一种柠檬酸合成基因的植物表达载体及其应用.pdf

本发明公开了一种提高植物耐铝毒能力的专用载体pPZP211-PrbcS-cs。该载体是含有烟草柠檬酸合成酶(citrate synthase)基因cs的植物表达载体。本发明从烟草中克隆出cs基因，用光诱导型启动子(Rubisco小亚基的启动子)控制它在烟草中过量表达，合成柠檬酸并分泌到细胞外，通过根系进入到土壤中，熬合土壤中的铝离子，减轻酸性土壤中高浓度铝对植物的毒害。实验结果表明转cs基因烟草叶片的柠檬酸合成酶活性是野生型烟草的1～5.5倍。在100～300μm的铝毒胁迫下，转cs基因烟草能分泌较多的有机酸，根系生长较好，对铝毒的耐受性明显增强。本发明的专用载体能提高植物对铝毒的耐受能力，在植物品种尤其是中国南方酸性土壤中种植的作物品种的遗传改良中有很大的应用潜力。

权利要求书
1、  一种重组植物表达载体，其中在植物表达载体中含有烟草cs基因。

2、  权利要求1的重组载体，其中所述植物表达载体的起始载体为pPZP211。

3、  权利要求1的重组载体，其中所述cs基因上游添加有Rubisco小亚基的启动子PrbcS。

4、  权利要求1的重组载体，为pPZP211-PrbcS-cs，在起始载体pPZP211上带有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。

5、  权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：
cA1：5’-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3’
cA2：5’-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3’
5’端引物cA1，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物cA2，末端加XbaI酶切位点；以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到cs的全长cDNA；
(2)回收并纯化cs全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD-cs；
(3)构建中间载体pUC118-PrbcS-*T，用SphI把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(4)将PrbcS启动子连接到cs基因的5’端，用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS-*T，回收cs基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pUC118-PrbcS-cs；
(5)用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，回收纯化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后连接转化，挑选单克隆并抽提质粒，用两组引物进行PCR检测和酶切检测，获得重组载体pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。

6、  一种cs基因，其GenBank登录号为：X84226。

7、  权利要求1的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于：
(1)从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：
cA1：5’-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3’
cA2：5’-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3’
5’端引物cA1，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物cA2，末端加XbaI酶切位点；以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到cs的全长cDNA；
(2)回收并纯化cs全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组载体pMD-cs；
(3)构建中间载体pUC118-PrbcS-*T，用SphI把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(4)将PrbcS启动子连接到cs基因的5’端，用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS*T，并回收纯化cs基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR扩增，获得重组质粒pUC118-PrbcS-cs；
(5)用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，回收纯化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后连接转化，挑选单克隆摇菌并抽提质粒，然后进行PCR检测，获得重组载体pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。

8、  权利要求1-5之一的重组载体在制备耐受铝毒的转基因植株中的应用。

9、  权利要求1-5之一的重组载体在制备耐受铝毒的转基因烟草中的应用。

说明书一种柠檬酸合成基因的植物表达载体及其应用
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种柠檬酸合成基因的植物表达载体，该载体能提高植物耐铝毒能力。
背景技术：
