一种异黄酮类化合物、制备方法及其用途.pdf

本发明涉及一种异黄酮类化合物。本发明还涉及该化合物的制备方法，以及该类化合物的医药用途。本发明提供具有如右结构式(I)的化合物：其中R选自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R′为HCF2，R″选自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。该化合物可以用于制备治疗血管内皮氧化应激损伤性疾病以及动脉粥样硬化的药物。

权利要求书
1.  具有如下结构式(I)的化合物：

其中R选自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R`为HCF2，R``选自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。

2.  根据权利要求1所述的化合物，其中R选自CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9；R``选自HCFX，CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9。

3.  根据权利要求2所述的化合物，其中R，R``均为甲基。

4.  制备权利要求1至3之一化合物的方法：
1)将金雀异黄素(II)与化合物一氯二氟甲基(III)反应生成7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮(IV)；
2)再将(IV)的羟基醚化得到7-二氟甲基-5，4’-二取代烷氧基异黄酮(化合物I)。

5.  根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于第1)步中溶剂为水溶性溶剂，并在碱性条件下进行。

6.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于水溶性溶剂选自水，二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、丙酮或其混合物。

7.  根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所用的碱为强碱，与反应物金雀异黄素的比例为2～5∶1。

8.  根据权利要求4至7之一中所述的制备方法，其特征在于第2)步在碱性条件下进行，溶剂为惰性溶剂。

9.  根据权利要求5、6、7、8之一所述的制备方法，其特征在于所说的碱选自无机碱NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3，有机碱为甲醇钠、乙醇钠、三乙胺、吡啶。

10.  根据权利要求4至9之一所述的制备方法，其特征在于羟基醚化剂选自溴甲烷、碘甲烷或硫酸二甲酯。

11.  根据权利要求4至10之一所述的制备方法，其特征在于合成化合物IV的反应温度为0℃～70℃；反应时间为6～36小时的条件；合成目标化合物I的反应温度在40℃～140℃；反应时间在4～24小时。

12.  具有如下结构的化合物，

其中R`为HCF2，R和R``为H原子。

13.  权利要求1至3以及12之一的化合物在制备抗血管内皮氧化应激损伤药物中的应用。

14.  权利要求1至3以及12之一的化合物在制备治疗动脉粥样硬化性疾病的药物中的应用。

说明书一种异黄酮类化合物、制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及一种异黄酮类化合物。本发明还涉及该化合物的制备方法，以及该类化合物的医药用途。
背景技术
金雀异黄素(genistein，GEN)是一种来源于豆类植物的异黄酮，化学名为5，7，4’-三羟基异黄酮。GEN的化学结构见式(II)：

金雀异黄素(5，7，4’-三羟基异黄酮)结构特征为在分子的相对两极带有两个酚羟基，结构类似于17-β-雌二醇，系典型植物雌激素，分子量为270，能低亲和力地结合雌激素受体，介导雌激素样作用[1，2]。研究表明，GEN对ERβ的亲和力高于ERα，故GEN仅影响部分雌激素受体。金雀异黄素亦是经典酪氨酸蛋白激酶抑制剂，生物活性广泛，特别是具有保护血管内皮细胞氧化应激损伤和拮抗内皮细胞凋亡活性[3]，但因其在肠道吸收甚少或者完全不吸收而导致活性较低[4]。
近年，越来越多的证据表明，GEN这种天然成分对恶性肿瘤[5，6]，绝经后症候群，骨质疏松症[7，8]及心血管疾病具有预防和治疗作用[9，10]。
血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cell)具有多种生理功能，参与机体的凝血、免疫、物质转运和生物活性物质释放等生命活动。血管内皮损伤是许多心血管疾病的病理基础。在许多病理情况下，如动脉粥样硬化[11]，高血压[12]，心肌梗死[13]等均可导致内皮细胞结构和功能改变，并且内皮细胞在相应病理过程的发生发展中起着重要作用。目前被普遍接受的Ross[14]修正的“损伤反应”学说认为，内皮细胞损伤和内皮细胞功能紊乱是动脉粥样硬化形成早期的始动环节。血管内皮损伤和功能紊乱与机体和局部组织抗氧化能力降低，自由基产生增多而氧化灭活一氧化氮有关[15，16]。研究表明，血管内皮细胞凋亡可能是动脉硬化过程中的重要早期事件。大量研究证明氧化应激能够导致细胞凋亡，多种致血管内皮受损和血管内皮功能不全的因素如低密度脂蛋白(LDL)、溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LPC)、高糖、高半胱氨酸等均能增加细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和诱导内皮细胞凋亡。在病理情况下，如缺氧、高脂血症、缺血再灌注等因素可引起内皮细胞凋亡，破坏内皮结构，使内皮功能出现异常，加速血小板、粒细胞与内皮细胞粘附、聚集，诱发血栓形成甚至堵塞血管。此外，内皮细胞凋亡还与高血压、糖尿病等疾病密切相关，并加重这些疾病的心血管病变。
低密度脂蛋白(LDL)的氧化是动脉粥样斑块形成的基础性因素，高度氧化的LDL具有细胞毒性，轻度氧化的LDL则具有促有丝分裂作用，能诱导内皮细胞增殖[17-20]。除氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)外，内源性氧离子和氧自由基，外源性过氧化氢能活化Ras蛋白激酶和ERK1/2，调节c-fos的表达，促进VSMC增殖[21，22]。另外细胞内外过氧化氢浓度的小幅度增加也产生促血管内皮细胞和VSMC增殖作用，若过量则会产生细胞毒性[23，24]。作为一种抗氧化剂genistein具有缓解和消除与过氧化产物所导致的增殖和损伤反应作用[25，26]。
动脉粥样硬化病灶的发生发展是动脉壁细胞、细胞外基质、血液成分、环境及遗传等诸多因素相互作用的结果，其中由黏附分子介导的血管内皮细胞与单核细胞和白细胞的黏附是动脉粥样硬化早期特征和关键步骤[27-29]。在内皮损伤期：脂质代谢紊乱、高血压、糖尿病、吸烟等诸多危险因素使血管内皮细胞受损[30-32]，活化的内皮细胞表面表达大量的黏附分子，主要有P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。Sakai等[33]研究发现，新西兰兔及遗传性高脂血症兔(WHHL)VCAM-1、P-selectin等黏附分子的表达随着血脂水平升高逐渐增加，并且早于单核细胞与内皮细胞的黏附。免疫组化检测发现斑块内内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1和P-selectin，表达程度与内膜下单核-巨噬细胞和T淋巴细胞密度密切相关[34-36]。
黏附分子是一类介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的膜表面糖蛋白，广泛分布于体内，他们在胚胎的发育和分化、炎症与免疫应答、凝血与血栓形成及肿瘤的浸润和转移等多种生理、病理过程中均具有重要作用[37-39]。内皮细胞选择素(endothelium-selectin，E-selectin)，它的表达局限于受到刺激后活化的内皮细胞，因而能更可靠地反映内皮细胞的激活或损伤状态[40-41]。合理调控黏附分子的表达可望成为预防和治疗动脉粥样硬化的有效措施之一。
现有技术中文献[42]公开了由6取代，4’取代黄酮合成溴代黄酮，见如下的反应式，

