说明书用于制备组织移植物的装置和方法
本申请要求于2005年7月12日提交的美国专利申请系列第60/697,954号和于2005年12月22日提交的美国专利申请系列第11/314,281号的优先权，将上述两者均以引用方式结合于本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的陈述
本发明是在由美国军队医学研究和材料指挥部(United StatesArmy Medical Research and Material Command)授予的资助号为#W81XWH-04-1-0503和#W81XWH-05-1-0620的政府支持下作出的。
技术领域
本发明涉及组织工程系统，其涉及用于制造组织植入物和移植物的哺乳动物细胞和细胞产物，其中组织植入物和移植物包括但不限于人造血管和动静脉移植物。本发明尤其涉及通过持续加压细胞铺坪法(持续加压细胞铺植法，sustained pressure cell sodding)将衍生自脂肪的间质细胞或其它细胞粘连(粘附)到可渗透支架材料的方法和自动化装置，其包括利用包含待沉积在材料上的细胞的介质来穿过可渗透材料施加持续压力梯度(sustained pressuregradient)。本发明的方法和装置促进细胞在支架材料上的加速粘连和成熟。利用持续加压铺坪法和手术室相容的自动化，本发明的优选实施例使得可以从患者脂肪组织的样品中收获患者自己的细胞，洗涤、分离、并沉积这些细胞，以制备供临床使用的适宜的移植物。这样的实施例涉及细胞提取，接着是自动化的、无菌、封闭系统中的持续加压铺坪法。
背景技术
组织工程学正朝向用于受损或患病组织和器官的修复和重建的临床用途方向发展。尤其是，在心脏和外周血管的领域中，血管移植物的研发是主要目标。在第一世界，心血管疾病是死亡率和发病率的主要原因。护理的标准，自体移植物并不是没有严重的发病率。患有系统性疾病的患者(其没有留下适当的自体移植物材料或已经经受自体移植物，仅在美国每年有100,000个患者)几乎没有自体移植物选择。
因此研究者研究合成移植物已超过30年。主要挑战是提供这样的移植物材料，其是生物相容的，即，非血栓基因的、非免疫原性的、抗机械性的(硬质的，mechanically resistant)，并且具有可接受的伤口愈合和生理反应(例如，血管收缩/舒张反应、溶质运输能力等)。此外，组织移植物材料应易于处理、储存和运输，并且商业上是可行的。
导管具有两种主要失效模式(failure mode)：机械的和生物的，其是由导管内的血栓症以及随后的阻塞和/或细胞向内生长所引起的。具有能够承受动脉压的材料性能的合成导管是普通的，使得寻找非血栓基因的材料成为主要的研究兴趣。从患者获得的内皮细胞已经呈现出可以降低植入导管的致血栓性(thrombogenicity)(Williams et al.，1994，J.Vasc.Surg.，19：594-604；Arts et al.，2001Lab Invest 81：1461-1465)。
在合成移植物内建立非血栓基因细胞衬垫(细胞内衬，celllining)的过程中内皮细胞是非常重要的。因此，希望在大约几分钟或几小时内借助于仪器在可渗透基质、支架、或其它可渗透细胞基底材料中或之上实现快速的细胞粘连，其中仪器适合于手术室环境，保持无菌屏障，易于使用，并且产生一致的移植物结果。
目前，有四种主要方式来满足这些要求(但具有有限的成功)：(i)使用去细胞化组织材料；(ii)使用自组装机制，其中细胞被培养在培养基中的组织培养塑料上，其诱导细胞外基质(ECM)合成；(iii)使用合成的生物可降解聚合物，之后在其上接种细胞并在模拟的生理环境中进行培养；以及(iv)使用生物聚合物，如再生I型胶原凝胶，其借助施加机械力被形成并和组织细胞压紧以模拟生理环境(参见，例如，Robert T.Tranquillo，2002，Ann.N.Y.Acad.Sci.，961：251-254)。
涉及瞬间高压的压力梯度已用来通过筛分作用将细胞沉积到可渗透支架上，即，提供总体流动并利用具有小于细胞群体的孔的基质或支架材料，因而在基质中捕获细胞(例如，美国专利5,628,781；Williams et al.，1992，J Biomed Mat Res 26：103-117；Williams et al.，1992，J Biomed Mat Res 28：203-212.)。这些捕获的细胞已经显示出随后粘连于支架材料，但由于不能完全满足上述成功移植物的必要条件，即，生物相容性、机械强度、以及必要的生理性能，因而仅具有有限的临床应用。