铝是地壳中最常见的元素之一，蕴藏丰富，约占地壳重量的7％，仅次于氧和硅，居第三位，铝同时也是地壳中含量最丰富的金属元素(赵和涛.1996.铝元素与茶树生育和品种的关系.热带作物科技.(3)：33-35)。在中性或弱酸性环境中，铝主要是以固定态的硅酸盐及氧化物的形态存在于土壤中。在酸性环境中，不溶性的铝化物就转变为溶解状态的铝，进入土壤中则对植物产生毒性(Hideaki M.2000.Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higherplants.Int Rev Cytol.200：1-46)。同时酸性土壤中的铝离子还与磷酸根离子形成低溶解性的磷酸铝化合物，从而导致土壤中有效磷含量大大降低。可溶性的铝可以分为以下几类：自由铝、Al(H2O)63+、聚合铝Al13以及及低分子量铝化合物(Kochian LV.1995.Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistancein plants.Annu Rev Plant Physiol Mol Biol.46：479-487)。随着土壤pH值的上升，Al(H2O)63+转变为Al(OH)2+、Al(OH)2+；在中性土壤中，主要以难溶的Al(OH)3形式存在；在碱性条件下则主要是以铝酸盐阴离子Al(OH)4-的形式存在(Hideaki M.2000.Cell biology of aluminum toxicity and tolerance in higher plants.Int Rev Cytol.200：1-46)。不同形态的铝其毒性又有明显的差异。目前一般认为在pH值低于4.5的酸性土壤中，铝主要是以Al(H2O)63+形态存在的，即通常所说的Al3+，而这一形态的铝被认为是对植物毒性最强的形态。
酸性土是典型的低产土壤，其中铝(Al)毒被认为是影响作物生长的主要限制因子。微摩尔水平的铝离子即可对植物产生毒害，而酸性土壤溶液中Al3+的浓度约为10～100μmolL-1(Ma JF.2000.Role of organic acid in detoxificationof aluminum in higher plants.Plant Cell Physiol.41：383-390)。铝毒害的最初反应是抑制铝敏感基因型植物的根系生长，并因此抑制植物对水分、养分的吸收，影响植物的正常生长发育(Delhaize E，Ryan PR.1995.Aluminum toxicityand tolerance in plants.Plant Pysiol.107：315-332；Foy CD.1983.Thepysiology of plant adaptation to mineal stress.Iowa State J Res.57：355-392)。铝毒害最容易识别的症状就是根生长的抑制，并且根尖是铝毒害发生的最初位点。Ryan发现，只有直接对玉米的根尖进行铝毒胁迫处理，根的生长才能被抑制；如果对伸长区或除去根尖的整根
处理，对根的生长没有影响(Ryan PR，Ditomaso JM，Kochian LV.1993.Aluminumtoxicity in roots：an investigation of special sensitivity and to role of the cap.J ExpBot.44：437-446)。
在酸性土壤中铝离子对植物危害的分子机制是多种多样的。一方面，过多的游离铝和交换性铝离子可以通过抑制根尖生长发育，造成植株对其它离子及水分的吸收障碍，从而影响植物的生长发育。另一方面，铝也可以与细胞质中以及膜上蛋白的磷酸基、羟基等极性基团结合，进而影响膜的结构和功能。植物细胞膜在植物吸收水分和养分的过程中起重要作用，而铝可以作用于脂质和蛋白通道，使得这些过程受到抑制。此外，铝还可以启动膜上第二信使扰乱植物的代谢，如铝和钙的相互作用会影响植物的正常生理功能。铝还可以跟很多生物大分子发生络合作用，影响它们的活性。铝可以与钙调蛋白结合，改变其结构并对其功能产生影响；铝可以和DNA结合，增加双螺旋结构稳定性，阻止DNA复制，影响细胞分裂；铝可以和ATP形成Al-ATP复合物，使植物细胞能量代谢过程受到限制。
植物根际溶液中如果存在与Al络合能力很强的配位体，即可以减少溶液中自由Al离子，从而减少其与根细胞结合的机会，缓解Al的毒害。一些有机酸如柠檬酸、草酸、苹果酸、酒石酸、水杨酸、丙二酸等可与Al络合形成稳定的复合物，这些复合物对植物的毒性较低，甚至是无毒的。有机酸与Al结合形成对植物毒性低的Al-有机酸络合物，从而降低了细胞内Al离子的浓度，减少了Al与细胞结构物质结合的机会，因而保护细胞免受破坏；而经根系分泌进入土壤的有机酸与根际中的Al络合，降低根际中Al离子的浓度，从而可以缓解铝毒对植物的危害。有机酸缓解铝毒的能力依赖于有机酸与Al形成的Al-有机酸复合物的稳定系数(Hue NV， Craddock GR，Adams F.1986.Effect of organic acids onaluminum toxicty in subsoils.Soil Sci Am J.50：28-34)。研究表明，外加与Al等摩尔量的柠檬酸可以解除Al毒(Ma JF Hiradae S，Nomotto K，Iwashita T，MataumotoH.1997a.Internal detoxification mechanism of Al in hydrangea.Identification of Alfrom in the leace.Plant physiol.113：1033-1039；Li XF，Ma JF，Matsumoto H.2002.Aluminum-induced secretion of both citrate and malate in rye.Plant and Soil.242：235-243)。但是草酸和苹果酸解除铝毒所需要的量分别是Al的3倍和5～8倍(Ma JF，Zheng SJ，Hiradate S，Matsumoto H.1997b.Detoxifying aluminum withbuckwheat.Nature.390：569-570；Li XF，Ma JF，Matsumoto H.2002.Aluminum-induced secretion of both citrate and malate in rye.Plant Soil.242：235-243)。有机酸解除铝毒的能力主要与它们的化学结构有关，即-OH、-COOH官能团在主C链上的位置(Hue NV，Craddock GR，Adams F.1986.Effect oforganic acids on aluminum toxicty in subsoils.Soil Sci Am J.50：28-34)。