其中，R1取自H，OCH3，和F、Cl、Br；R2取自H，CH3，OCH3，SCH3，SO2CH3，F，Br。另一文献[43]公开了下列的化合物。

发明内容
本发明提供具有如下结构式(I)的化合物

其中R选自C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基，R`为HCF2，R``选自HCF2，C1-C10烷基，芳基，C7-C12芳烷基。
根据本发明的实施例，其中R优选自CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9；R``优选自HCF2，CH3，C2H5，n-C3H7，C6H5CH2，n-C7H15，n-C8H17，n-C10H21，iso-C4H9。
最优选R，R``均为甲基。
上述化合物按如下式表示合成路线制备。

具体的说，是化合物(II)和化合物(III)在反应温度为0℃～70℃；反应时间为6～36小时的条件下，生成7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮(IV)；再将化合物(IV)的羟基甲醚化得到7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(I)，反应温度在40℃～140℃；反应时间在4～24小时。
中间产物7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮(化合物IV)的合成
这步反应为酚羟基的烷基化，烷化剂HCF2Cl为气体，实验过程中反应瓶的密闭状态、碱的用量、溶剂和温度对反应的影响较大。
我们的目的主要是合成7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮，为了避免5，4’-取代物的产生，摸索了在敞口常压和密闭反应装置下金雀异黄素与碱氢氧化钠的摩尔比对反应的影响。
在敞口常压反应装置下，金雀异黄素与碱氢氧化钠的摩尔比为1∶1或1∶2时，反应很难发生(36hr仍没有反应)；摩尔比为1∶3时，反应发生很慢(8hr)，收率很低，反应产物中7-取代物和7，4’-二取代物的比例相当，分别为8％和8％；摩尔比为1∶4或1∶5时，反应较快发生(0.5hr)，收率较好，7-取代物和7，4’-二取代物的分别为收率31％和23％；氢氧化钠的量再提高，收率也没有明显提高，金雀异黄素的氧化加剧。反应温度：在0℃～30℃反应速度较慢；在30℃～40℃反应速度有所加快；在40℃以上反应时，HCF2Cl气体在反应液中停留时间太短，不利于反应的进行。反应溶剂以直接用水做溶剂效果最好。
在密闭反应装置下，由于HCF2Cl气体可以保持较高浓度，金雀异黄素与氢氧化钠的摩尔比为1∶2～1∶3时，反应较快发生(0.5hr)，收率较好，7-取代物和7，4’-二取代物的分别为收率42％和27％；碱的量再提高，7-取代物的收率没有明显提高，只提高了7，4’-二取代物的收率。反应溶剂以水与水溶性溶剂二氧六环、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)或丙酮组成的混合溶剂(体积比1∶1)较好。反应温度以接近反应溶剂的回流温度较好，如体积比1∶1的水与二氧六环混合溶剂的反应温度以70℃最佳。
碱为去酸剂，为强碱，无机碱去酸剂为NaOH、KOH；有机碱为甲醇钠、乙醇钠、三乙胺。
在反应体系中可以加入反应促进剂为碘化钾、碘化钠、碱金属碘化物。
7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮(化合物IV)的5，4’-烷氧基化反应。
化合物IV和卤代烷基，如碘甲烷、溴乙烷、溴丙烷等在丙酮、四氢呋喃、苯、甲苯、二甲苯、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、乙二醇二乙醚或二氧六环等溶剂中用无机碱去酸剂为NaOH、KOH、K2CO3、Na2CO3；有机碱为甲醇钠、乙醇钠、三乙胺、吡啶做脱酸剂很顺利地合成化合物Ia、Ib、Ic；但化合物Id，Ie，If，Ig，Ih的合成相对困难些，去酸剂的用量要适当增大(化合物IV∶去酸剂＝1∶5)，反应时间要延长到20小时以上才能使反应收率提高。
与金雀异黄素相比，本发明所制备的化合物具有更强的生理活性。
本发明利用过氧化氢诱导内皮细胞损伤和内皮细胞凋亡模型，以抗氧化经典代表药维生素E(vit E)和先导化合物Genistein作为阳性对照，分别检测了本发明提供的9个含二氟甲基异黄酮类化合物抗血管内皮氧化应激损伤的活性。发现：(1)在先导化合物(5，7，4’-三羟基异黄酮)基本结构上，C-7位引入二氟亚甲基获得的7-二氟甲基-5，4’-二羟基异黄酮较先导化合物抗血管内皮氧化应激损伤活性有一定程度的提高。(2)全部供试品中以7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮抗血管内皮氧化应激损伤活性最高，按等摩尔浓度折算，本发明提供的化合物降低乳酸脱氢酶(LDH)活性的效价强度为先导化合物genistein的100倍和阳性对照药Vit E的50倍。(3)随C-5位和C-4’位取代烷氧基碳链延长所获得的类似物抗血管内皮氧化应激损伤活性未发现有规律性改变。
因此，本发明提供的化合物，包括中间体化合物可以用于制备治疗血管内皮氧化应激损伤性疾病药物。
本发明实施例结果表明，氧化应激损伤内皮细胞使血管内皮-单核细胞的粘附率显著增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲烷氧基异黄酮(Ia)和先导化合物genistein及抗氧化剂Vit E均能有效抑制氧化应激诱导的血管内皮-单核细胞粘附。化合物Ia(0.3μmol/L)与genistein(100μmol/L)和Vit E(50μmol/L)的抑制强度相当。说明化合物I a抑制氧化应激诱导的血管内皮-单核细胞粘附作用的效价强度高于genistein和Vit E。
我们通过ELISA法检测培养液上清中黏附分子E-Selectin、ICAM-1的浓度进一步证实过氧化氢处理血管内皮细胞粘附分子E-Selectin、ICAM-1的释放增加，化合物I a具有抑制氧化应激损伤血管内皮细胞诱导的E-Selectin、ICAM-1释放作用。说明化合物I a是通过抑制E-Selectin、ICAM-1的释放发挥抗氧化应激损伤血管内皮细胞-单核细胞粘附作用。
因此，特别地，本发明提供的化合物，包括中间体化合物可以用于制备治疗动脉粥样硬化性疾病的药物。
附图说明
图1 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基异黄酮类供试品对血管内皮氧化损伤模型LDH活性的影响(图中Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig、Ih、IV、V的浓度均为1.0μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组；
