5HT5配体用于治疗神经变性和神经精神疾病的应用.pdf

本发明涉及5-HT5受体的结合配偶体在生产治疗神经病理疾病，特别是神经变性和/或神经精神病、紊乱中的药物中的应用，尤其是用于治疗大脑缺血、中风、癫痫及一般的发作、慢性精神分裂症、其它精神病、痴呆，尤其是阿尔茨海默痴呆、脱髓鞘疾病，尤其是多发性硬化以及脑肿瘤。本发明还涉及该结合配偶体的鉴别及表征方法，尤其是筛选方法。

权利要求书
1.   5-HT5受体结合配偶体在生产治疗神经病理疾病的药物的应用，其中所述结合配偶体对5-HT5受体结合的Ki值小于10-7M并且其对5-HT1A受体的结合亲和性至多比对5-HT5受体的大10倍。

2.   权利要求1的应用，其中所述结合配偶体对5-HT5受体的结合亲和性大于对5-HT1A受体。

3.   权利要求1或2的应用，其中所述神经病理疾病为精神病。

4.   权利要求3的应用，其中所述精神病选自急性外原反应型精神病或器质性的或者外原性原因伴发的精神病、内源性精神病、感情障碍以及上述精神病的混合型。

5.   权利要求4的应用，其中所述内源性精神病选自精神分裂症及分裂模式和妄想障碍。

6.   权利要求4的应用，其中所述感情障碍选自抑郁症、躁狂和躁狂抑郁状态。

7.   权利要求1或2的应用，其中所述神经病理疾病为精神分裂症。

8.   权利要求1或2的应用，其中所述神经病理疾病为慢性精神分裂症。

9.   权利要求1或2的应用，其中所述神经病理疾病为癫痫。

10.   权利要求1或2的应用，其中所述神经病理疾病为痴呆。

11.   权利要求10的应用，其中所述痴呆为老年痴呆。

12.   权利要求10的应用，其中所述痴呆为阿尔茨海默痴呆。

13.   5-HT5受体结合配偶体在生产治疗神经病理疾病的病征、症状和/或机能不良的药物中的应用，其中所述结合配偶体对5-HT5受体结合的Ki值小于10-7M并且其对5-HT1A受体的结合亲和性至多比对5-HT5受体的大10倍。

14.   权利要求13的应用，其中所述结合配偶体对5-HT5受体的结合亲和性大于对5-HT1A受体。

15.   权利要求13或14的应用，其中所述神病征、症状和/或机能不良是感情障碍。

16.   权利要求15的应用，其中所述感情障碍是抑郁症。

17.   权利要求15的应用，其中所述感情障碍是焦虑症。

18.   权利要求17的应用，其中所述焦虑症是精神分裂症的症状。

19.   权利要求13或14的应用，其中所述神病征、症状和/或机能不良选自言语断续、欣快、缺少面部表情、单调的语言、抑郁、情感淡漠、易变的易感性、刚硬的易感性、受损的自发性、受损的决断力、迟钝的思考以及差的社交能力。