解铝毒能力最强的有机酸其化学结构特征是两对OH/COOH位于相邻的两个C原子上(如柠檬酸、酒石酸)，或者两个COOH直接连接(如草酸)，这些有机酸可以与铝形成稳定的五元环或六元环结构。荞麦在Al胁迫下根系能分泌大量的草酸，草酸与Al络合有效减轻了Al对根系的毒害作用，同时在荞麦体内积累的大量草酸也能有效消除体内的铝毒(Ma JF，Hiraaadate S，Matsumoto H.1998.High aluminumresistance in buckwheat：II.Oxalic acid detoxifies aluminum internally.Plant Physiol.117：753-759；Zheng SJ，Ma JF，Matsumoto H.1998.High aluminum resistance inbuckwheat：I.Al-induced specific secretion of oxalic acid from root tips.PlantPhysiol.117：745-751)。
全世界有39.5亿hm2酸性土壤，其中可耕地土壤面积为1.79亿hm2，主要分布在热带、亚热带及温带地区，尤其是发展中国家(Kochian LV.1995.CelluarMechanisms of aluminum toxicity and resistance in plant.Annu Rew Plant physiolplant mol Biol.46：137)。我国酸性土壤遍及南方15个省区，总面积达2030万hm2，约占全国土地总面积的21％。酸性土壤上铝对植物的毒害以及植物可吸收的有效磷含量低已经成为限制作物生长的重要因素。一直以来，人们通常靠大量的施用石灰，来提高土壤的pH值，使游离铝沉淀，解除铝毒害。然而这种方法治标不治本，只能改良表层土壤，对深层土壤的酸化却没有实质性的改变，而且成本高，对环境污染严重。所以筛选和培育耐铝毒品种用于农业生产是解决问题的关键。
随着生物技术的快速发展，人们通过基因工程手段来改造现有品种使之具有耐铝性已成为可能。以往的研究证明通过在植物中过量或异位表达有机酸合成酶基因，如柠檬酸合成酶与苹果酸合成酶基因，可以提高植物体内的有机酸含量。这些有机酸通过根系分泌到土壤中，熬合土壤中的铝离子，就能解除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害。这样不仅可以提高转基因植物对铝毒的耐受能力，而且还有利于植物对磷等其它必需营养元素的吸收和利用。
柠檬酸合成酶(CS)是一个参与草酰乙酸(OAA)和乙酰辅酶A缩合产生柠檬酸的一个关键酶，这个生化反应在TCA循环、脂肪酸的β-氧化作用和光呼吸的乙醛酸循环途径中起重要作用。因为柠檬酸是多种生化反应如氨基酸和脂肪酸合成途径中重要的中间产物，它的合成和分解受到严格的控制。在尝试对柠檬酸代谢进行遗传操作时从整体上考虑柠檬酸上游和下游的酶及代谢产物是很重要的。增加柠檬酸的产生或减少柠檬酸的分解作用可以增强柠檬酸的积累或流动，增加与柠檬酸合成有关的酶如CS、MDH(苹果酸脱氢酶)和PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性，或减少与柠檬酸分解有关的酶如乌头酸酶(ACO)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的活性能增强柠檬酸的积累，柠檬酸生成量的增加可能会促进柠檬酸的分泌作用。
由于柠檬酸的合成需要碳骨架，植物的叶片是光合作用器官，在叶片中产生的光合作用产物可以为柠檬酸的合成提供大量的碳骨架。已有的cs基因的植物表达载体均采用组成型启动子(CaMV35S)，CaMV35S的作用没有组织特异性。用报告基因的研究结果表明CaMV35S的表达在根中最强，在茎、叶片、花和果实中较弱(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)。1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)是植物中表达量最大的蛋白质，这种蛋白质的含量占植物细胞中可溶性蛋白的40-50％。Rubisco的小亚基(rbcS)由细胞核基因编码，控制rbcS基因表达的启动子为光诱导型启动子(PrbcS)，PrbcS的作用有很强的组织特异性，需要光信号的诱导，在茎中有低水平的表达，在叶片中的表达最强。用报告基因的研究结果表明在叶片中PrbcS的活性比CaMV35S的高3-4倍，因此PrbcS是一种很强的光诱导型启动子(Jefferson等，1987；EMBO，6：3901-3907)，常被用来实现目的基因在叶片中的高水平表达。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种提高植物耐铝毒能力的柠檬酸合成基因的植物表达载体，该载体是含有柠檬酸合成酶基因cs的植物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在制备耐受铝毒的转基因植株中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种重组植物表达载体，在该植物表达载体中含有烟草cs基因。
所述植物表达载体的起始载体为pPZP211；所述cs基因上游添加有Rubisco小亚基的启动子PrbcS。
本发明的重组载体为pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。
所谓的cs基因，其GenBank登录号为：X84226。
本发明的上述重组载体pPZP211-PrbcS-cs由下述方法构建而成：
(1)从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：
cA1：5’-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3’
cA2：5’-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3’
5’端引物cA1，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物cA2，末端加XbaI酶切位点；以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到cs的全长cDNA；