从20世纪70年代后期开始，内皮细胞接种在实验上就用来改善小直径聚合物血管移植物的开放性(patency)以抵抗不良反应。自那时起，针对此目标已取得进展，其中大多数进展集中于设计生物或生物杂交移植物。
内皮细胞比最初认为的要更为复杂，因为它们并不仅仅在血管的内腔表面上产生单细胞衬垫。内皮细胞还释放用来调节凝固作用、血小板聚集、白细胞粘附、以及血管紧张度的分子。在没有这些细胞的情况下，例如，在植入的合成聚合物血管移植物的内腔的情况下，宿主反应发展到最终失败。在植入后的最初三十天内开放性的丧失是起因于急性血栓症。早期失效是生物材料的血液接触表面(其被非内皮化)的固有致血栓性的结果。到此为止，仅有的已知完全非血栓基因材料是内皮；与血流接触的任何其它材料倾向于血小板沉积以及随后的血栓症。小直径聚合物血管移植物的长期失效模式为，导致开放性丧失的吻合性增生(anastomotic hyperplasia)。引发吻合性增生背后的精确机制仍有待确定；然而，可能涉及内皮细胞和平滑肌细胞功能异常以及不适当的通讯。
小直径移植物开发领域中的早期工作者力求促进移植物内皮化，从而在植入以前通过将不同程度的自体内皮细胞移植到血管移植物上来增加开放性。这种方法已公知为内皮细胞接种法(部分覆盖，其依赖于持续细胞增殖)或细胞铺坪法(细胞铺植法，cellsodding)(完全覆盖)。基本的假设是相当简单的：即，通过促进患者自己的内皮细胞在人造血管(血管假体，vascular prosthesis)的血液接触表面上的建立，“正常的”内皮细胞衬垫(cell lining)和相关的基膜(一起称作新内膜)将形成在移植物上并抵抗流变力、生理力、以及生物材料力，这些作用力协同作用以助长移植物失效。在此领域的30年研究(包括有希望的动物数据)以后，这种简单假设还没有产生临床装置。
内皮接种移植物的失效模式相同于未处理的聚合物移植物，即血栓症和内膜增生。失效模式至少部分地与移植物的腔表面上缺少功能性内皮层(新内膜)和/或异常内皮细胞与平滑肌细胞直接和间接通相通有关。在早期人试验中这些失效会发生，尽管接种移植物的成功范例正发展成细胞衬垫发育(cell lining development)。这些数据表明，在动物模型中，在聚合物血管移植物腔表面上的新内膜形成是通过来自周围吻合动脉的内皮细胞增殖而发生的，移植物小间隙的微血管、或循环起源内皮细胞并不严格地来自接种的细胞。
内皮细胞接种的潜在来源是微血管内皮细胞(MVEC)。Williams等人在他们的实验室中首先采用(开辟，pioneer)了新鲜分离和培养的人、犬、兔、大鼠、牛以及猪内皮细胞，尤其是MVEC，以研究细胞功能。人MVEC的来源是来自美容吸脂术的抽吸组织。取决于细胞群体的最终用途，使用了两种独立方案用于人脂肪MVEC分离。这些方案的差异在于分离复杂性：从用于人或动物移植物的立即铺坪(immediate sodding)的简单的手术室相容程序到更为精细的程序(如果随后将培养MVEC的话)。
通过使用吸脂术来增强人MVEC的分离以获得人脂肪的样品。通过吸脂术插管(liposuction cannula)抽吸脂肪的方法将皮下脂肪分离成小片，其可以加强消化过程的效力。可以在37℃下用胶原酶(4mg/cc)消化脂肪20分钟，其释放＞106个细胞/克脂肪。这些MVEC可以通过梯度离心与脂肪分离。MVEC将形成圆颗粒(pellet)并且随后在弃去上清液以后可以再悬浮在培养基中。这些细胞已经历常规表征以确定主要分离物的细胞组成。借助于这种程序分离的大多数细胞是内皮细胞，这是由于它们具有冯·维勒布兰德抗原(von Willebrand antigen)的表达、缺少间皮细胞特异性细胞角蛋白的表达、血管紧张肽(血管紧张素)转化酶、前列环素以及前列腺素E2的合成、基底膜胶原的合成以及微胞饮疱囊的形态表达。
进行了人临床试验以评估在需要外周旁路的患者中的内皮细胞移植。在试验期间，将大量的内皮细胞直接放置在ePTFE移植物的腔表面上。为了改善细胞沉积，在包含自体血清的培养基中对所有移植物进行预润湿。在2×105个细胞/cm2移植物腔面积的密度下，细胞悬浮在相同的培养基中。将此溶液保持在5psi的跨壁(cross-wall)、或透壁压力梯度下以迫使细胞到表面上，此方法称作加压铺坪法(pressure sodding)。在制度获准以后，对11位患者进行登记并接受实验移植物。在外科手术准备期间，患者经受吸脂术以取出大约50克腹壁脂肪。利用上述程序对脂肪进行处理并将得到的细胞群体加压铺坪到所希望的移植物上，然后立即植入。在随访4年多以后，这些移植物保持类似于隐静脉血管移植物的开放速率(patency rate)。