20.   权利要求19的应用，其中所述迟钝的思考是精神分裂症的症状。

说明书5-HT5配体用于治疗神经变性和神经精神疾病的应用
本申请是国际申请日为2000年1月11日(国际申请号为PCT/EP00/00143)、进入国家阶段申请号为00804544.5的发明名称为“5-HT5配体用于治疗神经变性和神经精神疾病的应用”的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及5-HT5受体的结合配偶体(binding partners)在治疗神经病理疾病及相关适应症、症状和机能不良的应用以及涉及对该类型的结合配偶体的鉴别和表征方法。
背景技术
至少有七种不同的受体种类介导多种多样的、与神经递质血清素(5-羟色胺，缩写为5-HT)的参与有关的生理活性。根据国际公认的分类，它们被称作5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT5、5-HT6和5-HT7。而且这些受体种类中的多数包括可以进一步分化的受体类型。因此，5-HT1类受体包括可以分化为至少5个亚型的受体，它们被称作5-HT1A、5-HT1B、5-HT1C、5-HT1D和5-HT1E(Boess F.G.和Martin I.L.，Neuropharmacology 33：275-317(1994))。
5-HT5类受体首先是由Plassat等在The EMBO Journal Vol.11No.13，pp.4779-4786(1992)中描述的。5-HT5A和5-HT5B受体被区分出来(Erlander等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3452-3456(1993))。5-HT5和其他5-HT受体之间仅仅存在较小的序列同源性。这些受体的药理学特性明显不同。利用分子生物学技术，5-HT5的定位可能是在嗅球、海马体、皮质、脑室、胼胝体和小脑中。通过用免疫组织化学法，可以显示出5-HT5主要表达在星形胶质细胞(Carson等，GLIA 17：317-326(1996))。星形胶质细胞直接和血脑屏障的脑毛细管的基底膜相邻。异常的星形胶质细胞内皮结构伴随着血脑屏障的丧失。星形胶质细胞的准确意义还不清楚。它们似乎执行转运任务和联络功能。在多种病理性脑病变和神经精神障碍中观察到，反应性星形胶质细胞和反应性神经胶质增生有关。由于脑损伤，它们改变了其形态。蛋白质表达模式改变且产生生长因子。有关温育星状胶质细胞的体外研究已经能够监测5-HT5受体介导的响应。因此人们一方面推测，它们参与疾病后脑部的恢复过程，但另一方面也不排除它们促进损伤的产生，或者甚至强化损伤。
现今CNS疾病影响大部分人口，特别是由于老年人的增加，病人的数量持续不断的增加。神经病理学疾病如大脑缺血、中风、癫痫及一般的发作、慢性精神分裂症、其它精神病、痴呆尤其是阿尔茨海默痴呆、脱髓鞘疾病尤其是多发性硬化以及脑肿瘤将导致损伤大脑和与此有关的神经元缺陷。
为了补偿神经传递过程中的缺陷，如今已将描述的神经变性疾病和神经精神障碍的治疗直接指向了各种不同的膜受体。实际上，在神经病理学疾病如局部缺血、脑中风和兴奋毒性的动物模型中用血清素化合物有可能达到神经保护的效果。在某些情况下，对感情障碍如抑郁症或焦虑症也可能观察到有益的效果。这里要提及的例子是5-HT1A激动剂，如丁螺环酮或被表征为选择性的5-HT1A受体配体的化合物8-羟基-2-(二-正丙基氨基)-1，2，3，4-四氢化萘(8-羟基-DPAT)。然而这些化合物仅在有限的程度上减少神经系统的缺陷，现阶段仍无有效疗法。
发明内容
因此本发明的目的是使有足够效应和较少副作用的治疗神经病理学障碍成为可能。
令人惊奇的是，现已发现通过有目的的应用对5-HT5受体有结合亲和性的物质可能治疗上述疾病及有关适应症、症状和机能不良。
因此本发明的一个主题是5-HT5受体的结合配偶体在制备治疗神经病理学障碍及有关适应症、症状和机能不良的药物中的应用。
按照本发明，神经病理学障碍被理解为伴有神经系统缺陷的疾病，即具有神经系统缺陷症状的特征的疾病。按照本发明，术语“障碍”的意义为通常被看作病理状态×和以某种征兆、症状和/或机能不良的形式呈现的异常。本发明的治疗可直接针对单一障碍，即异常或有病的状态，但很多相互因果关联的异常可被概括为式样(Muster)，即综合症，可按本发明治疗。
这种状态可以是暂时存在的、进行性的或持续性的。
按照本发明，神经变性和/或神经精神障碍的治疗是优选的。这些障碍特别是神经病理学疾病常出现引起大脑损伤的综合症，例如大脑缺血、中风、癫痫和一般的发作、慢性精神分裂症、其它精神病、痴呆尤其是阿尔茨海默痴呆、脱髓鞘疾病尤其是多发性硬化以及脑肿瘤。本发明的主题特别也是5-HT5受体配偶体在治疗这些上述类型的、其形成和/或病程与5HT5受体有关，即由5-HT5受体活性调节的疾病中的应用。
根据本发明的另一个方面，治疗那些伴有神经胶质细胞反应的神经病理学障碍。本发明的应用特别涉及神经胶质细胞反应的调节。
结合配偶体的有利的作用表现在预防或急性治疗神经系统的缺陷中，这一缺陷可以在患有精神病学疾病的患者中观察到例如癫痫、精神病例如急性外原反应型精神病或器质性的或者外原性原因如创伤，尤其是大脑损害和弥散性大脑损伤之后伴发的精神病，表现为代谢紊乱、感染和内分泌疾病；内源性精神病，如精神分裂症及分裂模式和妄想障碍；感情障碍，如抑郁症、躁狂和躁狂抑郁状态；以及上述精神病的混合型；老年痴呆和阿尔茨海默型老年痴呆，以及在脱髓鞘疾病过程的治疗或者预防中。
按照本发明的结合配偶体是有效的，特别是治疗局部缺血性损伤，例如大脑和脊髓的损伤及血管堵塞或心力衰竭引起的。
这里特别要提到的是中风(同义词：大脑出血、大脑或中风性损害、脑中风)。短暂的局部缺血发作、可逆性局部缺血神经学缺陷、延长的可逆性局部缺血神经学缺陷、部分可逆性局部缺血神经症以及持续完全性的脑梗塞可按本发明治疗，本发明的治疗对急性病特别有利。
下面所列的神经组织中的一种或多种变化是按本发明优选治疗的神经病理学障碍的类型：神经元，特别是神经节细胞的退化或死亡，如虎斑溶解、核膜的模糊、质壁分离、细胞质的空泡形成和空壳形成、大脑的实质坏死、脑水肿、由缺氧引起的神经元变化、萎缩、形态学的变化，如脱髓鞘作用，特别是髓鞘崩解、血管周围的浸润、神经胶质的增殖和/或神经胶质的瘢痕形成；黑质退化。
按本发明治疗的适应症的特征通常为进行性发展，即上述疾病随时间的推移发生变化，一般说来，严重程度增加和任意的交错转移或者进一步的状态加入到已有的状态中。
通过按本发明治疗神经病理学障碍或构成这些障碍的基础的状态可治疗许多其它的、与神经病理学障碍有关的，即特别是伴随上述疾病状态的征兆、征状和/或机能不良。这包括例如休克肺、脑神经丧失如脑桥后神经炎、眼肌麻痹、言语断续、痉挛性麻痹、小脑症状、过敏、膀胱和直肠障碍、欣快、痴呆、过度-和运动不能、缺少联带运动、小步步态、躯干和肢体的弯曲姿势、前-，后-，和侧步横行、震颤、缺少面部表情、单调的语言、抑郁、情感淡漠、易变的或刚硬的易感性、受损的自发性和决断力、迟钝的思考、差的社交能力；肌肉萎缩症。