(2)回收并纯化cs全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-cs；
(3)构建中间载体pUC118-PrbcS-*T，用SphI把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(4)将PrbcS启动子连接到cs基因的5’端，用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS-*T，回收cs基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pUC118-PrbcS-cs；
(5)用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，回收纯化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后连接转化，挑选单克隆并抽提质粒，然后用两组引物进行PCR检测和酶切检测，获得重组载体pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。
本发明同时提供了本发明的重组植物表达载体的构建方法：
(1)从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：
cA1：5’-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3’
cA2：5’-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3’
5’端引物cA1，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物cA2，末端加XbaI酶切位点；以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到cs的全长cDNA；
(2)回收并纯化cs全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-cs；
(3)构建中间载体pUC118-PrbcS-*T，用SphI把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T；
(4)将PrbcS启动子连接到cs基因的5’端，用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS-*T，并回收纯化cs基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测，获得重组质粒pUC118-PrbcS-cs；
(5)用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al.，Plant Mol.Biol.25，989(1994))，回收纯化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后连接转化，挑选单克隆摇菌并抽提质粒，然后用两组引物进行PCR检测获得重组载体pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。
另外，还提供了本发明的重组载体在制备耐受铝毒的转基因植株中的应用，尤其是在制备耐受铝毒的转基因烟草中的应用。
本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建cs基因的植物表达载体，以便在转基因植物叶片的细胞质中过量表达CS基因，直接利用光合作用产物产生的碳骨架合成柠檬酸，使之分泌到细胞外，最后通过根系进入到土壤中，熬合土壤中的铝离子，解除酸性土壤中高浓度的铝对植物的毒害，提高转基因植物耐铝毒的能力。
本发明使用的光诱导型启动子(PrbcS)是从番茄的基因组中分离出来的rbcS-3C的启动子，是一个由HindIII切割产生的1.7kb的DNA片断，已经亚克隆于pUC118中(Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)，该亚克隆的质粒载体名称为pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C。为了使cs基因表达后的产物能定位在叶片细胞质中，本发明用限制性内切酶SphI将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，然后用连接酶重新连接不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T，再利用一对互补引物(图1)，通过点突变技术在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点产生中间载体pUC118-PrbcS-*T。
本发明中植物表达载体为pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al，1994，PMB，25：984-)，也可选用其它农杆菌双元载体，如CAMBIA公司的pCAMBIA载体系列及其衍生载体。
将上述载体通过农杆菌介导或其它物理、化学方法导入植物组织并整合到植物基因组中，得到对铝毒耐受能力提高的转基因植物。本发明的专用载体旨在用于提高植物对铝毒的耐受能力，对单子叶和双子叶植物都适用，如烟草、水稻、大豆、小麦等。
本发明的实验结果表明转cs基因的烟草植株柠檬酸合成酶活性是野生型烟草的1～5.5倍。在铝毒的胁迫下，转cs基因的烟草能分泌较多有机酸，根系生长良好，能提高植物对铝毒的抗性。本发明的专用载体能在提高植物(如烟草)对铝毒的耐受性方面发挥很大作用，特别是在中国南方酸性红壤中，可显著促进植物对铝毒的耐受能力并提高植物对磷素的吸收利用效率，因而也为植物品种改良提供了一条新途径。
附图说明：
图1：中间载体pUC118-PrbcS-*T的构建。用SphI把pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切除，并使载体自连接形成pUC118-PrbcS-T，通过点突变技术在叶绿体定位序列的起始密码子附近引入NcoI位点；