图2 7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基异黄酮类供试品对血管内皮氧化损伤模型细胞凋亡的影响(图中Ia、Ib、Ic、Id、Ie、If、Ig、Ih、IV、V的浓度均为1.0μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组；
图3 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对HUVEC-12、THP-1细胞释放LDH的影响，＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组；
图4 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对HUVEC-12细胞增殖活性的影响(I a的浓度从左至右分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)
图5 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化损伤HUVEC-12细胞生长的影响(I a的浓度从左至右分别为10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)；
图6 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡的影响(I a的浓度从左至右分别为10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组；
图7 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡的影响；
图8吖啶橙染色荧光显微镜观察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡的影响(10×20倍)；
图9 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡指数的影响(I a的浓度从左至右分别为10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)；
图10 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞活性氧形成的影响(I a的浓度从左至右分别为10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L)＊＊P＜0.01 vsH2O2损伤组；
图11荧光显微镜下观察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞活性氧形成的影响(10×20倍)；
图12荧光分光光度计检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导血管内皮细胞和单核细胞粘附的影响(I a的浓度从左至右分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L，A示：洗脱血管内皮细胞或单核细胞的荧光强度，B示单核细胞和血管内皮细胞的粘附率(％))＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组，＊P＜0.05 vs H2O2损伤组
图13 ELISA法检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞E-Selectin释放的影响(I a的浓度从左至右分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)；
图14ELISA法检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞ICAM-1释放的影响(I a的浓度从左至右分别为0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)。
具体实施方式
下面是本发明所述7-二氟甲基-5，4’-烷氧基异黄酮(I)的制备的具体实施例，所述的实施例只是用来说明本发明，而不是用来限定本发明。
实施例1
7-二氟亚甲基-5，4’-二羟基异黄酮(化合物IV，V)的合成
在一个100mL的三口瓶中，加入5.4g(0.02mol)金雀异黄素(即化合物II)、40mL10％的NaOH水溶液，加热到40℃时通入HCF2Cl(即化合物III)气体，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶4)，反应24小时后，原料斑点不再变浅，放冷，用10％的盐酸溶液调节至pH至5～6，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液用无水硫酸钠干燥，回收乙酸乙酯，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)分离得到化合物IV(收率31％)和化合物V(收率23％)。
实施例2
7-二氟亚甲基-5，4’-二羟基异黄酮(化合物IV，V)的合成
将27g(0.1mol)化合物l、100mL 10％的NaOH水溶液与200mL二氧六环混合后加入一个密闭的反应釜，通入HCF2Cl气体并密闭反应釜，加热到70℃搅拌反应，TLC跟踪，反应10小时后，原料基本消失，放冷，倒入水中，过滤，水层用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯萃取液无水Na2SO4干燥，回收乙酸乙酯，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)分离得到化合物IV(收率42％)和化合物V(收率27％)。
化合物IV；

m.p.194-195℃.MS(EI，70ev)m/z：320(M+，100.00)，319(27.42)，203(22.57)，118(18.14)，321(17.72)，202(7.10)，89(5.25)，51(4.90)；IRυmax(cm-1，KBr)：1448，1519，1662(C＝O)，3319，3528(OH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：6.599(1H，d，J＝2.4Hz)，6.820(2H，d，J＝12.0Hz)，6.867(1H，d，J＝2.4Hz)，7.371(2H，d，J＝12.0Hz)，7.427(1H，t，J＝72.9Hz)，8.244(1H，s)，9.550(1H，s)，12.994(1H，s)；19F NMR(282MHz)：-84.372(d，J＝72.9Hz).Anal.Calcd.for C16H10F2O5：C，60.08，H，3.15；Found C，60.07，H，2.94.
化合物V：