本发明治疗的含义不但包括治疗急性或慢性征候、症状和/或机能障碍，而且包括预防性治疗(预防)，特别是预防复发或阶段性预防。治疗可以从症状上实施，譬如抑制症状。治疗可以是短期治疗，中期治疗，或也可以是长期治疗，譬如在维持治疗中。
术语“5-HT5受体结合配偶体”描述的是与5-HT5受体结合并也被称为5-HT5受体配体的物质。
结合的意思可理解为结合配偶体和受体之间任何的分子相互作用，特别是在生理条件下。通常，这些相互作用为常规的相互作用，包括静电吸引、氢键、疏水键、范得华力或类金属络合物配位键。除上述相互作用外，结合配偶体和受体之间的可逆分子相互作用、非可逆相互作用也是可能的，如共价键。
按照一种实施方案，本发明所用的结合配偶体竞争性地抑制参比结合配偶体如5-HT(5-羟色胺)或5-CT(5-甲酰氨基色胺)与5-HT5受体的结合。
竞争性抑制理解为本发明所用的结合配偶体与参比结合配偶体，在本文中例如是5-HT或5-CT，对受体的竞争，即一种结合配偶体的结合阻止了其他结合配偶体的结合。
按照另一实施方案，本发明所用的结合配偶体非竞争性地抑制参比结合配偶体如5-HT(5-羟色胺)或5-CT(5-甲酰氨基色胺)对5-HT5受体的结合。
非竞争性抑制理解为本发明可用的结合配偶体通过与受体结合调控参比结合配偶体，在本文中例如是5-HT或5-CT的结合，特别是降低其结合亲和力。
至少在竞争性抑制的情况中，即在可逆性结合的情况中，主要通过用另一种结合配偶体抑制一种结合配偶体，这种抑制随着一种结合配偶体的结合亲和力的降低或另一种结合配偶体对受体的结合亲和力的提高而增加。因此，有利的是，本发明所用的结合配偶体对5-HT5受体具有高结合亲和力。这样的结合亲和力能够一方面有效抑制5-HT5受体的天然结合配偶体，例如血清素(5-羟色胺，5-HT)自身，其中本发明所用的结合配偶体在使特定量的这种结合配偶体与5-HT5受体结合时所必需的浓度随着结合亲和力的增大而降低。对于医学应用，优选的结合配偶体具有高的结合亲和力以使它们可以在有效医疗过程中作为活性化合物以合理量给药。因此，本发明所用的结合配偶体优选以约0.01至100mg/kg体重且特别是约0.1至15mg/kg体重的日剂量非肠道给药，和1-30mg/kg体重的日剂量口服给药。
上述竞争试验提供了表达结合亲和力的一种可能性，利用这些试验可以测定出本发明结合配偶体在受体结合位点替代半数的另一种参比结合配偶体的体外浓度(IC50值)。因此，5-CT对5-HT5受体的结合的竞争性抑制也可以用来评估本发明可优选使用的结合配偶体的效果，其具有的半数最大抑制常数IC50小于10-5M，优选小于10-6M和特别是小于10-7M。
本发明可应用的结合配偶体的结合亲和力也可以用抑制常数Ki来表示，其一般同样利用体外竞争性试验测定。对于5-HT5受体的结合，本发明应用的结合配偶体优选具有小于10-5M、更优选小于10-7M和特别优选小于10-8M的Ki值。本发明可用的化合物的Ki值是在例如1·10-7M至7·10-7M的范围内或在1·10-8M至1·10-7M范围内。
可用的结合配偶体可以靠比结合到5-HT5受体以外的特异性受体低的，基本相同的，或高的亲和力结合到5-HT5受体上。
因此，本发明所用的5-HT5受体的结合配偶体特别包括那些其对5-HT5受体的亲和力比对5-HT1受体、特别是5-HT1A、5-HT1B和/或5-HT1D的亲和力高致使其适合用于本发明的结合配偶体。这不一定是以相对更加有选择地结合5-HT5受体为条件，而那些5-HT5受体的选择性结合配偶体是本发明的一种具体实施方案。
譬如，可以利用对5-HT5受体和5-HT1受体、特别是5-HT1A、5-HT1B和/或5-HT1D具有高亲和力的结合配偶体。高亲和力在此处是指Ki值一般在1·10-9M至1·10-6M内。按照一个具体实施方案，在该高亲和力范围中，可利用的结合配偶体对于5-HT类受体具有一种结合特性，该特性的特征在于对于5-HT5受体的结合亲和力和该范围的其他结合亲和力相比基本上相同或略微小。优选等于或小于10倍。
按本发明可用的选择性的结合配偶体具有的对5-HT5受体的结合亲和力大于对不同于5-HT5受体的一种或多种5-HT受体的结合亲和力，即尤其是划归为上述5-HT受体类的5-HT1、5-HT2、5-HT3、5-HT4、5-HT6和5-HT7受体。如果一种结合配偶体对5-HT5受体的结合亲和力大于对于不同于5-HT5的5-HT受体的结合亲和力，我们说这种结合配偶体相对于不同于5-HT5的5-HT受体选择性的结合在5-HT5受体上。特定的结合配偶体是那些对5-HT5受体的结合亲和力大于对至少一种且特别是全部5-HT1受体，尤其是5-HT1A、5-HT1D和/或5-HT1B受体的结合亲和力的那些结合配偶体。对5-HT5受体的结合亲和力大于不同于5-HT5的所有5-HT受体的结合配偶体构成另一特殊种类的本发明结合配偶体。
选择性的意思可理解为优选结合到5-HT5受体的结合配偶体的性能。
决定上述选择性的是，一方面对5-HT5受体的结合亲和力和另一方面对不同于5-HT5的一种或多种5-HT受体结合亲和力足够不同。按照结合亲和力比优选结合亲和力差异至少为2、适宜至少为5、特别适宜至少为10、优选至少为20、特别优选至少为50和特别至少为100。
按照另一实施方案，本发明所用的结合配偶体以上述较好结合亲和力，相对于一种或多种除5-HT5之外的5-HT受体选择地结合到5-HT5受体上。
按照本发明的另一实施方案，本发明所用的结合配偶体以上述结合亲和力，相对于除5-HT5之外的所有5-HT受体选择地结合到5-HT5受体。
以上述具有亲和力和选择性与5-HT5受体结合的结合配偶体特别适宜，该5-HT5受体是通过神经胶质细胞、特别是星状胶质细胞表达的。
按照本发明，人受体变体对于本发明所用的结合配偶体是优选的靶标。
本发明结合配偶体与5-HT5受体的结合和效应器功能连接。结合配偶体可以起激动或拮抗和部分激动和/或部分拮抗作用。
激动剂被视为是完全或部分模拟5-HT对5-HT5受体的活性的本发明化合物。
拮抗剂被视为是阻断5-HT对5-HT5受体的激动活性的本发明化合物。
按照本发明的优选实施方案，可以利用结合配偶体，其至少与h5-HT5-转染CHO细胞的5-HT5受体的结合能够引起与膜键合G蛋白结合的GTP的激动剂诱导性刺激的变化，引起细胞内钙水平的变化，引起磷脂酶C活性的激动剂诱导性感应和/或cAMP生产中的变化。就细胞内钙水平改变来说，引起细胞内钙水平增高的结合配偶体的应用是本发明的一个具体实施方案。
该实施方案也包括在已知的动物模型上对神经变性病和神经精神病的变化过程有活性的结合配偶体。
优选的结合配偶体是那些对上述关于其效应器功能的5-HT5受体也有选择性的结合配偶体。
本发明所用的化合物例如在DE 197 24 979.5中被描述，它们是式I的3-取代3，4，5，6，7，8-六氢吡啶并[3’，4’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物和其生理上可接受酸的盐