图2：pPZP211-PrbcS-cs植物表达载体构建策略示意图；
图3：通过RT-PCR扩增得到cs基因cDNA。(A)烟草总RNA；(B)烟草RNA的RT-PCR。M，λDNA/HindIII digest Marker。1～4，cs基因的RT-PCR产物；
图4：重组质粒pMD-cs的酶切检测。1-2，用XbaI和NcoI双酶重组质粒pMD-cs；M，DNA/HindIII digest Marker；
图5：重组质粒pUC118-PrbcS-cs的检测。(A)PCR检测。M，λDNA/HindIIIdigest Marker；1～4，以pUC118-PrbcS-cs为模板扩增的PCR产物；(B)酶切检测。M，λDNA/HindIII digest Marker；1-2，用EcoRI酶切pUC118-PrbcS-cs重组质粒；
图6：重组质粒pPZP211-PrbcS-cs的检测；(A)PCR检测。M，X174DNAMarker；1～3，以pUC118-PrbcS-cs重组质粒为模板扩增cs基因全长的PCR产物；4～6，以pPZP211-PrbcS-cs重组质粒为模板，用一个位于PrbcS启动子内部的一个引物(rbcS5)及cs基因的下游引物cA2扩增的PCR产物；(B)M，X174DNAMarker；1～3，用EcoRI酶切pPZP211-PrbcS-cs重组质粒；
图7：cs基因在转基因烟草中的插入情况以及转录水平的检测。(A)cs基因插入情况的检测。M，DNAmarker；P，阳性对照(以pPZP211-PrbcS-cs重组质粒为模板扩增的PCR产物)；CS1、CS8、CS11，以转基因烟草的基因组DNA为模板扩增的PCR产物；CK，负对照(未转基因的野生型烟草)；(B)cs基因转录水平的检测；M，DNA marker；P，阳性对照，CS1、CS8、CS11，转基因烟草株系的RT-PCR产物；
图8：转基因烟草叶片中柠檬酸合成酶的活性测定。CS1、CS8、CS11，转基因烟草株系；CK，负对照(未转基因的野生型烟草)；
图9：转基因烟草对铝毒的耐受性检测。(A)转基因烟草经100μM AlCl3处理3小时后根尖用铬天青S染色；(B)转基因烟草经300μM AlCl3处理3小时后根尖用铬天青S染色。CS1、CS8、CS11，转基因烟草株系；CK，负对照；
图10：转基因烟草T2代植株在铝毒胁迫下根伸长速率的测定。CS8、CS10、CS19、CS19，转基因烟草株系；CK；负对照；
图11：转基因烟草在铝胁迫下的生长状况。(A)转基因烟草在100μM AlCl3基质中的生长状况；(B)转基因烟草在300μM AlCl3基质中的生长状况。CS8、CS11分别，转基因烟草株系；CK，负对照。
下面结合附图，用本发明的实施例来进一步阐明本发明的实质性内容，但不以此来限定本发明。
具体实施方式：
下述实施例中所涉及的试剂与仪器为：
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司。其余试剂均为国产分析纯。
仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、中间载体pUC118-PrbcS-T的构建
用质粒抽提试剂盒(博大泰克)纯化(按试剂盒说明书操作)pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C(由Sugita等构建并提供，Sugita et al.，1987，MGG，209：247-256)，用限制性内切酶SphI(Fermentas)将pUC118-PrbcS-T-rbcS-3C中的rbcS-3C切割出来，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体pUC118-PrbcS-T和rbcS-3C片段，回收4.6kb的载体pUC118-PrbcS-T，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接(按试剂盒说明书操作)不含rbcS-3C的载体DNA片断，产生一个中间载体pUC118-PrbcS-T(图1)，用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用SphI进行酶切检测，连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上只产生一条4.6kb条带，选出连接成功的质粒载体pUC118-PrbcS-T，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例2、利用点突变技术在中间载体pUC118-T-PrbcS中引入NcoI位点
以纯化质粒pUC118-Prbcs-T为模板，根据叶绿体定位序列设计一对用于点突变的互补引物(NcoI5和NcoI3，图1)，委托TaKaRa合成。在点突变反应混合液中加入25ng的纯化质粒pUC118-PrbcS-T作为模板，同时加入125ng的点突变引物NcoI5和NcoI3、1μldNTP(2.5mM)，5μl的10×KOD反应Buffer和1μl的KOD聚合酶(日本东洋纺)，加双蒸水使反应终体积为50μl。在PCR仪上于95℃加热30秒，然后按照95℃、30秒，55℃、1分钟，68℃、10分钟的程序进行15个循环的反应，最后在68℃延长反应10分钟，合成含突变位点的子链。反应完成后把反应混合液置于冰上冷却2分钟，向反应混合液加入1μl的限制性内切酶Dpn I(10U/μl)和5μl的Dpn I反应缓冲液，于37℃保温1小时，降解不含突变位点的母链。用反应混合液转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒，用NcoI(Fermentas)进行酶切检测，突变成功的质粒可被NcoI切开并在琼脂糖凝胶电泳图上产生一条4.6kb的条带，选出突变成功的质粒载体pUC118-PrbcS-*T，重新转化大肠杆菌DH5α，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒。在pUC118-PrbcS-T的叶绿体定位序列起始密码处引入NcoI位点后，为构建由启动子PrbcS控制，表达的目的蛋白定位在叶片细胞质中的目的基因的植物表达载体奠定基础。