m.p.103-106℃.MS(EI，70ev)m/z：370(M+，100.00)，253(50.40)，369(26.68)，202(22.67)，371(18.52)，118(11.40)，155(10.85)，174(10.81)；IR υmax(cm-1，KBr)：1430，1448，1498，1653(C＝O)，3074(OH)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：6.561(1H，t，J＝73.8Hz)，6.590(1H，d，J＝2.4Hz)，6.638(1H，t，J＝72.3Hz)，6.684(1H，d，J＝2.4Hz)，7.229(2H，d，J＝9.0Hz)，7.551(2H，d，J＝9.0Hz)，7.975(1H，s)；19FNMR(282MHz)：-80.953(d，J＝73.8Hz)，-82.414(d，J＝72.3Hz).Anal.Calcd.for C17H10F4O5：C，55.31，H，2.74；Found C，55.40，H，2.53.
实施例3
7-二氟亚甲基-5，4’-二甲氧基金雀异黄素(化合物I a)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、710mg(5mmol)CH3I与414mg(3mmol)碳酸钾混合，加入丙酮50ml，回流反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反应8小时后，原料斑点消失，放冷，过滤，回收丙酮，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分离得到化合物Ia，收率92.7％。
实施例4
7-二氟亚甲基-5，4’-二甲氧基金雀异黄素(化合物I a)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入100mg(0.3mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、450mg(5mmol)CH3Br与690mg(5mmol)K2CO3混合，加入丙酮50mL，回流反应12小时，过滤，回收丙酮，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分离得到化合物I a，收率84.2％。
实施例5
7-二氟亚甲基-5，4’-二甲氧基金雀异黄素(化合物I a)的合成
在一个100mL的烧杯中，加入960mg(3mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)和50mL 5％的氢氧化钠溶液，搅拌溶解，再加入1.3g(10mmol)硫酸二甲酯，室温搅拌反应24小时，有油状物生成，用乙酸乙脂提取有机产物，乙酸乙脂提取液用无水硫酸钠干燥，过滤，回收乙酸乙脂，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分离纯化得到化合物I a，收率91.3％。
化合物I a：