先前已使用涉及瞬时(＜1分钟)相对高压(250mmHg)的压力梯度来通过筛分作用将细胞沉积到可渗透支架上，即，提供总体流动并利用具有小于细胞群体的孔的基质或支架材料，因而在基体中捕获细胞(例如，美国专利5,628,781；Williams et al.，1992，JBiomed Mat Res 26：103-117；Williams et al.，J Biomed Mat Res 28：203-212)。然而，尽管有上述进展，但至今临床冠状动脉适用性受到限制，这是因为导管并不保持足够粘性的非血栓发生表面，因此研究集中于另外的体外成熟时间。
在建立非血栓发生细胞衬垫(non-thrombogenic cell lining)中内皮细胞具有非常重要的作用。此外，仍然需要有效且可靠的方法以在手术室装置中的合成移植物上产生内皮细胞衬垫，因此本发明提供了一种解决方案。希望在可渗透基体、支架、或其它可渗透细胞基质材料中或之上在几分钟或几小时内借助于仪器实现快速的细胞粘连，其中仪器适合于手术室环境、保持无菌屏障、易于使用、产生一致的移植物产物、并且便宜。本发明使得能从脂肪组织中分离大量的内皮细胞以及进行合成移植物的快速细胞铺坪，并且使得能用总控键(turn-key)、手术室已备仪器实现细胞的自动化和粘连，从而快速铺坪移植物。除了用于植入的移植物的衬垫以外，本发明可以具有其它用途。
发明内容
本发明提供了装置和方法以在组织工程期间实现在基质、支架、或其它细胞基质材料中或之上的快速细胞粘连，其中涉及一种自动化方法和装置来从患者脂肪组织的样品中获得患者自己的细胞，以及洗涤、分离、并将这些细胞沉积在适宜的移植物上供临床应用。
本发明是部分地基于本发明人的发现：优选在细胞灌注系统中，穿过移植物支架或基质材料形成的约5分钟直到约24小时的持续低压梯度可以提供比应用先前已知的方法显著更加快速的细胞在基质材料上的粘连以及其后的成熟。采用持续低压来在可渗透材料上铺坪细胞还提供对细胞活化和分化途径的更大控制，而缺少上述控制已阻止了先前组织工程的努力。本发明还提供了一种自动化的、无菌和安全的方法和装置以在短时间内在适宜的移植物上形成细胞供临床应用，以及提供了用于收集适合于治疗用途的细胞样品的方法和装置。本发明进一步提供了将通过本文描述的装置制备的组织移植物和细胞样品用于多种疗法的方法，其中所述疗法包括血管再生、组织和器官的再生以及重建，以及疾病的治疗和预防。
本发明还涉及细胞铺坪生物室，其提供了受控的持续透壁流动，从而产生穿过多孔材料的持续压差梯度，以便借助于细胞的粘附、生长、以及分化来制备组织植入物和移植物。
附图说明
图1图解说明了本发明的自动化装置的一个实施例的示意图。
图2图解说明了本发明装置的一个实施例的透视图。
图3示出了根据本发明的导管生物室，其具有用于引入细胞的近侧调节旋塞(stopcock)，以及Y形连接器，该Y形连接器便于施加跨壁压力(跨壁压)，接着是腔流动。
图4A-4D示出了根据本发明的另一种生物室的视图。该实施例采用管状构造。辅助设备，如用于引入细胞的调节旋塞、用于施加透壁和透腔流动的Y形连接器、以及相关的自动化灌注设备，则未示出。这样的设备可以是任何适宜的设备，其包括但不限于如图1所示的设备。
图5提供了包括细胞分离单元、铺坪单元以及移植物室的装置的一个实施例的透视图。
图6示出了细胞分离模块的耐用和一次性部件。
图7提供了细胞分离模块的透视图，其中一次性部件被加载到细胞分离耐用部件上。
图8示出了移植物铺坪模块的耐用和一次性部件。
图9示出了移植物铺坪模块耐用部件，其连接于加载有供使用的一次性部件的细胞分离单元。
图10示出了移植物铺坪耐用和一次性部件中的主要部件。
图11示出了细胞收集模块的耐用和一次性部件。
图12示出了细胞收集模块耐用部件，其连接于加载有供使用的一次性部件的细胞分离模块。
图13示出了安装好的条线码扫描器。
图14示出了离心碗(centrifuge bowl)的一个实施例的截面图。
图15图解说明了总系统流程。
具体实施方式
本发明提供了通过施加压力(优选为持续低幅度压力)将细胞粘连或“铺坪”到任何适宜的移植物支架或其它可渗透基质材料上而制备各种组织植入物或移植物的装置和方法。在具体实施例中，组织是管状组织，如血管组织。然而，本发明还可以应用于任何类型的组织移植物，这些组织移植物涉及将细胞粘连到支架或其它基质材料，其包括但不限于皮肤、软骨、骨、骨髓、腱、韧带、胃肠道、生殖泌尿道、肝、胰、肾、肾上腺、粘膜上皮、以及神经移植物。该方法特别很好地适合于管状组织，其包括但不限于心血管系统和泌尿系统的管状组织。