其中
R1为氢原子、C1-C4烷基、乙酰基、苯基C1-C4烷基，其中的芳环是任选被卤素、C1-C4烷基、三氟甲基、羟基、C1-C4烷氧基、氨基、氰基或硝基取代的、或为苯基烷酮基，其中的苯基可以被卤素取代，
R2为可任意被卤原子、C1-C4烷基、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、C1-C4烷氧基、氨基、单甲基氨基、二甲基氨基、氰基或硝基单-或二取代的苯基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基，并且这些基团可任选稠合到可任选被卤原子、C1-C4烷基、羟基、三氟甲基、C1-C4烷氧基、氨基、氰基或硝基单-或二取代并且可任选包含一个氮原子的苯环上，或融合到可包含1～2个氧原子的5-或6元环上，
A为NH或氧原子，
Y为CH2、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2或CH2-CH，
Z为氮原子、碳原子或CH，其中Y和Z之间的键也可是双键，以及n为2，3或4。
按本发明可用的其它化合物，例如在DE 196 36 769.7中所描述。它们是式I的3，4，5，6，7，8-六氢吡啶并[4’，3’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶衍生物和其生理上可接受酸的盐

其中
R1为氢原子、C1-C4烷基、乙酰基或苯甲酰基、苯基C1-C4烷基，其中的芳环是任选被卤素、C1-C4烷基、三氟甲基、羟基、C1-C4烷氧基、氨基、氰基或硝基取代的、或为萘基C1-C3烷基、苯基C2-C3烷酮基或苯基氨基甲酰基C2烷基，其中的苯基可被卤素取代，
R2为可任选被卤原子、C1-C4烷基、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、C1-C4烷氧基、氨基、单甲基氨基、二甲基氨基、氰基或硝基单-或二取代的苯基、吡啶基、嘧啶基或吡嗪基，并且这些基团可任选稠合到可任选被卤原子、C1-C4烷基、羟基、三氟甲基、C1-C4烷氧基、氨基、氰基或硝基单-或二取代并且可任选包含一个氮原子的苯环上，或融合到可包含1～2个氧原子的5-或6元环上，
或者可被苯基C1-C2烷基或苯基C1-C2烷氧基取代，其中的苯基可被卤素或甲基、三氟甲基或甲氧基取代，
A为NH或氧原子，
B为氢或甲基，
C为氢、甲基或羟基，
X为氮原子，
Y为CH2、CH2-CH2、CH2-CH2-CH2或CH2-CH，
Z为氮原子、碳原子或CH，其中Y和Z之间的键也可是双键，
以及n为2，3或4。
5-HT5特异性抗体也可用作5-HT5结合配偶体。它们可以是多克隆抗血清、单克隆抗体、抗体片段，如F(ab)、Fc等、嵌合和重组抗体。这些抗体可用本身已知的方式制备。作为免疫原，5-HT5受体可被用作免疫原或其抗原，通常用其与常用的载体蛋白偶合的片段。
更低分子量的5-HT5结合配偶体通常为合成化合物，可被有利的用于许多方面。
Aptamers，即核酸，通常为低聚核苷酸，对5-HT5受体有足够的亲和力，也能被用作结合配偶体。
本发明的应用并不限于上述结合配偶体。更确切的说，与5-HT5受体用上述方式结合的任何物质，按本发明可被用作5-HT5结合配偶体。
试验物质对5-HT受体的结合亲和力的测定方法原则上是已知的。例如，可通过评价参比结合配偶体与5-HT5受体的结合被所研究的物质的竞争性抑制来进行测定。合适的参比结合配偶体是已知的5-HT受体配体，如5-HT或5-CT或LSD。这些配体可方便地标记，以便它们与5-HT受体的结合可用标准方法分析得到。放射性和光学标记是优选的。在有关5-HT5受体的结合试验中，按本发明的5-CT或LSD，特别以[3H]-LSD的形式被应用。结合亲合力可用半数最大抑制常数IC50或抑制常数Ki表达。该方法优选用于初筛。SPA技术或FlashPlate技术优选被应用。
对所研究的结合配偶体的结合作用也可以直接在5-HT受体上测定。表示结合亲和力的抑制常数Ki可以例如通过量热法，即通过测量释放的结合能测定。
借助于已知的功能试验可以定性或定量地测定体外或体内效应器功能。
激动活性的评价可以基于所有由于5-HT和5-HT5受体的结合引起的效应。按照本发明优选评价对GTP和G蛋白的结合对细胞内钙水平、对磷脂酶C活性和/或cAMP产生的作用。这些方法优选用于二级筛选。在此，也适宜采用SPA或FlashPlate技术。
利用GTP的不可水解类似物如[35S]GTPγS可以研究GTP和G蛋白的结合，其结合可以利用放射学方法测定。这种研究方法优选在具有5-HT5受体的膜上进行。
为了测量细胞内钙的水平，可以采用适当的钙探针，通常为钙螯合剂，例如荧光化合物，如Fura 2-乙酰基甲酯或Fluo-3-AM。这个试验优选在具有5-HT5受体的细胞温育物中、特别在个体细胞中进行。
通过催化反应的方式，例如肌醇的掺杂，可以测定磷脂酶C的活性，出于检测目的，优选放射性标记[3H]-肌醇，或通过PPIP2转化为IP3的反应，其中PPIP2也适宜放射性标记成为[32P]PIP2。这些研究适宜在具有5-HT5受体的个体细胞中进行。
cAMP产生可以借助于cAMP结合蛋白测定。该研究适宜在具有5-HT5受体的个体细胞中进行。
如果需要，也测定效应器功能，即本发明结合配偶体对其他5-HT受体的活性。这适宜用来测定对5-HT5和其他5-HT受体的结合亲和力，即特别是选择性。