m.p.136-138℃.MS(EI，70ev)m/z：348(M+，100.00)，347(41.07)，302(25.34)，349(19.45)，132(18.11)，319(15.70)，317(13.69)，331(11.19)；IR υmax(cm-1，KBr)：1430，1469，1512，1580，1612，1637(C＝O)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：δ3.84(3H，s)，3.97(3H，s)，6.55(1H，d，J＝2.0Hz，)，6.65(1H，t，J＝72.4Hz)，6.73(1H，d，J＝2.0Hz)，6.94(2H，d，J＝8.8Hz)，7.47(2H，d，J＝8.8Hz)，7.82(1H，s，)；19FNMR(282MHz)：-82.150(d，J＝72.3Hz).
实施例6
7-二氟亚甲基-5，4’-二乙氧基金雀异黄素(化合物Ib)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、500mg(5mmol)CH3CH2Br与414mg(3mmol)碳酸钾混合，加入丙酮50ml，回流反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反应10小时后，原料斑点消失，放冷，过滤，回收丙酮，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分离得到化合物I b，收率76.5％。
化合物I b：m.p.96-97℃.IRυmax(cm-1，KBr)：1431，1476，1581，1613(C＝O)，1645，2874，2984；1H NMR(300MHz，CDCl3)：1.386-1.572(6H，m)，4.023-4.181(4H，m)，6.525(1H，d，J＝2.4Hz)，6.628(1H，t，J＝72.6Hz)，6.699(1H，d，J＝2.4Hz)，6.931(2H，d，J＝8.4Hz)，7.436(2H，d，J＝8.4Hz)，7.780(1H，s)；
实施例7
7-二氟亚甲基-5，4’-二正丙氧基金雀异黄素(化合物I c)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、560mg(5mmol)CH3CH2CH2Br与414mg(3mmol)碳酸钾混合，加入丙酮50ml，按实施例6方法操作，得到化合物I c，收率81.2％。
化合物Ic：IRυmax(cm-1，KBr)：1436，1469，1513，1581，1614，1651(C＝O)，2880，2968；1H NMR(300MHz，CDCl3)：0.972-1.120(4H，m)，1.157(3H，t，J＝7.5Hz)，1.223(3H，t，J＝7.5Hz)，3.987-4.164(4H，m)，6.643(1H，d，J＝2.4Hz)，6.761(1H，t，J＝72.6Hz)，6.807(1H，d，J＝2.4Hz)，7.053(2H，d，J＝9.0Hz)，7.547(2H，d，J＝9.0Hz)，7.886(1H，s)；
实施例8
7-二氟亚甲基-5，4’-二苯甲氧基金雀异黄素(化合物I d)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、513mg(3mmol)C6H5CH2Br与414mg(3mmol)无水碳酸钾混合，加入甲苯50ml，回流反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)，反应20小时后，原料斑点基本消失，放冷，过滤，回收甲苯，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分离得到化合物Id，收率86.1％。
化合物Id：IRυmax(cm-1，KBr)：1454，1513，1579，1614，1647(C＝O)，2926；1H NMR(300MHz，CDCl3)：4.636(4H，s)，7.314-7.342(18H，m)；
实施例9
7-二氟亚甲基-5，4’-二正庚氧基金雀异黄素(化合物I e)的合成
取一个100mL的园底烧瓶，安装电磁搅拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、537mg(3mmol)1-溴正庚烷(C7H15Br)与204mg(3mmol)乙醇钠，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，100~110℃搅拌反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)，反应24小时后，原料斑点基本消失，放冷，回收溶剂，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分离得到化合物Ie，收率72.4％。
化合物Ie：IRυmax(cm-1，KBr)：1433，1469，1581，1614，1652(C＝O)，2859，2956；1H NMR(300MHz，CDCl3)：0.906-2.016(26H，m)，3.950(2H，t，J＝6.6Hz)，4.047(2H，t，J＝6.6Hz)，6.512(1H，d，J＝2.1Hz)，6.648(1H，d，J＝2.1Hz)，6.764(1H，t，J＝72.9Hz)，6.893(2H，d，J＝9.0Hz)，7.412(2H，d，J＝9.0Hz)，7.759(1H，s)；
实施例10
7-二氟亚甲基-5，4’-二正辛氧基金雀异黄素(化合物If)的合成
取一个100mL的园底烧瓶，安装电磁搅拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、573mg(3mmol)1-溴正辛烷(C8H17Br)与204mg(3mmol)乙醇钠，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，100~110℃搅拌反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)至原料斑点基本消失，放冷，回收溶剂，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶6)分离得到化合物If，收率69.5％。
化合物If：IRυmax(cm-1，KBr)：1435，1467，1512，1569，1611，1651(C＝O)，2858，2929；1H NMR(300MHz，CDCl3)：0.860-1.218(30H，m)，3.985-4.064(4H，m)，6.378(1H，d，J＝2.1Hz)，6.423(1H，d，J＝2.1Hz)，6.531(1H，t，J＝74.1Hz)，7.155(2H，d，J＝8.7Hz)，7.543(2H，d，J＝8.7Hz)，7.748(1H，s)；
实施例11
7-二氟亚甲基-5，4’-二正癸氧基金雀异黄素(化合物Ig)的合成
取一个100mL的园底烧瓶，安装电磁搅拌、回流冷凝管和干燥管，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、573mg(3mmol)1-溴正癸烷(C10H21Br)与204mg(3mmol)乙醇钠，再加入干燥的二甲基甲酰胺50ml，按照实施例10操作，得到化合物Ig，收率62.9％。
化合物Ig；m.p.60-62℃.IRυmax(cm-1，KBr)：1658(C＝O)；1H NMR(300MHz，CDCl3)：0.848-1.783(38H，m)，3.966(2H，t，J＝6.6Hz)，4.040(2H，t，J＝6.6Hz)，6.513(1H，d，J＝2.1Hz)，6.627(1H，t，J＝72.3Hz)，6.674(1H，d，J＝2.1Hz)，6.925(2H，d，J＝8.4Hz)，7.423(2H，d，J＝8.4Hz)，7.753(1H，s)
实施例12
7-二氟亚甲基-5，4’-二异丁氧基金雀异黄素(化合物Ih)的合成
在一个100mL的园底烧瓶中，加入320mg(1mmol)7-二氟亚甲基金雀异黄素(化合物IV)、548mg(4mmol)(CH3)2CHCH2Br与690mg(5mmol)无水碳酸钾混合，加入丙酮50ml，吡啶3~5滴，回流反应，TLC跟踪反应(展开剂：乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)，反应18小时后，原料斑点基本消失，放冷，过滤，回收丙酮，残余物用柱层析(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶7)分离得到化合物I h，收率79.2％。
化合物Ih：IRυmax(cm-1，KBr)：1439，1472，1513，1579，1628，1650，2876，2963；1H NMR(300MHz，CDCl3)：0.809-11.057(12H，m)，2.176-2.198(2H，m)，3.759(2H，d，J＝6.6Hz)，3.783(2H，d，J＝6.6Hz)，6.568(1H，d，J＝2.4Hz)，6.627(1H，t，J＝72.9Hz)，6.656(1H，d，J＝2.4Hz)，6.984(2H，d，J＝9.0Hz)，7.446(2H，d，J＝9.0Hz)，7.941(1H，s)。
下述实施例中人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells，HUVEC-12，编号CRL-2480)引自北京大学医学院肿瘤研究所(来源于ATCC细胞库)。人单核细胞(THP-1)购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
实施例13
7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基异黄酮对血管内皮氧化损伤模型LDH活性的影响
7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基异黄酮类化合物的不同浓度组(10、1.0、0.1μmol/L)分别处理细胞24h后，用全自动生化仪测定H2O2(1.0mmol/L)孵育细胞培养液中的LDH活性。结果显示，H2O2孵育的内皮细胞培养液中LDH活性明显增高，由正常时的36.67±1.528U/L升高到110.67±4.041U/L，在所有的供试品中，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(Ia)降低H2O2诱导内皮细胞LDH活性增高最明显，其抗血管内皮氧化应激损伤作用效价强度为先导物Genistein的100倍，且其呈剂量依赖性(见图1)。
7-二氟甲基-5，4’-取代烷氧基异黄酮对血管内皮氧化损伤模型细胞凋亡的影响。
表1、本发明化合物对血管内皮氧化应激损伤模型内皮细胞凋亡的影响(x±s)