当在本文使用时，术语“持续低幅度压力”是指这样的压力，其具有约10mmHg、约15mmHg、约20mmHg、约25mmHg、约30mmHg以及约55mmHg的压力头，时间周期为约5分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时，以增强细胞的粘连、生长和/或分化。按照细胞、组织移植物、基质材料的类型、以及本文所给出的教导，本领域的普通技术人员可以选择适当条件来施加具体的低幅度持续压力。
待粘连的细胞可以包括，例如，成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞、浆细胞、肥大细胞、脂肪细胞、组织特异性实质细胞(薄壁组织细胞)、内皮细胞、尿路上皮细胞(尿道上皮细胞，urothelial cell)、以及在组织工程应用中遇到的各种其它类型的细胞，其包括来自各种组织来源的未分化的成体干细胞。在优选实施例中，粘附细胞是内皮细胞，更优选为获自富含自体微血管的脂肪组织的人微血管内皮细胞，如参见美国专利第4,820,626号(Williams等，公布于1989年4月11日)、第5,230,693号(Williams等，公布于1993年7月27日)、以及第5,628,781号(Williams等，公布于1997年5月13日)，将所有上述专利的全部内容以引用方式结合于本文。粘附细胞可以是自体的、同种异体的、或异种的，但优选为起源上自体的。
本发明中使用的移植物基质(“支架”)材料可以是各种尺寸和几何形状的任何优选可渗透材料。该材料可以是天然或合成材料，其包括但不限于聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚氨基甲酸酯、或膨胀型聚四氟乙烯(ePTFE)。在另一实施例中，移植物支架可以是生物聚合物，如胶原。该材料可以是凝血前的和/或弹性蛋白、或同种异体移植物导管，如冷藏静脉、去细胞化静脉或动脉。在又一实施例中，支架可以是复合材料，如具有聚合物涂层(例如表面上的电纺丝，electrospun)的弹性蛋白支架，以改善机械性能。可以用蛋白质(例如，白蛋白)或血浆对材料进行预凝血或预处理，其在某些具体实施例中可以用来进一步增强组织细胞在基质材料上的粘附、铺展、以及生长。移植物基质或支架可以通过任何适宜的方法来构造，其中所述方法包括但不限于那些在Liu，T.V.et al.，2004，Adv.Drug.Deliv.Rev.56(11)：1635-47；Nygren，P.A.et al.，2004，J.Immunol.Methods 290(1-2)：3-28；Hutmacher，D.W.et al.，2004，TrendsBiotechnol.22(7)：354-62；Webb，A.R.et al.，2004，Expert Opin.Biol.Ther.4(6)：801-12；以及Yang，C.et al.，2004，BioDrugs 18(2)：103-19中提及的方法。
当在本文中使用时，术语“跨壁压力或流动”是指穿过移植物支架的壁从移植物支架的一侧到另一侧的压力或流动。在移植物支架是管状移植物支架的情况下，该术语是指从移植物的内腔或毛细管内(IC)空间到移植物的外侧或毛细管外(EC)空间的压力或流动。
当在本文中使用时，术语“透腔压力或流动”是指通过管状移植物的内腔的压力或流动。术语“透腔流动”和“透腔灌注”可以互换地使用。虽然在本发明中对于细胞粘连不需要透腔灌注，但例如在透壁流动以后，它可以用来提供训练或清洁效应。在这种情况下，高达并包括生理流速(约160ml/min)的流速是优选的，虽然低至5ml/min的流速通常足以提供能够承受随后的生理流动的细胞粘连。
当在本文中使用时，术语“近侧”是指相对于生物室导管的中心在介质流入一侧的参照点(参见图4)。
当在本文中使用时，术语“远侧”是指相对于生物室导管的中心在介质流出一侧的参照点(参见图4)。
术语“毛细管内(IC)”是指管状移植物支架的内腔或内部空间，并且可以互换地称作“透腔”或“腔内”。
术语“毛细管外(EC)”是指管状移植物支架的外部空间并且可以互换地称作“血管外”或“腔外”。
现在参照图1。图1图解说明了系统120的一个实施例，该系统包括可选的一次性袋(一次性袋，disposable bag)100，其可以被加载入适宜的硬装置中以用于手术室或其它无菌环境中或附近，从而收获要沉积到适宜移植物上的细胞。一次性袋100包括组织分离化学贮存器20、介质贮存器10和废物贮存器30。在使用中，可以对贮存器20和介质贮存器进行预加载。优选地，组织分离化学贮存器20包含胶原酶。