因此，本发明也涉及本发明结合配偶体的鉴定和表征方法。这些方法和其他类似的适用方法可以成为体外筛选过程的基础，利用上述方法可以从大量不同化合物中筛选出似乎在未来用途中可能最有希望的。例如，可以利用组合化学来建立含有无数潜在活性化合物的大型物质库。可以从组合物质库自动筛选出具有预期活性的物质。各优选排列在微孔滴定板上的试验的有效分析可以利用自动筛选机。因此，本发明也涉及筛选方法，即初级和二级筛选方法，其中有效采用至少一种下列方法。如果利用多种方法，可以不同时或同时对被试验物质的相同样品或不同样品进行分析。
完成此类处理的一种特别有效的技术是闪烁接近测定法，简称为SPA，这种技术在活性化合物筛选的领域中业已被公认。开展这项技术的试剂盒和组件可以商购获得，譬如由Amersham PharmaciaBiotech得到。原则上说，是将溶解的或膜键合的受体固定在含有闪烁剂的小荧光微球上。譬如，如果放射性配体结合在固定受体上，激发闪烁剂发光，因为闪烁剂和放射性配体之间在空间上是接近的。
进行此类处理的另一种特别有效的技术是活性化合物筛选的领域中已知的FlashPlateR技术。开展这项技术的试剂盒和组件可以商购获得，例如由NENR Life Science Products得到。这种技术的原理是基于微量滴定平板(96孔或384孔)，孔用闪烁剂涂层。
上述方法是所属领域技术人员已知的。
本发明的第一种方法用于测定结合配偶体对5-HT5受体的亲和力和/或选择性。鉴于此目的，令结合配偶体和5-HT5受体接触并且测定结合亲和力。
对于选择性的测定，所研究的结合配偶体与其它5-HT受体的结合亲和力可用相同的方法测定(如果需要的话，用对各自的受体的特异性配体)并比较所得数值。
本发明的另一种方法涉及结合配偶体对5-HT5受体的活性，即激动、部分激动、拮抗和/或部分拮抗作用的测定。鉴于此目的，令结合配偶体和5-HT5受体接触并且评价这种结合所产生的作用。
按照一种优选实施方式，通过用上述的[3H]-5-CT或[3H]-LSD竞争试验测定其对5-HT5受体的结合亲和力对结合配偶体进行初级筛选。随后，通过和上面相同的方式，特别是有关GTP结合和/或细胞内钙水平，通过评估其效应器功能对那些抑制常数IC50等于或小于10-6M的结合配偶体进行二级筛选。最后，通过按照基本上和上面相同的方式-但任选利用对各受体具有特异性的配体测定其对其他5-HT受体的结合亲和力可对由这种方式选择出的结合配偶体进行反向筛选来测定选择性。例如，5-HT1A受体的结合研究可以采用[3H]-8-羟基二丙基氨基四氢萘([3H]-8-DPAT)，而5-HT1B和5-HT1D受体可以用[3H]-5-CT研究。
5-HT5受体优选以细胞体系的形式使用，即使用携带5-HT5受体的膜、细胞、细胞集落、组织或器官。此类的细胞体系天生可以表达5-HT5受体，但也可以通过遗传操作如转染诱导它们表达5-HT5.在本发明的优选实施方案有关h5-HT5的内容中，Rees S.等FEBSLetters 335：242-246(1994)所述编码序列可以特别用作这种形式(登记号X81411)。人神经胶质瘤细胞系是优选的具有5-HT5受体的天然细胞系。在h5-HT5-转染异源细胞系中，优选稳定表达h5-HT5基因的那些。可以提及的例如是，h5-HT5-转染CHO细胞，h5-HT5-转染人肾细胞，特别是h5-HT5-转染HEK293细胞，或h5-HT5-转染的C-6神经胶质瘤细胞。
为了测定本发明结合配偶体的选择性、亲和力和活性，也可以利用脑组织切片和由脑部获得的天然膜。如果采用放射性标记，组织切片的评估优选通过放射自显影法进行。
神经保护作用优选在神经变性病和神经精神病过程的动物模型上进行测定。
优选的动物模型是多梗塞的脑中风和脑疾病模型，例如由于颈动脉或中脑动脉(MCA堵塞)的局部缺血、前脑局部缺血和缺氧耐受试验；抗焦虑模型，例如活性化合物诱导的惊厥、电震或隔离诱导的攻击行为；抗癫痫活性模型，例如电震、活性化合物或噪音引诱的攻击和遗传模型、促中毒的神经变性模型和脱髓鞘模型。
在治疗范围中，按照本发明的5-HT5结合配偶体的应用包括一种方法。在这种方法中，通常根据制药和兽医实践配制，给予被治疗个体，优选哺乳动物，特别是人、可食用动物或宠物服用有效量的一种或多种5-HT5结合配偶体。该治疗是否合适和按什么方式进行皆取决于个体情况和接受的医学评价(诊断)，涉及出现的征候、症状和/或机能障碍，危险性将恶化为某些征候、症状和/或机能障碍，以及其他因素。
通常，通过每天给药一次或反复给药进行上述治疗，如果适宜可以和其他活性化合物或含有活性化合物的制剂合用或代替它们，从而给被治疗个体施用约0.001g至10g，优选约0.001g至约1g的日剂量。
本发明也涉及治疗个体、优选哺乳动物、特别是人、可食用动物或宠物的药物组合物的制备。本发明的结合配偶体常常以药物组合物的形式给药，所述药物组合物含有可药用的赋形剂和至少一种本发明的抑制剂，并且如果需要，还含有其他活性化合物。这些组合物可以通过例如口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌肉内或鼻腔途径给药。
适用的药物组合物实例是固体药剂，如粉剂(Pulver)、药粉(Puder)、颗粒剂、片剂、软锭剂、小药囊、囊剂(Cachets)、糖衣药丸、胶囊(如硬和软明胶胶囊)、栓剂或阴道药物形式；半固体药物形式，如软膏、霜剂、水凝胶、糊剂或贴剂；和液体药物形式，例如溶液、乳液，特别是水包油乳液、混悬液，如洗剂、注射和输注制剂，滴眼液和滴耳液。植入给药装置也可以用来施用本发明的结合配偶体。此外，还可以利用脂质体、微球或聚合物骨架。
在组合物的制备中，本发明的结合配偶体常常和赋形剂混合或用赋形剂稀释。用作活性化合物的载体或介质的赋形剂可以是固体、半固体或液体材料。