实施例3、植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs的构建
植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs的构建策略如图2所示，首选从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计一对特异引物，以烟草第一链cDNA为模板扩增，得到cs的全长cDNA，回收并纯化cs全长基因片段，将其连接到pMD18-T载体上获得pMD-cs。用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS-*T，回收纯化cs基因片段以及载体大片段pUC118-PrbcS，然后连接、获得重组质粒pUC118-PrbcS-cs。用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211，回收纯化小片段PrbcS-cs和大片段pPZP211，然后连接，获得重组载体pPZP211-PrbcS-cs，它含有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。具体构建过程如下：
一、烟草柠檬酸合成酶基因cs的cDNA扩增及TA克隆
从GenBank中查找烟草cs的全长基因序列，并设计一对引物，序列如下：
cA1：5’-CACCATGGTGTTCTATCGCGGCGTTTC-3’
cA2：5’-TCTAGATCATGCTTTCTTGCAAATGGTTC-3’
5’端引物cA1，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物cA2，末端加XbaI酶切位点。
用TRIzoL Reagent(Invitrogen)从烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)幼苗中提取总RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit(TaKaRa)进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mM MgCl2 4μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用cs基因上下游特异性引物cA1和cA2作PCR，扩增得到cs的全长cDNA 1.4kb(图3)。回收并纯化cs全长基因片段，并将其连接到pMD18-T(大连宝生物公司)载体上，转化大肠杆菌感受态DH5α(天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的双酶切检测。根据阳性重组质粒pMD-cs载体两端的多克隆位点，用NcoI和XbaI双酶切重组质粒，经1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-cs含有1.4kb左右的DNA插入片段(图4)，经序列分析证明是烟草cs全长基因的cDNA。
二、重组质粒pUC118-PrbcS-cs的构建
为了将PrbcS启动子连接到cs基因的5’端，用NcoI和XbaI双酶切pMD-cs和pUC118-PrbcS*T(该载体为PrbcS启动子的供体)，回收纯化1.4kb的cs基因cDNA片段以及载体大片段pUC118-PrbcS(约4.2kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接cs基因cDNA片段以及载体大片段pUC118-PrbcS、用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的平板上，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒进行PCR和酶切鉴定。以重组质粒为模板，用一个位于PrbcS启动内部的引物及cs基因的下游引物cA2进行PCR扩增，PCR产物的理论长度为1.6kb。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，结果显示扩增产物的分子量为1.6kb，实际大小与理论值相符合，表明已经将cs基因正确插入到含有光诱导启动子PrbcS的载体上(图5A)。接着对PCR分析为阳性的重组质粒进行酶切检测，连接正确的重组质粒经EcoRI酶切应该得到一条1.0kb左右的小片段和一条4.6kb的大片段，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果和理论相符(图5B)，由此获得正确连接的重组质粒pUC118-PrbcS-cs。
三、pPZP211-PrbcS-cs的构建
用HindIII和XbaI双酶切pUC118-PrbcS-cs和pPZP211(由Hajdukiewicz等构建并提供，Hajdukiewicz et al，1994，PMB，25：984-)，回收纯化目的片段PrbcS-cs(约2.9kb)和pPZP211载体大片段(长度约为9.3kb)，然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接连接目的片段PrbcS-cs和pPZP211载体大片段，用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的平板上，于37℃过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中提取质粒，然后进行PCR和酶切检测。PCR检测采用两组引物进行，第一组用一个位于PrbcS启动子内部的一个引物(rbcS5)及cs基因的下游引物cA2作PCR，PCR产物的理论长度为1.6kb；第二组的上下游引物分别是扩增cs全长基因的引物cA1、cA2，PCR产物的理论长度则为1.4kb。两组PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析显示其片段大小分别与理论预测值相符(图6A)。这表明PrbcS-cs片断已经正确插入到植物表达载体pPZP211中。cs基因内部以及NOS终止子之后均包含一个EcoRI位点，所以采用EcoRI进行酶切检测，如果插入方向是正确的，酶切产物会出现长度约为1.4kb的小片段。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示酶切产物小片段的大小与理论推测相吻合(图6B)，由此获得cs基因的植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs，该载体带有启动子PrbcS，其后紧接cs基因。