＊＊P＜0.01 vs H2O2损伤组
PI染色流式细胞分析术结果显示，H2O2孵育的内皮细胞，细胞凋亡率明显增高，由正常时的3.64％增高到14.0％。所有供试品中，7-二氟甲基-5，4-二甲氧基异黄酮(Ia)降低H2O2诱导内皮细胞凋亡作用最明显，Ia(0.1、1、10μmol/L)依次使细胞凋亡率降低到3.7％、3.37％、2.6％。其效果与Genistein(100μmol/L)相似(见表1，图2)。
实施例14
7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮血管内皮氧化应激损伤保护作用研究材料与方法
1.1材料
1.1.1药品与试剂
RPMI-1640、DMEM培养基   美国Gibco公司
新生牛血清              中国杭州四季青生物工程材料有限公司
胰蛋白酶                美国Amresco公司
过氧化氢(H2O2)          中国广州金华大化学试剂有限公司
二甲基亚砜(DMSO)        美国Amresco公司
维生素E(VitE)           美国Sigma公司
四甲基偶氮盐(MTT)       美国Sigma公司
台盼蓝                  美国Amresco公司
吖啶橙(AO)              美国Amresco公司
活性氧检测试剂盒        中国碧云天生物技术研究所
金雀异黄素(Genistein)，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮由湖南师范大学医学院药学系合成和鉴定。
1.1.2仪器
超净工作台             中国苏州净化设备公司，YJ-875型
倒置显微镜             日本Olympus公司
CO2细胞培养箱          美国SHEL-LAB公司
超低温冰箱             日本SANYO公司
高速离心机             德国Eppendorf公司，5804型
低温高速离心机         中国上海安亭科学仪器厂
Heto-Holten冷水循环仪  丹麦Gyde Vomg 17-19 3450 Allerod
Eppendorf加样器        德国Eppendorf公司
HANGPINC JA1003型皿式分析电子天平      上海天平仪器厂
全自动生化分析仪                       日本日立公司
流式细胞仪                             美国Beckerman counter EPICS-XL
酶联免疫检测仪                         美国Bio-Tek公司，ELX-800型
荧光显微镜                             日本Olympus公司
荧光分光光度计                         美国PerkinElmer公司，LS45型
去离子水纯化仪                         德国USF E1GA公司
1.1.3细胞
人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC-12，编号CRL-2480)引自北京大学医学院肿瘤研究所(来源于ATCC细胞库)。
人单核细胞(THP-1)购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。
1.2方法
1.2.1细胞培养
人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)，培养于含有10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2及饱合湿度的CO2培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶进行消化传代，1-2天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
人单核细胞(THP-1)，培养于含有10％新生牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2及饱合湿度的CO2培养箱中培养，2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2实验分组
1、空白对照组：弃原培养基并重新加入含1％新生牛血清的DMEM培养基
2、H2O2损伤组：在含1％新生牛血清的DMEM培养基中加入1mmol/L H2O2
3、溶媒对照组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入终浓度为0.01％的DMSO
4、先导化合物组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入100μmol/L genistein5、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮组：在加入1mmol/L H2O2前30min分别加入10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮
6、阳性药物对照组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入50μmol/L VitE
1.2.3细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性测定
培养HUVEC-12至细胞融合率达80％左右时，弃原培养基，换含1％新生牛血清的DMEM培养基，并在培养基中分别加入0、0.1、0.3、1.0、2.0、3.0mmol/L H2O2，孵育HUVEC-12细胞24h，收集培养液(每个样本收集1ml置于EP管内)，用全自动生化分析仪测定LDH含量。
1.2.4PI染色FCM检测细胞凋亡率
培养HUVEC-12至细胞融合率达80％左右时，弃原培养基，换含1％新生牛血清的DMEM培养基，并在培养基中分别加入0、0.1、0.3、1.0、2.0、3.0mmol/L H2O2，孵育HUVEC-12细胞24h。收集细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，用含10％新生牛血清的DMEM培养基吹打，制成单细胞悬液，1000rp/min，4℃离心5min。弃上清液，冷PBS重悬再离心，1000rp/min，4℃离心5min，如此重复两次。用50ulPBS将细胞制成单细胞悬液，移入冷70％乙醇1ml中固定，PI染色上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.5MTT比色法测定血管内皮细胞增殖抑制率
取对数生长期的HUVEC-12细胞，以6×104/mL的密度接种于96孔培养板，每孔加180μL单细胞悬液，置细胞培养箱中培养4h，待细胞贴壁后按上述实验分组二处理细胞，每组设三个复孔，孵育24h，每孔加入MTT(5mg/mL)20μL，继续培养4h后终止，小心吸弃培养基上清，每孔加入DMSO100μL，震荡10min使蓝紫色结晶充分溶解。用酶标仪(ELX-800型)在570nm波长处测定吸光度值(OD值)，并根据OD值，计算细胞增殖抑制率(IR)＝(空白组均值-实验组均值/空白组均值)×100％。以上实验重复三次。
1.2.6台盼蓝染色细胞计数法测定血管内皮细胞成活率
取对数生长期的HUVEC-12细胞，以1×105/mL的密度接种于24孔培养板，每孔加1mL单细胞悬液，置细胞培养箱中培养4h，待细胞贴壁后按上述实验分组二处理细胞，每组设三个复孔。孵育24h后终止，用0.25％胰蛋白酶消化后，用DMEM培养基配成单细胞悬液，取9滴单细胞悬液与1滴0.4％的台盼蓝染液均匀混合后，于倒置显微镜下观察细胞所呈现的颜色，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞由于其细胞膜完整，对台盼蓝拒染而不着色，折光性好。用10×物镜观察计数板四个大方格中的细胞数，细胞数＝四个大方格之和/4×104。按细胞成活率(％)＝实验组活细胞数/空白组活细胞数×100％，评价细胞活力。以上实验重复三次。
1.2.7吖啶橙染色荧光显微镜观察血管内皮细胞的凋亡
取对数生长期的HUVEC-12细胞，以1×105/mL接种于24孔培养板，每孔加1mL单细胞悬液，置细胞培养箱中培养4h，待细胞贴壁后按上述实验分组二处理细胞，每组设三个复孔。孵育24h后终止，用0.25％胰蛋白酶消化后，用DMEM培养基配成单细胞悬液，取25μL细胞悬液与2μL吖啶橙储存液(0.1g/L吖啶橙/PBS)混匀，在室温下孵育5min。再取10μL滴于载玻片上铺匀，在荧光显微镜下观察细胞形态的改变，并计数200个细胞中的凋亡细胞数，计算凋亡指数(％)＝凋亡细胞数/200×100％。
1.2.8活性氧的测定
培养HUVEC-12至细胞融合率达80％左右时，弃原培养基，换含1％新生牛血清的DMEM培养基，同时按上述实验分组二处理细胞，继续孵育24h。收集细胞，0.25％胰蛋白酶消化后，用无血清的DMEM培养基吹打，制成单细胞悬液，1000rp/min，离心5min。弃上清液，用1mL无血清的DMEM培养基重悬细胞，并转入1mLEP管中，再用1000rp/min，离心5min。弃上清液，用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，每支EP管加入1mL，调节细胞浓度为1×106-2×107/ml，置细胞培养箱中孵育20min后用无血清的DMEM培养基洗涤三次，然后上流式细胞仪检测。其中作为阳性对照的EP管内加入1μL阳性对照(Rosup，50mg/mL)，刺激30min后上流式细胞仪检测。
2结果
2.17-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响
图3可见：H2O2孵育的血管内皮细胞培养液中LDH活性明显增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮呈浓度依赖性的降低H2O2诱导血管内皮细胞LDH的释放，表明，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮能够拮抗过氧化氢对血管内皮细胞的损伤。而对于单核细胞培养液中LDH活性的测定结果表明，各组间无显著性变化。
2.2MTT比色法测定血管内皮细胞增殖抑制率
MTT比色法结果显示，H2O2孵育24h的血管内皮细胞增殖活性明显下降，细胞相对抑制率高达73％，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮能呈浓度依赖性的降低H2O2处理的细胞抑制率，其0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮使H2O2诱导的细胞抑制率分别降低到67.9％、57.8％、50.7％、47.0％、39.3％，按等摩尔浓度计算，其作用强度为Genistein的100倍(见表3-1，图4)。
表3-1、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对HUVEC-12细胞增殖活性的影响(x±s)