系统120进一步包括浸渍器和加热器50、泵60、浮力分离器40以及生物室70。泵60可以是任何适宜的泵或泵的组合，其包括但不限于齿轮泵、蠕动泵、隔膜泵、离心泵、以及由流体柱产生的被动压头。在一个实施例中，生物室70是一种导管生物室，如在下文以及在2005年12月22日提交的共同未决美国专利申请系列第11/314,281号中所讨论的导管生物室，将上述专利申请以引用方式结合于本文。
优选的系统120可以用来从患者的组织中分离细胞以及将这些细胞的所希望的分馏物沉积到移植物材料上。这可以在手术室装置中以自动化方式并在临床可行的时间范围(时间框架，timeframe)内完成。临床可行的时间范围通常被认为是约30分钟至约24小时，其取决于各种因素，如细胞类型、原材料的量、需要的移植细胞的量、细胞层成熟为组织所需要的时间等。相关领域中的技术人员可以容易地理解这些因素。
优选的系统提供了持续加压铺坪和从组织中分离患者细胞的所希望分馏物的临床程序的自动化，以及下述的一种或多种：过滤、洗涤、加热、浸渍、蛋白水解释放、分离、再悬浮、以及将细胞加压铺坪到可渗透移植物上。
更具体地说，仍然参照图1示例性实施例，优选预加载组织分离化学贮存器20和介质贮存器10。通过入口90将待移植的细胞输入系统120。细胞优选来自患者的脂肪组织，其是借助于相对非侵入性装置如TulipTM系统加以收集。首先过滤器18中洗涤和过滤细胞，以从细胞(如红血球)中除去小颗粒。通过阀门14，小颗粒被过滤到废物贮存器30。通过关闭阀门34和14并使介质从介质贮存器10流过导管76和38来混合细胞的剩余部分与来自介质贮存器10的介质。通过由泵60经由导管28和24以及经由开阀12和16泵出并且与组织分离化学贮存器20中的蛋白酶进行混合而将介质与细胞进行混合。通过这种操作，混合经洗涤的细胞、介质以及蛋白酶。
通过流过导管26，在浸渍器和加热器50中浸渍和加热混合产物。可以通过任何增加组织表面积的方式来实现组织的浸渍，从而在较小细胞损伤的情况下允许组织上的更高的蛋白酶活性。浸渍器和加热器50可以是合并的或分开的，并且可以包括任何适宜的装置，如离心式叶轮、混合器、螺旋式混合器等。
浸渍器中的组织浆液优选保持在约35至约40℃的温度下，优选约37℃，以便保持高细胞生存力以及使蛋白酶具有最大活性。可以以许多方式(包括例如电阻加热元件、电-热块(peltier blocks)等)来实现加热，并且可以通过任何适宜的传导性介质(包括水浴)、以及通过任何适宜的导热贮存器材料将热量传递到组织浆液。
优选地，在浸渍浆液的同时、或在任何其它所希望的或适当的时间，使用者可以将患者的血清输入系统中。通过输入端80将血清输入示例性的系统120中。血清经由导管78流入介质贮存器10中。
然后浸渍的浆液穿过导管42到细胞分离器40。分离器40可以是，例如，浮力分离器、离心机或任何其它适宜的装置。通过关闭阀门36和52可以将浆液保持在分离器40中。在分离浆液的同时，介质贮存器10中的血清和介质流过流动回路(flow loop)。将阀门12、14、16、32、36、52、62和68关闭并将阀门34、46、56、66打开以产生流动回路。泵60将血清/介质混合物经由流动回路泵出，流动回路包括导管76、38、44、54、58以及72。流动回路中血清：介质混合物的比率优选为约1∶6。血清/介质混合物优选流过流动回路以提供通过导管的透腔流动，同时在分离器40中分离浆液。在预定时间以后，关闭阀门56并打开阀门62以提供透壁流动至生物室70，从而将患者血清蛋白的涂层放置在支架材料上，进而改善细胞粘连。分离可以进行约2分钟至约30分钟，并且优选进行约5分钟至约10分钟。用于透腔流动的预定时间优选为约1分钟至约10分钟，更优选为约3分钟至5分钟。
然后在分离器40中通过分馏(fraction)对细胞进行分离。通过过滤器48处理具有所希望分馏物的细胞。通过将介质/血清加入细胞中来灭活与这些细胞相关的蛋白酶。一旦已经从浆液中分离出细胞，则打开阀门52以使所希望的分馏物可以转到生物室70，以便将细胞移植到移植物材料的表面上，其中移植物材料通常具有小于细胞尺寸的孔径尺寸。最初可以通过废物管线(未示出)或通过导管74在较短时间内将流动送到废物贮存器30以可以除去生长因子。上述操作可以进行约2分钟至约30分钟。其后，流动通过导管54、58、72、76、38、以及44改道进入包括生物室70、介质贮存器10以及泵60的连续的流动回路。在流过此流动回路期间，阀门12、14、16、32、36、52、56、以及68被关闭而阀门46、66、62、以及34被打开。使材料循环通过流动回路，优选地用以提供持续低幅度加压铺坪，直到细胞已被移植到移植物材料上。这可以是约5分钟至约24小时，其取决于条件。系统120可以包括目视指示器(如光指示器)或声指示器或报警器以显示细胞已被移植到移植材料上。