实施例4、用植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs转化农杆菌
制备农杆菌的感受态细胞，用电脉冲法将构建好的植物表达载体农杆菌pPZP211-PrbcS-cs转入农杆菌(C58Cl(pPMP90))中，在加有壮观霉素的平板上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀；将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混和液落至杯底；将电转化杯置于电转化仪(BIO-RAD)滑槽中，用1mm的电击杯和200欧姆，2.5kV/0.2cm的参数进行电击，电击后立即取出电转化杯，迅速加入0.5mlSOC培养基，混匀，转移到1.5ml的离心管中；28℃，200rpm摇床培养3-5h；室温下，7500rpm离心1min，弃大部分上清，保留100μl将细胞悬浮；把农杆菌涂布于有壮观霉素(Spe，50μg/ml)的LB固体培养基上，28℃培养2天获得单菌落；首先用牙签挑取农杆菌菌落放入20μlddH2O中，98℃处理15分钟后取出10μl农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用cs基因上下游特异性引物作PCR检测，转化成功的菌落均能扩增出1.4kb的cs基因条带，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例5、用植物表达载体pPZP211-PrbcS-cs转化烟草
挑取携带有pPZP211-PrbcS-cs质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB培养基中(含Spe，100μg/ml)，180rpm，28℃培养24h，待菌液OD600至1.0左右，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，离心10min(3000rpm)，沉淀菌体。重复以上操作2～3次。最后加入一定体积的MS液体培养基重悬浮，使菌体的OD600值为0.5。制备烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanth)的无菌苗，通过农杆菌介导，用叶盘法转化烟草，然后通过组织培养获得小苗，进一步筛选获得所需的转基因植物。把无菌烟草的叶片切成小片叶盘，在制备好的农杆菌菌液中浸染15-20min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1(MS+NAA02.1μg/ml+BAP0.02μg/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含卡那霉素(50μg/ml)的芽诱导培养基MS4(MS+NAA0.53μg/ml+BAP0.5μg/ml)上进行芽的诱导，约15天继代一次。待有芽生成后，转入含卡那霉素(50μg/ml)的MS培养基上进行根的诱导。通过卡那霉素筛选一共获得18个独立的转基因株系，接着对cs在这些转基因植株中的转录水平进行分析。
实施例6、cs基因在转基因烟草中的插入情况及转录水平检测
为了确认通过卡那霉素筛选的转基因烟草株系确实含有本发明导入的目的基因的cDNA片段，用PCR方法对筛选到的转基因烟草作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组：称取植物叶片100mg左右置于1.5ml离心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末状；加入900μl预热到65℃的2×CTAB缓冲液(Tris-HCl pH 7.5100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2％)，65℃度水浴加热20分钟后取出冷却；加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)后转移上清至1.5ml EP管；再次加入500μl氯仿-异戊醇混合液(24∶1)摇匀，4℃离心10min(7500rpm)；取出上清置于新的EP管中，加入1/10体积3M pH5.2醋酸钠和等体积异丙醇，摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；弃上清，用75％乙醇清洗两次后，干燥，用含RNase的TE缓冲液溶解并降解RNA。以植物基因组DNA为模板，用一个位于PrbcS启动子内转录起始位点处的一个引物及cs基因的下游引物cA2作PCR检测，PCR产物的理论长度为1.5kb，成功转入目的基因的植株均能扩增出1.5kb的条带(图7A)，经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察目的基因在转基因烟草株系中的转录情况，从转基因植物中抽取总RNA，反转绿成cDNA后用于RT-PCR分析，检测cs基因在转基因植物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent(Invitrogen)提取RNA，取植物嫩叶约0.1g，加入1ml的TRIzoL提取液在研钵中研磨，室温静置5min后移入离心管，再加入0.2ml氯仿，振荡混匀，离心15min(12000rpm)，转移上清液至新管，加入0.5ml异丙醇，混匀室温放置10min，4℃离心10min(12000rpm)，弃上清，沉淀用75％乙醇1ml清洗，4℃离心5min(7500rpm)，弃乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶解RNA。使用Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，取植物总RNA约0.1μg-5μg，oligo(dT)50ng，10mM dNTP mix 1μl，用DEPC处理水补足至10μl，混匀后，短暂离心将之收集于管底，置于65℃加热5min，冰浴10min，加入反应混合物9μl(5×reaction buffer 4μl，25mMMgCl24μl，0.1M DTT 2μl，RNA酶抑制剂1μl)，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温2min，加入1μl M-MuLV Reverse Transcriptase，将上述混合物混匀，短暂离心将之收集于管底，25℃保温20min，然后42℃保温70min，合成cDNA。以cDNA为模板，用一个位于PrbcS启动子内部的引物及引cs基因的下游引物cA2作RT-PCR分析，考察转基因烟草中是否有目的基因的转录物。结果证明大部分转基因烟草植株均有目的基因的转录物(图7B)。