适用的赋形剂包括，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、淀粉类、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。此外，制剂可以含有可药用的载体或常规助剂，例如润滑剂，如牛油、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化和助悬剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和其丙酯；抗氧剂；抗刺激剂；螯合剂；包衣助剂；乳液稳定剂；成膜剂；胶凝剂；异味掩蔽剂；矫味剂；树脂；水胶体；溶剂；增溶剂；中和剂；渗透促进剂；颜料；季铵类化合物；再脂化和多脂化剂；软膏、霜剂或油基质；聚硅氧烷衍生物；涂布辅剂；稳定剂；灭菌剂；栓剂基质；片剂助剂，如粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或包衣剂；发酵剂；干燥剂；混浊剂；增稠剂；蜡；增塑剂；白油。有关实施方案是以专业知识为基础的，例如，如Fiedler，H.P，，Lexikon derHilfsstoffe für Pharmazie，Kosmetik und angrenzendeGebiete(药学、化妆品和有关领域的赋形剂大全)，第4版，Aulendorf：ECV-Editio-Kantor-Verlag，1996所述。
具体实施方式
本发明通过下列实施例进行详细的说明，但本发明不限于这些实施例。
参比实施例1
h5-HT5受体表达的HEK293细胞和CHO细胞
按照已知方式从人类组织中利用3’-5’-RT-PCR法(RACE体系，Boehringer Mannheim)分离出人5-HT5受体的编码基因。随后，将该基因序列插入携带新霉素耐受基因的质粒(pcDNA3；Invitrogen，德国)中并且在大肠杆菌中按照制造商的说明进行放大。将所得的质粒标本和(Gibco Life-Sciences，德国)混合，在温育皿(2.5cm)中用这种转染混合物的薄层培养HEK293细胞。随后用含新霉素的培养基更换转染混合物。进一步在DMEM-F12培养基中培养存活的细胞，该培养基中补充有10％胎牛血清、2mM谷酰胺和抗生素(90mg的链霉素、90mg的青霉素)。在5％CO2、95％空气湿度和37℃下令细胞生长至融合。
按照类似方法获得h5-HT5受体表达的CHO细胞。
参比实施例2
细胞膜的制备
在此所用方法基本上按照由细胞制备细胞膜的已知方法(Findlay J.B.C.&Evans W.H.，Biological Membranes，PracticalApproach(1987))。由培养瓶的表面小心地刮擦下按照参比实施例1培养的细胞并且以180xg在DMEM-F12培养基中离心10分钟。将所得细胞沉淀重新悬浮在含有5mM EDTA、5mM EGTA、0.1mM PMSF和3mM苯甲脒的5mM Tris-HCl缓冲液(pH：7.6；缓冲液A)中，并在4℃下温育15分钟。该细胞混悬液在UltraturraxR(15,000rpm)中匀浆(6×3S)并且在1000xg和4℃下离心1分钟。将沉淀重新悬浮在缓冲液A中，并且按照上述方法匀浆和离心。收集由上述两步获得的上清液，在40,000xg和4℃下离心20分钟。将沉淀在缓冲液A中重新悬浮并匀浆(1×15s)。膜混悬液在40,000xg和4℃下离心20分钟。令所得沉淀重新悬浮在含有10％甘油和1％牛血清白蛋白的缓冲液A中。冷冻试样并且保存在-80℃下直至使用。
参比实施例3
[3H]-5-CT的饱和结合的动力学
方法基本上已知(Ress S.等FEBS Letters 335：242-246(1994))。按照参比实施例2所得的膜(200μl)以600μl的总体积在含有1mM EDTA的100mM tris-HCl(pH：7.7；缓冲液B)中温育，同时提高[3H]-5-CT(96Ci/mmol)的浓度，加入10μM美赛西平用于测定特异性结合，同时在测定总结合时不加入美赛西平。混合物在30℃下温育90分钟。随后，利用SkatronR过滤系统并内嵌0.3％聚乙烯亚胺的GF/B滤纸过滤样品。4℃下用9ml的缓冲液B洗涤滤纸。利用5mL的ultima-Gold(Parkard)通过液体闪烁计数测定残留在滤纸上的放射性。
参比实施例4
a)[3H]-5-CT的结合竞争
有关结合竞争的试验基本上按照已知试验(Rees等，1994)进行。在2nM[3H]-5-CT的存在下、以600μl的总体积在缓冲液B中温育实施例2所得的膜(200μl)，同时提高所选化合物的浓度。30℃下温育75分钟后，4℃下经内嵌0.3％聚乙烯亚胺的GF/B滤纸过滤含缓冲液B的样品。滤纸用9mL的缓冲液B洗涤。按照参比实施例3所述方法测定滤纸上残留的放射性。总结合被定义为不加入其他化合物时观察到的放射性配体的结合。非特异性结合是10μM美赛西平存在下观察到的[3H]-5-CT的结合。也可以采用类似的体系，通常采用微量滴定板，获得高样品通量和二级筛选。
通过非线性回归分析并且由线性图利用SigmaPlot软件(JandelScientific，德国)测定[3H]-5-CT结合的饱和参数。建立竞争曲线，其中放射性结合表示为总结合的百分比。利用非线性回归分析的方式测定半数最大抑制常数IC50和Hiil系数(nH)。
b)利用闪烁平板(FlashPlate)技术通过HTS鉴别h5-HT5受体配体
由Bio Signal Inc。(加拿大)可以获得用h5-HT5膜涂层的96孔闪烁平板。[3H]-LSD用Tris HCl缓冲液中稀释到适当浓度，该缓冲液中含有10mM MgCl2、0.5mM EDTA和0.5％的BSA。将放射性配体溶液加入孔内(25mL)，孔内含有试验化合物或不含有试验化合物。室温下将平板温育180分钟，用微量β计数器(Wallac)测定放射性信号。利用美赛西平测定非特异性结合。[3H]-LSD具有12nM的亲和力。随着试验化合物的结合亲和力增高，[3H]-LSD的放射性信号减弱。