在5分钟至24小时期间，至少10mmHg且不大于100mmHg的持续低压梯度可以用来将细胞沉积在表面上或移植物材料中，其取决于移植物的标称孔径。可以用正压力和/或负压力的任何组合来实现压力梯度，以致净梯度引起通过移植物材料的流动。
分离和铺坪介质可以是商业上可获得的介质，该介质包括DMEM、F12、α-MEM、威斯康星大学(university of wisconsin)溶液等、或其任何组合，没有或没有另外的因子，其可以包括适应所希望细胞类型的肝素或其它因子。
如上所述，生物室70容纳移植物材料并且可以便于介质流过可渗透移植物。优选的生物室70具有正密封件(positive seal)如双o形环密封圈并且易于加载且可与供手术室使用的一次性容器100的其余部分分开。优选的生物室70还易于卸载以便将移植物递送到手术室并且不需要任何工具来加载或卸载。它可以是管式设计的槽，其借助于抵消来自系统中流体流动的所有压力而使得没有净力作用于生物室70上。这样的设计便于容易放置例如管状移植物。
在管状移植物的情况下，细胞被沉积在移植物的腔表面上并且生物室容纳移植物以借助于沿移植物长轴的均匀渗透性而允许均匀的细胞沉积。这样的管状移植物还可以沿着其长轴被预加载以改变移植物的渗透性，包括打开移植物材料的孔。在基本为平面移植物的情况下，细胞被沉积在移植物的一个表面上。
现在参照图2，其图解说明系统120的视图，其中示出了可移除生物室70和系统壳体110。系统壳体110具有细胞分离器存取装置112，用于存取分离器40。系统壳体110还具有存取装置114，用于插入和移走一次性袋100。
图1和图2的示例性系统将通常包括微处理器和相关软件以基于用户输入来控制系统和使一个或多个步骤自动操作。通过控制泵和阀门、控制温度、以及控制细胞分离器和浸渍器装置，软件可以允许例如，控制流经管状导管的流动的完全或部分自动化。优选地，使系统完全自动化，但基于一个或多个输入参数能够被重新配置。该系统可以进一步包括各种传感器以检测或测量系统参数(例如将显示阻塞的压力)，以及将所述系统参数通知给微处理器或用户。在一个实施例中，系统是一种手持式系统。
虽然可以在任何适宜的装置中实施本发明的自动化方法，但本发明的发明人已经发现，就一致的和均匀的细胞粘附以及用户方便而论，特殊的生物室设计尤其很好地适合于获得最佳结果。
根据本发明的一个实施例的导管生物室示于图3中。该生物室包括两个等分部，其包括顶部导管201和底部导管202，各自具有近端和远端。相互放置导管以借助于双O形环密封圈216限定内部空间203。毛细管内(IC)双钩连接器204被定位在由导管限定的空间内。连接器204适合于在生物室的每个近端和远端保持移植物支架205。近侧管道206连接至IC连接器以提供相对于移植物支架205的IC流动。借助于Y形连接器208，远侧管道207连接远侧IC和远侧EC流动空间。在进入生物室以后，借助于每一侧上的一对O形环214密封IC管道206和213。该生物室可以包括另外的血管外端口215。
借助于连接器204，可渗透支架材料可以被安装至IC近侧管道206和远侧管道213。在具体实施例中，生物室包括借助于T形连接器210连接于近侧管道206的调节旋塞209，以便于将细胞注射入生物室中。在又一具体实施例中，如下所述，生物室进一步包括至少一个夹具(clamp)或阀门211，其可以关闭远侧EC管道212或远侧IC管道213，以产生跨壁压力或透腔压力梯度，或在之间变化。在优选实施例中，每个远侧IC管道213和远侧EC管道212具有自己的阀门或滑动夹具。
优选地，生物室的顶部和底部导管由光学透明材料(例如，聚苯乙烯或聚碳酸酯)制成，以便可以视觉上监控腔内和腔外流动。该生物室优选由耐高压加热的、伽马、或气体灭菌的材料制成。此外，生物室可以容纳多个硅酮O形环系统，为导管连接提供双密封接触，以致在将试样安放在生物室内的两个钩之间以后，可以调节导管长度和角位置。此外，可以使用金属螺纹插入物以无需车螺纹制造的部件，并且还消除了塑料螺纹的潜在的失效。