2.3台盼蓝染色细胞计数法测定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞生长的影响
图5示，以空白对照组的成活率为100％作为对照，H2O2孵育细胞24h后，细胞成活率仅为7.89％。不同浓度的7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮与H2O2共同孵育细胞，呈浓度依赖性的提高H2O2孵育内皮细胞成活率，0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮使其细胞成活率分别提高到39.47％、47.37％、52.63％、53.95％、78.95％。
2.4PI染色FCM检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡的影响
PI染色FCM检测结果显示，H2O2(1.0mmol/L)与内皮细胞孵育24h后，明显诱导细胞凋亡(43.37±20.97％ vs 5.48±1.32％，p＜0.01)，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(0.1、0.3、1.0、3.0、10μmol/L)依次降低氧化诱导的细胞凋亡，其细胞凋亡率分别为22.33±7.97％、18.77±7.25％、15.81±12.07％、14.73±5.13％、5.35±0.89％，按等摩尔浓度计算，其作用强度为Genistein的10倍(见图6、图7)。
2.5吖啶橙染色荧光显微镜观察7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞凋亡的影响
吖啶橙染色荧光显微镜观察发现：未经H2O2处理的空白对照组细胞形态正常，胞核发出黄绿色均匀荧光，而H2O2损伤组细胞呈现明显的凋亡形态学改变，可见核固缩、核碎裂及凋亡小体。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮预处理后，凋亡细胞明显减少，其凋亡指数呈浓度依赖性的降低，效果好于先导物Genistein(见图8、图9)。
2.6 7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导HUVEC-12细胞活性氧形成的影响DCFH-DA激活荧光FCM测定结果表明，未经H2O2处理的空白对照组细胞内活性氧含量低，平均荧光强度只有6.57±1.07，而H2O2(1mmol/L)损伤24h后，细胞内的活性氧急剧增加，平均荧光强度达13.00±1.90。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮能有效降低氧化损伤内皮细胞内活性氧的含量，其作用呈浓度依赖性(图10、11)。
3.讨论
许多研究显示活性氧(reactiveosygenspecies，ROS)，即氧自由基及其衍生物与细胞凋亡密切相关[44，45，15，16]。例如，一定浓度的过氧化氢能诱导某些类型的细胞(如血管内皮细胞、HL60细胞)凋亡，氧化的低密度脂蛋白可诱导淋巴细胞凋亡，过氧亚硝基自由基可诱导胸腺细胞凋亡等。本实验发现7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(Ia)对过氧化氢与人脐静脉内皮细胞共孵育24h后，ROS的增高和凋亡增加有显著抑制作用，呈浓度依赖性。Ia(0.1μmol/L)的作用效果与先导化合物genistein(100μmol/L)相当。说明Ia能通过其更强的抗氧化作用保护血管内皮的氧化应激损伤。
过氧化氢作为氧化应激源处理细胞，低浓度就可引起细胞通透性增加，屏障功能低下和细胞增殖，但本实验MTT法和台盼蓝染色细胞计数法检测结果证实1.0mmol/L过氧化氢处理人脐静脉内皮细胞24h后，血管内皮细胞生长和增殖表现为抑制效应。Ia能有效地降低氧化应激损伤模型血管内皮细胞的生长增殖抑制作用，并与降低活性氧的程度平行。说明Ia能通过降低活性氧机制拮抗过度氧化应激损伤所致的血管内皮细胞增殖抑制。
乳酸脱氢酶(LDH)活性是反映细胞功能的一个经典指标，LDH活性增高表明细胞功能受到损伤。本实验结果进一步证实Ia能降低氧化应激损伤血管内皮LDH活性增高，提示Ia对血管内皮氧化应激具有保护作用。
本实验通过MTT比色法和台盼蓝染色细胞计数法测定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(Ia)对氧化应激损伤HUVEC增殖活性的影响，通过测定培养液上清乳酸脱氢酶活性，评价Ia对氧化应激HUVEC细胞功能损伤的保护作用。采用吖啶橙染色荧光显微镜观察和PI染色流式细胞计分析Ia对氧化应激诱导HUVEC凋亡的拮抗作用，激活荧光流式细胞计分析Ia对氧化应激内皮细胞反应活性氧的抑制作用。系统地研究候选药物体外抗血管内皮细胞氧化应激损伤作用。充分肯定7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对血管内皮细胞氧化应激损伤具有保护作用，呈浓度依赖性，其效价强度高于先导化合物genistein。
4.结论
1)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮具有显著抗氧化作用。
2)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对血管内皮氧化应激损伤具有保护作用。
实施例15
7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导内皮细胞-单核细胞粘附抑制作用研究
1方法
1.1细胞培养
人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)，培养于含有10％新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％CO2及饱合湿度的CO2培养箱中培养，用0.25％胰蛋白酶进行消化传代，1-2天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
人单核细胞(THP-1)，培养于含有10％新生牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃、5％CO2及饱合湿度的CO2培养箱中培养，2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2实验分组
