gly Tyr Ala Ala Glu
        515                 520                 525
Gln Leu Glu Asn Val Met Lys Lys Leu Ala Pro Glu Leu Phe Val Ser
    530                 535                 540
Gln Pro Asp Leu Leu His Gln Leu Val Thr Ile Met Asn Pro Asn Thr
545                 550                 555                 560
Leu Met Thr His Glu Val Pro Val Tyr Arg Thr Asn Gln Cys Ala Gly
                565                 570                 575
Glu Phe Val Ile Thr Phe Pro Arg Ala Tyr His Ser Gly Phe Asn Gln
            580                 585                 590
Gly Phe Asn Phe Ala Glu Ala Val Asn Phe Cys Thr Val Asp Trp Leu
        595                 600                 605
Pro Leu Gly Arg Gln Cys Val Glu His Tyr Arg Leu Leu His Arg Tyr
    610                 615                 620
Cys Val Phe Ser His Asp Glu Met Ile Cys Lys Met Ala Ser Lys Ala
625                 630                 635                 640
Asp Val Leu Asp Val Val Val Ala Ser Thr Val Gln Lys Asp Met Ala
                645                 650                 655
Ile Met Ile Glu Asp Glu Lys Ala Leu Arg Glu Thr Val Arg Lys Leu
            660                 665                 670
Gly Val Ile Asp Ser Glu Arg Met Asp Phe Glu Leu Leu Pro Asp Asp
        675                 680                 685
Glu Arg Gln Cys Val Lys Cys Lys Thr Thr Cys Phe Met Ser Ala Ile
    690                 695                 700
Ser Cys Ser Cys Lys Pro Gly Leu Leu Val Cys Leu His His Val Lys
705                 710                 715                 720
Glu Leu Cys Ser Cys Pro Pro Tyr Lys Tyr Lys Leu Arg Tyr Arg Tyr
                725                 730                 735
Thr Leu Asp Asp Leu Tyr Pro Met Met Asn Ala Leu Lys Leu Arg Ala
            740                 745                 750
Glu Ser Tyr Asn Glu Trp Ala Leu Asn Val Asn Glu Ala Leu Glu Ala
        755                 760                 765
Lys Ile Asn Lys Lys Lys Ser Leu Val Ser Phe Lys Ala Leu Ile Glu
    770                 775                 780
Glu Ser Glu Met Lys Lys Phe Pro Asp Asn Asp Leu Leu Arg His Leu
785                 790                 795                 800
Arg Leu Val Thr Gln Asp Ala Glu Lys Cys Ala Ser Val Ala Gln Gln
                805                 810                 815
Leu Leu Asn Gly Lys Arg Gln Thr Arg Tyr Arg Ser Gly Gly Gly Lys
            820                 825                 830
Ser Gln Asn Gln Leu Thr Val Asn Glu Leu Arg Gln Phe Val Thr Gln
        835                 840                 845
Leu Tyr Ala Leu Pro Cys Val Leu Ser Gln Thr Pro Leu Leu Lys Asp
    850                 855                 860
Leu Leu Asn Arg Val Glu Asp Phe Gln Gln His Ser Gln Lys Leu Leu
865                 870                 875                 880
Ser Glu Glu Thr Pro Ser Ala Ala Glu Leu Gln Asp Leu Leu Asp Val
                885                 890                 895
Ser Phe Glu Phe Asp Val Glu Leu Pro Gln Leu Ala Glu Met Arg Ile
            900                 905                 910
Arg Leu Glu Gln Ala Arg Trp Leu Glu Glu Val Gln Gln Ala Cys Leu
        915                 920                 925
Asp Pro Ser Ser Leu Thr Leu Asp Asp Met Arg Arg Leu Ile Asp Leu
    930                 935                 940
Gly Val Gly Leu Ala Pro Tyr Ser Ala Val Glu Lys Ala Met Ala Arg
945                 950                 955                 960
Leu Gln Glu Leu Leu Thr Val Ser Glu His Trp Asp Asp Lys Ala Lys
                965                 970                 975
Ser Leu Leu Lys Ala Arg Pro Arg His Ser Leu Asn Ser Leu Ala Thr
            980                 985                 990
Ala Val Lys Glu Ile Glu Glu Ile Pro Ala Tyr Leu Pro Asn Gly Ala
        995                 1000                1005
Ala Leu Lys Asp Ser Val Gln Arg Ala Arg Asp Trp Leu Gln Asp
    1010                1015                1020