参比实施例5
[35S]GTPγS结合的激动剂诱导性刺激的测定
[35S]GTPγS结合试验方法是已知的。该试验按照Hilf，G.和Jakobs，K.H.以前所述方法(Eur.J.Mol.Pharmacol.225：245-252(1992))进行。测定活性化合物诱导的[35S]GTPγS结合HEK293细胞膜的变化，该HEK293细胞用h5-HT5受体基因稳定转染(参见参比实施例1和2)。用含有6.75mM MgCl2、150mM NaCl、1mMDTT、1mMEDTA、10μM GDP和[35S]GTPγS的50mM三乙醇胺HCl缓冲液(pH：7.5)温育细胞膜(12μg)。在加入或不加入试验活性化合物和30℃下温育60分钟后，试验混合物(100μl)快速经GF-B滤纸、利用SkatronR过滤装置过滤。滤纸迅速用含有100mM NaCl和5mM MgCl2的50mM trisHCl缓冲液(9ml；pH：7.5；4℃)洗涤。通过闪烁光谱测定法、利用Ultima Gold闪烁液测定滤纸上残留的放射性。可以采用获得高通量和二级筛选的类似系统，例如应用微量滴定平板。
活性化合物的活性表示为在活性化合物不存在下测定的基础结合的百分比。利用非线性回归分析的软件(Sigmaplot，JandelScientific，Germany)、按照通用公式E＝(L*Emax)/(L+EC50)绘出曲线，其中E是效价，L是配体浓度，Emax是最大效价和EC50是产生半数最大效价时的浓度。
参比实施例6
细胞内钙水平的激动剂诱导性变化的测定
方法是已知的(Kao J.P.Y，，Methods in Cell Biology40：155-181(1994))。如参比实施例1所述，h5-HT5受体表达HEK293细胞在培养瓶中生长。在它们融合之前小心地刮下细胞。通过在室温下用Fura2-乙酰基甲酯(Sigma)温育用Fura2标记细胞。细胞在180xg下离心10分钟并重新悬浮在不含有血清的DMEM-F12培养基中，在37℃、5％CO2和95％大气湿度下温育45分钟。
用荧光显微镜测定细胞内钙水平，该显微镜安装有合适的滤光交换系统(Olympus/Hammamatsu)。用ArgusR软件测定荧光比(340nm/380nm)。短时间观察不加入活性化合物的各细胞的细胞内钙水平，在加入试验活性化合物后30分钟再进行观察。另外可以采用获得高通量和二级筛选的类似系统，如微量滴定平板的使用。
类似地，在HTS中可以评估细胞内Ca2+水平的调节。因此，将h5-HT5受体表达CHO细胞在96孔平板(30,0000-80,000个细胞/孔)中温育过夜。用含有1mM Fluo-3-AM、10％普卢兰尼克酸(Pluronicacid)和2.5mM丙磺舒的HEPES缓冲液标记和洗涤细胞1小时。向各孔中加入试验化合物。为了测定钙水平，利用荧光测定操作平板读数器(Fluorometric Imaging Plate Readerl；FLIPR)读取荧光强度。
参比实施例7
激动剂诱导的磷脂酶C活性的测定
方法基本已知(Garcia-Ladona F.J.等，Neuroreport 4：691-694(1993))。细胞和0.125μM[3H]肌醇温育24小时。除去温育基中的未掺杂[3H]肌醇并且用含有10mM LiCl的Krebs-Henseleit缓冲液更换。温育10分钟后，加入被试验活性化合物。45分钟后，用蒸馏水更换刺激温育基来终止该反应。如果采用组织样本，可利用类似的方法(Garcia-Ladona等，1993)。冷冻细胞且保存在-80℃下。用已知的色谱方法测定[3H]肌醇单磷酸酯的产生。类似方法也可以采用组织小棱镜(miniprism)。按照参比实施例2所述，以类似方式通过制备膜级分，并且用[32P]PIP2和活性化合物温育，可以测定磷脂酶C的刺激作用。在这种情况中，可以测试出IP3的产生。也可以优化已知方法以便利用基于微量滴定平板的系统。市售的原料可以进一步扩展到用于高通量试验和进行二级筛选。
参比实施例8
cAMP产生中激动剂诱导性变化的测定
该方法基本已知(Strada S.S.等，Methods inNeurotransmission receptor analysis：89-110(1990))。细胞在不含有血清和抗生素的温育基中温育10分钟。15分钟将温育基加热到95℃下从而终止反应。冷冻细胞样本且保存在-80℃下。利用市售试剂盒、采用cAMP结合蛋白测定cAMP水平。可以优化已知方法以使用基于微量滴定平板的系统。商购获得的原料可以进一步扩展到用于高通量试验和进行二级筛选。
参比实施例9
组织制备
活性化合物给药(口服、腹膜内、静脉内或脑室内)后90分钟，将试验动物断头。从头盖骨迅速取出整个大脑，干冰冷冻并且保存在-80℃下。在-20℃的低温恒温器中得到大鼠脑切片(15μm)，涂布在明胶涂层的载玻片上并且保存在-30℃下直至使用。
参考实施例10
神经保护作用：MCA堵塞
试验化合物的神经保护活性通过在标准模型上实验产生脑中风进行研究。实验用雄性Long Evans大鼠进行。在一氧化二氮助卤乙烷麻醉下切断中脑动脉(MCA)并如文献中所述永久结扎末端。在MCA堵塞后22小时测量所得的梗塞体积。
参考实施例11
神经保护作用：大鼠的试验性脑损伤
应用外侧流体叩击法(McIntosh TK，Neoroscience 28，233 244，1989)以便使大鼠产生适用于测试潜在的神经保护物质的试验性脑损伤。应用该技术能在冲击部位包括新的大脑皮层、海马和丘脑下面形成可调节的和永久的组织损伤。