1、空白对照组：弃原培养基并重新加入含1％新生牛血清的DMEM培养基
2、H2O2损伤组：在含1％新生牛血清的DMEM培养基中加入1mmol/L H2O2
3、溶媒对照组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入终浓度为0.01％的DMSO
4、先导化合物组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入100μmol/L genistein
5、7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮组：在加入1mmol/LH2O2前30min分别加入10、3.0、1.0、0.3、0.1μmol/L7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮
6、阳性药物对照组：在加入1mmol/L H2O2前30min加入50μmol/L VitE
1.3荧光分光光度计检测单核细胞和血管内皮细胞的粘附
取生长状态良好的HUVEC-12细胞，以1×105/ml接种于96孔培养板，每孔加200μl单细胞悬液，置细胞培养箱中培养24h后弃原培养基，PBS洗涤一次，每孔加入100μlTHP-1单细胞悬液(细胞浓度为1×106/mL)，同时按上述实验分组二处理细胞，每组设三个复孔。置细胞培养箱中继续孵育24h后，用100μL PBS洗孔三次，以除去未粘附细胞。将未粘附细胞收集于10mL离心管中，1000rp/min，离心5min，加入500μLPBS，每支离心管内再加入40μL吖啶橙(25μl∶2μL)，室温下孵育5min。1000rp/min，离心5min，PBS洗3遍，加2.5mlPBS重悬，上荧光分光光度计测定荧光强度，并计算粘附率(％)＝(纯HUVEC-12细胞组荧光值+纯THP-1细胞组荧光值-实验组荧光值)/(纯HUVEC-12细胞组荧光值+纯THP-1细胞组荧光值)×100％。
1.4ELISA法检测血管内皮细胞E-Selectin、ICAM-1的表达
取对数生长期的HUVEC-12细胞，以1×104/mL接种于24孔培养板，每孔加1mL单细胞悬液，培养24h细胞融合率达80％左右时，弃原培养基，换无血清DMEM培养基，同时按上述实验分组二处理细胞。置细胞培养箱中继续培养24h，在无菌条件下将细胞培养液吸至1mL EP管内，10000rp/min，4℃离心15min，再吸取上清液至另一新1mLEP管内备用。根据ELISA试剂盒的检测步骤逐步操作，再根据测定的样品OD值绘出标准曲线，在曲线图上查出相应的E-Selectin、ICAM-1的含量。
2.结果
2.1荧光分光光度计检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导血管内皮细胞和单核细胞粘附的影响
荧光分光光度计检测结果显示，H2O2(1mmol/L)孵育血管内皮细胞24h后，能显著增加单核细胞和血管内皮细胞的粘附，H2O2损伤组粘附率为80.92％，空白对照组的粘附率只有35.02％。7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮能有效抑制氧化应激诱导的单核细胞-血管内皮细胞粘附，其粘附率呈浓度依赖性的降低(见图12)。
2.2 ELISA法检测7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导血管内皮细胞E-Selectin、ICAM-1释放的影响
图13、14可见，血管内皮细胞经H2O2(1mmol/L)处理24h后，其E-Selectin、ICAM-1的释放均较空白对照组有明显增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮对氧化诱导血管内皮细胞E-Selectin、ICAM-1的释放有抑制作用，且其作用呈浓度依赖性。
3.讨论
黏附分子是一类介导细胞与细胞间或细胞与细胞外基质间相互作用的膜表面糖蛋白，广泛分布于体内，他们在胚胎的发育和分化、炎症与免疫应答、凝血与血栓形成及肿瘤的浸润和转移等多种生理、病理过程中均具有重要作用[16，17]。动脉粥样硬化病灶的发生发展是动脉壁细胞、细胞外基质、血液成分、环境及遗传等诸多因素相互作用的结果，其中由黏附分子介导的血管内皮细胞与单核细胞和白细胞的黏附是动脉粥样硬化早期特征和关键步骤。脂质代谢紊乱、高血压、糖尿病、吸烟等诸多危险因素使血管内皮细胞受损，活化的内皮细胞表面表达大量的黏附分子，主要有P-selectin、E-selectin、ICAM-1、VCAM-1、PECAM-1等。Sakai等[7]研究发现，新西兰兔及遗传性高脂血症兔(WHHL)VCAM-1、P-selectin等黏附分子的表达随着血脂水平升高逐渐增加，并且早于单核细胞与内皮细胞的黏附。免疫组化检测发现斑块内内皮细胞表达ICAM-1、VCAM-1和P-selectin，表达程度与内膜下单核-巨噬细胞和T淋巴细胞密度密切相关。
本实验结果表明，氧化应激损伤内皮细胞使血管内皮-单核细胞的粘附率显著增高，7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(GEN-1)和先导化合物genistein及抗氧化剂Vit E均能有效抑制氧化应激诱导的血管内皮-单核细胞粘附。GEN-1(0.3μmol/L)与genistein(100μmol/L)和Vit E(50μmol/L)的抑制强度相当。说明GEN的抑制氧化应激诱导的血管内皮-单核细胞粘附作用的效价强度高于genistein和Vit E。
我们通过ELISA法检测培养液上清中黏附分子E-Selectin、ICAM-1的浓度进一步证实过氧化氢处理血管内皮细胞粘附分子E-Selectin、ICAM-1的释放增加，I a具有抑制氧化应激损伤血管内皮细胞诱导的E-Selectin、ICAM-1释放作用。说明I a是通过抑制E-Selectin、ICAM-1的释放发挥抗氧化应激损伤血管内皮细胞-单核细胞粘附作用。
4.结论
1)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(Ia)能有效抑制氧化应激诱导的血管内皮-单核细胞粘附。
2)7-二氟甲基-5，4’-二甲氧基异黄酮(Ia)通过抑制E-Selectin、ICAM-1的表达和释放发挥抗氧化应激损伤血管内皮细胞-单核细胞粘附作用。
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