实施例7、转基因烟草中柠檬酸合成酶(CS)的活性分析
选取经RT-PCR分析表明有目的基因的转录物的转基因烟草植株测定柠檬酸合成酶的活性。从烟草叶片中抽提可溶性蛋白，取1g烟草叶片，加1ml蛋白抽提液[100mM Tris-HCl(pH 7.5)；10％(V/V)甘油；10mM巯基乙醇；1mMPMSF；5％(W/V)PVP]研磨，转移至EP管中，13000r/min离心25min(4℃)。将上清移到新的EP管中，用Bradford方法测定植物上清中的蛋白质浓度。
柠檬酸合成酶的活性测定按Anoop等(Plant Physiology，2003，132：2205-2217)的方法进行，原理为L-苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下生成草酰乙酸，而草酰乙酸极不稳定，在柠檬酸合成酶和乙酰辅酶A的作用下，能够生成柠檬酸。在该反应中，通过测定波长为340nm处NADH的增加量从而获得CS的相对酶活性。
测定CS酶活性的反应体系为：0.05M Tris-HCl(PH 7.5)，10mM L-Malate，10U/mLMDH，0.5mMNAD，在1ml的反应体系中加入100μg烟草蛋白样品。在紫外分光光度仪上测其340nm处的吸收值(OD值)，待读数稳定后，加入10μL4mM CoA(乙酰辅酶A)，在1min之内检测340nm处的吸收值。计算两次读数的差值，得到CS酶活性数据，结果表明转基因烟草CS酶活性为野生型烟草的1～5.5倍(图8)，可见cs在转基因烟草植株中的表达大大提高了CS的活性。
实施例8、转基因烟草对铝毒的抗性检测
植物的耐铝性一般采用根尖染色情况等表型指标来衡量。根尖染色的染料有苏木精(hematoxylin)和铬天青(eriochrome cyanine S)，两者均适于鉴定植物对铝的敏感性或忍耐性。其原理是染料能通过死亡的细胞膜进入细胞内部，并与残留于死亡细胞核中的铝结合产生蓝色(苏木精)或红色(铬天青S)物质，这一反应对铝具有高度的专一性(Cancado GMA，Loguercio LL，Martins PR.1999.Hematoxylin staining as a phenotypic indes for aluminum tolerance selection intropical maize(Zea mays L.).Theor Appl Genet.99：747-754；Ma JF，Zhen SJ，Li XF.1997.A rapid hydroponic screening for aluminum tolerance in barley.Plant soil.191：133-137)。并且根尖染色程度与铝对植物的毒害程度呈正相关。
取大小均匀一致且生根良好的转基因烟草幼苗，分别置于AlCl3浓度分别为0(对照)、50、100、300μmol/L的氯化钙溶液(pH值4.3)中处理三小时，再用0.1％的铬天青S染色液染色15min。用蒸馏水冲洗后，在显微镜下观察根尖染色情况。实验结果显示野生型烟草的根系和根尖均被染成紫色，而转cs基因的烟草小苗经100μM的AlCl3处理后根系和根尖基本不着色或只有很浅的着色(图9A)。在高浓度的AlCl3(300μM)处理后，CS表达水平低的植株CS-8其根系有些着色，但着色程度也比野生型(CK)轻，可见转基因烟草对铝的耐受程度与CS的活性水平有明显的相关性(图9B)。这些结果初步证明在叶片中过量表达cs，也能增强转基因植物对铝毒的耐受性。
实施例9、转基因烟草植株在铝毒胁迫下根伸长速率的测定
根在铝毒胁迫下的伸长速率是衡量植物对铝毒耐受能力的另一种指标之一，因此还测定在铝毒胁迫下转基因烟草植株根生长速率。因此选取转基因烟草大小均匀一致的幼苗，分别置于AlCl3浓度为0、50、100、300μmol/L的氯化钙溶液中。处理24小时之后，测量转基因植株根的伸长量，重复三次，实验结果如图10所示。当铝离子浓度为200μmol/L和300μmol/L时，铝离子对野生型烟草(CK)根部伸长的抑制率为100％，然而cs转基因植株仍然保持一定的生长活力，根系维持一定的伸长量。
实施例10、转基因烟草植株分泌的柠檬酸含量测定
取大小均匀一致的转基因烟草植株以及野生型烟草幼苗，分别置于AlCl3浓度为100、300μmol/L的氯化钙溶液中处理3h，接着收集氯化钙溶液，浓缩后用高效液相色谱分析柠檬酸含量。分析结果表明，在叶片中合成的柠檬酸已大量运输到根部，cs转基因烟草植株根系分泌的柠檬酸含量约为野生型对照植株的1.5～2倍。
实施例11：转基因烟草在在铝胁迫下的生长情况分析
将经过AlCl3处理的烟草植株小苗移栽到新的珍珠岩基质中在温室内进行盆栽试验，每星期浇灌含有AlPO4的营养液(pH4.3，配方同MS培养基的配方，用AlPO4取代其中的KH2PO4)两次，一次50ml。两个月后只浇水，观察烟草植物的生长状况。四个月后，cs转基因植株已开花结实，然而野生型烟草(CK)植株生长明显受阻，不仅植株矮小，而且还没有开始生殖生长。通过对烟草株高的测量发现经过100μmol/L LAlCl3处理的cs转基因烟草的株高为野生型烟草的2.09～2.1倍(图11A)；经过300μmol/L AlCl3处理的cs转基因烟草的株高为野生型烟草株高的1.8～2倍(图11B)。可见转基因烟草根部过量分泌的柠檬酸能够在含有磷酸铝的酸性介质中螯合铝离子，可以解除铝毒的危害，有助于烟草对于磷素的吸收。所以cs转基因烟草植株在铝毒胁迫下生长良好，能正常开花结实。