将麻醉的大鼠的头颅骨的右顶颞区域暴露出来。将颅骨通过顶叶皮层穿孔(约4mm直径)，硬脑膜保持完好。用牙骨质通过穿孔将路厄锁附着物固定到颅骨上。等牙骨质硬化后按McIntosh的方法将大鼠连结在流体叩击仪上。这是由一个装有0.9％的NaCl的圆筒组成，圆筒的一端用活塞密封，另一端通过压力转换器连接到路厄锁附着物上。这样，与大鼠连结的零件被封闭以使靠近硬脑膜形成液柱。让金属摆锤从预定的高度冲击活塞以使受压的液柱短暂地对大鼠大脑表面造成冲击。所使用的压力为2.5-2.9巴。
在外伤后14天将大鼠杀死以取下大脑，在大脑被固定后在冷冻切片机上制备30mm厚的切片并用甲苯胺-蓝染色。为量化神经元的破坏程度，计数喙海马两侧的细胞。测定齿状回中受伤的(右侧)和另一侧(左侧)未受损的细胞的比例。给出同侧海马中细胞数的系数和异侧海马中的数量。
参考实施例12
测试的结合配偶体的合成
a)3，4，5，6，7，8-六氢-7-甲基-3-[2-(4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪-1-基)乙基]吡啶并[4’，3’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮×2HCl(化合物A)
该化合物是通过在惰性溶剂如乙醇中回流加热2-乙氧基亚甲基氨基-3-氰基-6-甲基-4，5，6，7-四氢噻吩并[2，3-c]吡啶或2-乙氧基亚甲基氨基-3-乙酯基-6-甲基-4，5，6，7-四氢噻吩并[2，3-c]吡啶与1-(2-氨基乙基)-4-(3-三氟甲基苯基)哌嗪制备的。处理反应混合物，用盐酸的乙醚溶液沉出产物，熔点309-312℃。
另一种制备的可能性为先在惰性溶剂如乙醇中回流加热上述原料与乙醇胺。处理完反应混合物后得到的3，4，5，6，7，8-六氢-3-(2-羟基)乙基-7-甲基吡啶并[4’，3’：4，5]噻吩并[2，3-c]嘧啶-4-酮与例如氯化亚砜反应以引入合适的离去基团，以使得到的3，4，5，6，7，8-六氢-3-(2-氯)乙基-7-甲基吡啶并[4’，3’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮与N-(3-三氟甲基苯基)哌嗪在惰性溶剂如二甲苯中在碱性条件(如碳酸钾)下反应并在处理完反应混合物后得到目的化合物。
b)3，4，5，6，7，8-六氢-6-乙基-3-[2-(4-(1-萘基)哌嗪-1-基)乙基]吡啶并[3’，4’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮×2H2O(化合物B)
制备主要如制备化合物A的方法进行。
在惰性溶剂如乙醇中回流加热2-乙氧基亚甲基氨基-3-乙酯基-5-乙基-4，5，6，7-四氢噻吩并[3，2-c]吡啶与1-(2-氨基乙基)-4-(1-萘基)哌嗪。处理反应混合物并将其转化成盐酸盐，分离出产物，熔点298-300℃。
另一方面，也可以使3-(2-氯乙基)-6-乙基-3，4，5，6，7，8-六氢吡啶并[3’，4’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-4-酮与N-(1-萘基)哌嗪在惰性溶剂如二甲苯中在碱性条件下反应。
c)3，4，5，6，7，8-六氢-7-甲基-3-[2-(4-(7-甲氧基萘-1-基)哌嗪-1-基)乙基]吡啶并[4’，3’：4，5]噻吩并[2，3-d]嘧啶-2-酮×2HCl×2H2O(化合物C)
制备可类似于制备化合物A的方法进行。
化合物A，B和C及其制备中所需的中间体是已知的或者可按文献中描述的制备方法用类似的原料合成(F.Sauer和P.Stanetty，Monatsh.Chem.(1975)，106(5)，1111-1116；K.Gewald等，Chem.Ber.99，94-100(1966)，专利申请DE 196 26 769.7和DE 197 24979.5)。
实施例1
按照参比实施例3，测定[3H]-5-CT对5-HT5受体的结合亲和力。图1表示键合[3H]-5-CT作为[3H]-5-CT浓度的函数。测定出离解常数Kd＝0.570nM。根据克隆细胞系，受体结合密度(B)在900-28,000fmol/mg蛋白质的范围内变化。
实施例2
按照参比实施例4，通过[3H]-5-CT结合竞争测定5-羟色胺化合物的结合亲和力。利用得到的IC50值确定下列化合物的抑制常数Ki(Ki＝IC50/(1+C/Kd))，其中C是[3H]-5-CT的浓度并且按照实施例1)测定Kd：
  化合物  Ki[M]  R(+)-8-OH-DPAT  1.25·10-7  5-CT  1.44·10-9  化合物A  6.61·10-7  化合物B  1.24·10-7  化合物C  2.37·10-7
实施例3
按照参比实施例5，研究活性化合物引起的GTP在G蛋白上的结合。5-HT5受体偶联到HEK293的G蛋白上是很明显的。典型的血清素源性的激动剂5-HT和5-CT引起[35S]GTPγS结合中结合到细胞膜上的量高出基质40％以上(见图2)。5-HT5受体需要GDP来通过激动剂调节与G-蛋白的偶联(见图3A)。5-HT的作用是剂量依赖性的(见图4)，EC50为2.6μM。
实施例4
按参比实施例10测试选出的5-HT5结合配偶体的神经保护作用。活性物质在MCA-阻塞90分钟后先大剂量(as a bolus)静注，然后维持输注给药。得到下列结果：

实施例5
按参比实施例11，用外侧流体叩击法造成大鼠的实验性大脑外伤。用海马神经元的存活测定的活性物质的保护作用表示为受伤侧的神经元数与另一侧的神经元数的商；各给出平均值(m)和平均值的平均误差(Sm)。

附图说明：
图1表示键合[3H]-5-CT随[3H]-5-CT浓度的变化。
图2表示5-HT和5-CT对[35S]GTPγS结合的影响。
图3表示GDP对[35S]GTPγS结合的影响。
图4表示5-HT对[35S]GTPγS结合的影响。