远侧管道207、212、213(其连接远侧IC和远侧EC流动空间)的构造使用户能够利用滑动夹具211、或在生物反应器内以自动化方式在跨壁压力梯度与透腔压力梯度之间进行切换。这种切换将典型地发生以在细胞粘连以后提供透腔压力。在具体实施例中，通过调节旋塞209或通过借助于T形连接器210连接的隔片(septum)，将细胞引到近侧管道206。然后关闭远侧IC滑动夹具211以仅允许从EC空间流出，从而建立从近侧IC到远侧EC空间的跨壁压力梯度，以及通过可渗透支架的小流量介质，同时将粘连细胞沉积到腔表面上和/或移植物的壁内。可以通过在近侧IC侧产生正压力、在远侧EC侧产生负压力、或在近侧IC产生正压力以及在远侧EC空间产生负压力的组合来建立压力梯度。如果需要，在细胞粘连到腔表面以后，可以关闭远侧EC滑动夹具并打开远侧IC滑动夹具以允许通过导管内腔的流动，从而在有剪应力存在的情况下确保细胞粘连，其模拟生理环境。
穿过可浸透支架材料的受控的、持续压差梯度可以通过任何适当的构造来产生，所述构造包括但不限于齿轮泵、蠕动泵、隔膜泵、离心泵、以及由流体柱产生的被动压头，只要压力被充分持续以及具有足够的大小以实现本发明的优点。在特别优选的实施例中，利用包含内皮细胞的介质，以约50mmHg的压头并在约5分钟的持续时间，对血管移植物支架透壁地施加压力。
用于细胞铺坪的优选生物室装置的另一实施例是图4A-4D中所示的管状生物室。将钩对钩连接器(barb-to-barb connector)(未示出)装配于两部分管道303(优选硬硅酮管道)的内端，该管道放置在内套筒301的“槽”302中。将血管移植物连接于两个钩，从而限定内部血管内流动(IVF)空间或腔流动空间。此空间位于由内套筒301所产生的槽302内并且借助于硬硅酮管道303与内套筒ID之间的干涉配合从外部进行密封。然后可以通过借助内腔端口305将两部分硅酮管道303连接至任何流动系统来引起IVF流动。然后通过使内套筒303滑入外套筒以使两对O形环密封圈307处于外套筒内而密封生物室。血管外流动(EVF)是通过连接于外腔端口308的一对螺纹钩(未示出)来完成。借助于内套筒每个末端处的双O形环307从外部来密封EVF。通过经由硅酮管道近侧地流入腔空间和远侧地夹紧腔空间同时将EVF打开到泵回路(借助于管道连接到外腔端口308的任何一个或两者)来完成透壁流动。未示出的是在外腔端口处的外套筒上的螺纹钩连接器、以及连接于内套筒的内部槽中的两个硬硅酮管道的钩和移植物。
本发明的优选生物室具有：1)用于腔和血管外流动的两个独立流动空间，2)硅酮O形环夹具，用来提供双密封接触，3)最少数目的螺纹紧固件，其使处理时间和生产成本最小化，4)光学透明材料，用于观察试样以及腔内和腔外流动，5)可以用耐高压加热的和气体灭菌的材料制造，6)嵌入式多硅酮O形环系统，用于导管连接，以便在试样放置以后可以调节导管长度和角位置，以及7)金属螺纹插入物，从而无需车螺纹制造的部件，并且消除了塑料螺纹的失效。此外，可以提供自动化摇床或其它旋转装置以在加压铺坪期间促进细胞在导管内腔中的均匀分布。摇床可以固定在自动化灌注系统中并由其提供动力，并且生物室可以装配在摇床内。然而，并不需要摇床来完全360度覆盖移植物。
图4的管状构造具有以上列出的所有好处，并且另外包括以下益处：无工具打开/关闭、最小的体积、移植物的便利长度和旋转调节、纵向按比例增加、以及平衡的压力，以致借助于O形环密封机构不会发生渗漏。
本发明的方法和生物室装置可以与各种介质灌注系统结合使用。通过使用自动化细胞培养装置，可以针对某些组织工程应用来优化本发明的优点，优选如在美国专利申请系列第09/967,995号和第10/109,712号中所描述的。
上述专利申请提供了自动化灌注培养平台以提供受控的介质流动、剪应力、营养物递送、废物去除、以及改善的质量传递。这些可以通过以下方面来解决传统培养系统的许多缺点：提供对污染的无菌屏障，同时为细胞和组织保持更均匀和受控的生理环境，向用户提供样品存取和数据，以及为数据跟踪和记录提供可提供的再现性和可靠性。
这样的自动化灌注系统可以包括耐用的管壳(cartridge)，该管壳包含泵、阀门阵列、流量计、以及用户界面。它优选具有嵌入式微控制器和预编程流动方式(具有可编程流动状态)。多个灌注回路管壳可以安置在单个对接台框架(docking station rack)内，该单个对接台框架设计成安置在实验室恒温箱内。一次性的灌注流径与管壳结合并且可以具有一体的介质贮存器、用于气体交换的管道、以及控制介质流动的阀门基体。根据本发明，生物室可以与流径配合。周期性回流可以用来降低从入口到出口的介质组成差异。还可以提供自动化采样系统以使用户能够获得用于分析的介质样品。流速可以从例如1ml/min改变至120ml/min或更大；可以通过光学滴量计来监控流动(流量)。
由于用于本发明的至少部分流动通常是透壁的，所以流速取决于移植物材料的渗透性，并且随着细胞被施加于腔表面而降低。取决于移植物材料，在引入细胞以前透壁流速可以是5ml/min-50ml/min，而在引入细胞以后通常降低到1ml/min-10ml/min。优选的内皮细胞数目包括120,000-2,000,000个细胞/cm2腔表面积，更优选约250,000个细胞/cm2。