Val Glu Gly Leu Gln Ala Gly Gly Arg Val Pro Val Leu Asp Thr
    1025                1030                1035
Leu Ile Glu Leu Val Thr Arg Gly Arg Ser Ile Pro Val His Leu
    1040                1045                1050
Asn Ser Leu Pro Arg Leu Glu Thr Leu Val Ala Glu Val Gln Ala
    1055                1060                1065
Trp Lys Glu Cys Ala Val Asn Thr Phe Leu Thr Glu Asn Ser Pro
    1070                1075                1080
Tyr Ser Leu Leu Glu Val Leu Cys Pro Arg Cys Asp Ile Gly Leu
    1085                1090                1095
Leu Gly Leu Lys Arg Lys Gln Arg Lys Leu Lys Glu Pro Leu Pro
    1100                1105                1110
Asn Gly Lys Lys Lys Ser Thr Lys Leu Glu Ser Leu Ser Asp Leu
    1115                1120                1125
Glu Arg Ala Leu Thr Glu Ser Lys Glu Thr Ala Ser Ala Met Ala
    1130                1135                1140
Thr Leu Gly Glu Ala Arg Leu Arg Glu Met Glu Ala Leu Gln Ser
    1145                1150                1155
Leu Arg Leu Ala Asn Glu Gly Lys Leu Leu Ser Pro Leu Gln Asp
    1160                1165                1170
Val Asp Ile Lys Ile Cys Leu Cys Gln Lys Ala Pro Ala Ala Pro
    1175                1180                1185
Met Ile Gln Cys Glu Leu Cys Arg Asp Ala Phe His Thr Ser Cys
    1190                1195                1200
Val Ala Val Pro Ser Ile Ser Gln Gly Leu Arg Ile Trp Leu Cys
    1205                1210                1215
Pro His Cys Arg Arg Ser Glu Lys Pro Pro Leu Glu Lys Ile Leu
    1220                1225                1230
Pro Leu Leu Ala Ser Leu Gln Arg Ile Arg Val Arg Leu Pro Glu
    1235                1240                1245
Gly Asp Ala Leu Arg Tyr Met Ile Glu Arg Thr Val Asn Trp Gln
    1250                1255                1260
His Arg Ala Gln Gln Leu Leu Ser Ser Gly Asn Leu Lys Phe Val
    1265                1270                1275
Gln Asp Arg Val Gly Ser Gly Leu Leu Tyr Ser Arg Trp Gln Ala
    1280                1285                1290
Ser Ala Gly Gln Val Ser Asp Thr Asn Lys Val Ser Gln Pro Pro
    1295                1300                1305
Gly Thr Thr Ser Phe Ser Leu Pro Asp Asp Trp Asp Asn Arg Thr
    1310                1315                1320
Ser Tyr Leu His Ser Pro Phe Ser Thr Gly Arg Ser Cys Ile Pro
    1325                1330                1335
Leu His Gly Val Ser Pro Glu Val Asn Glu Leu Leu Met Glu Ala
    1340                1345                1350
Gln Leu Leu Gln Val Ser Leu Pro Glu Ile Gln Glu Leu Tyr Gln
    1355                1360                1365
Thr Leu Leu Ala Lys Pro Ser Pro Ala Gln Gln Thr Asp Arg Ser
    1370                1375                1380
Ser Pro Val Arg Pro Ser Ser Glu Lys Asn Asp Cys Cys Arg Gly
    1385                1390                1395
Lys Arg Asp Gly Ile Asn Ser Leu Glu Arg Lys Leu Lys Arg Arg
    1400                1405                1410
Leu Glu Arg Glu Gly Leu Ser Ser Glu Arg Trp Glu Arg Val Lys
    1415                1420                1425
Lys Met Arg Thr Pro Lys Lys Lys Lys Ile Lys Leu Ser His Pro
    1430                1435                1440
Lys Asp Met Asn Asn Phe Lys Leu Glu Arg Glu Arg Ser Tyr Glu
    1445                1450                1455
Leu Val Arg Ser Ala Glu Thr His Ser Leu Pro Ser Asp Thr Ser
    1460                1465                1470
Tyr Ser Glu Gln Glu Asp Ser Glu Asp Glu Asp Ala Ile Cys Pro
    1475                1480                1485
Ala Val Ser Cys Leu Gln Pro Glu Gly Asp Glu Val Asp Trp Val
    1490                1495                1500
Gln Cys Asp Gly Ser Cys Asn Gln Trp Phe His Gln Val Cys Val
    1505                1510                1515
Gly Val Ser Pro Glu Met Ala Glu Lys Glu Asp Tyr Ile Cys Val
    1520                1525                1530
Arg Cys Thr Val Lys Asp Ala Pro Ser Arg Lys
    1535                1540