在本发明的另一具体实施例中，装置系统是模块化的，以致装置的组织消化和分离部分可以与可互换的模块一起使用以将细胞施加到血管移植物或将细胞收集在注射器中。图5示出了以单元组合系统(modular system)组装的装置。由于装置的细胞分离部分安放在独特的单独单元中，所以该实施例还提供了用于使细胞分离单元与其它系统配合的灵活性。优选地，该装置分成三个不同的模块：细胞分离模块、移植物铺坪模块、以及细胞收集模块。
细胞分离模块
在一个实施例中，细胞分离模块是设备的独立件，其包含所有必要的电子仪器和部件以切割、加热、消化、以及分离脂肪组织。在优选实施例中，细胞分离部件包括离心机。来自细胞分离模块的出口供给分离细胞的单细胞悬浮液，以被连接至移植物铺坪模块或细胞收集模块。图6示出了细胞分离模块耐用部件和一次性的部件。图7示出了细胞分离模块，其中一次性部件加载到细胞分离模块的耐用部件上。
在具体实施例中，细胞分离模块耐用单元容纳装置操作所需的所有电子仪器，包括计算机板、软件、电源、以及用户界面。在优选实施例中，用户界面包括具有按钮的LCD屏幕，其通过装置的设置和操作指导用户。细胞分离模块耐用单元还可以容纳必要的夹紧阀门、电机、传感器以及切割、加热、消化、以及离心受治疗者组织(subiect tissue)所需的其它耐用部件。在优选实施例中，受治疗者组织是脂肪组织。夹紧阀门从顶部平面上的外壳伸出以使阀门能够接合一次性流体通道。在优选实施例中，电子仪器位于离任何流体通道具有最大距离处。
在另一实施例中，装置包括可安装的吊钩以悬挂介质袋和废物袋。优选地，将袋吊钩安装至移植物铺坪耐用部件或细胞收集耐用部件以使介质袋与电子仪器(容纳在细胞分离耐用部件中)之间的距离最大化。这种分离降低了流体溢出对电子仪器造成损伤的危险。
在本发明的具体实施例中，细胞分离模块流径的所有元件是一次性的。在一个实施例中，这些一次性部件可以被组装在刚性盘上，其中刚性盘被加载到细胞分离模块耐用部件上。用户可通过使夹紧阀门与一次性盘中的阀门断路器对准而将盘放置在耐用部件的平面上，来加载一次性盘。然后用户向前滑动盘以接合在夹紧阀门中的管道回路并将一次性盘锁定在适当的位置。将所有一次性部件定位在盘中以通过这种加载操作对准和接合细胞分离耐用部件中的必要的耐用部件。由于无需许多管道连接以及许多一次性部件的单独加载，盘设计使用户的设置和处理的负担最小化。在加载盘以后，用户可以将一次性离心碗加载到设置在耐用部件中的凹槽中并将来自一次性盘的入口和出口管道连接至离心机、介质袋、废物袋、以及铺坪或收集单元。
移植物铺坪模块
移植物铺坪模块是指用于利用加压铺坪技术将由细胞分离单元提供的细胞施加到多孔移植物支架上所需的耐用和一次性部件。移植物铺坪模块耐用和一次性部件示于图8中。图9进一步示出了移植物铺坪模块耐用部件，其连接于细胞分离单元并加载有供使用的一次性部件。
在本发明的实施例中，铺坪模块包括两个耐用部件：铺坪单元耐用部件和移植物室耐用部件。这些耐用部件物理上与细胞分离耐用部件配合以提供电力和通信连接。在本发明的另一实施例中，通过细胞分离模块耐用部件中的电子仪器来控制铺坪模块耐用部件。移植物室耐用部件为一次性移植物生物室提供固定安装并且容纳对室进行加热所需的部件。铺坪耐用部件包括硬件(例如，夹紧阀门、传感器)，其是用以操作通过移植物室的流动尤为需要的，如加压铺坪应用所需要的。在一个实施例中，铺坪耐用部件具有带有突出耐用部件的顶部平面，铺坪一次性部件可以加载到该顶部平面上。图10示出了在移植物铺坪耐用和一次性部件中的主要部件。
在另一实施例中，铺坪一次性部件包括一次性移植物生物室和铺坪一次性盘。在一次性移植物室中通常预加载有支架或其它基质材料，其提供密封环境，以便将液体递送到移植物同时防止与周围环境进行的所有其它气体、液体、以及固体物质交换。在一种具体实施方式中，移植物室上的三个端口与来自铺坪一次性盘的管道相连接以提供来自移植物室的入口、透壁出口、以及腔出口。在一个实施例中，移植物室放置在室耐用部件的内部，其中室耐用部件具有闭合门以在铺坪操作过程中对室进行封闭。
在一个实施例中，铺坪一次性刚性盘包括铺坪操作所需要的所有一次性部件和连接材料。通过使夹紧阀门与一次性盘中的阀门断路器对准并向前滑动以接合夹紧阀门中的管道，而将盘加载到铺坪耐用部件的平面上。用户连接细胞分离一次性部件、铺坪一次性部件、以及移植物室一次性部件，以形成用于铺坪的完整流径。
收集模块
收集模块是指用于从注射器中的细胞分离单元中收集细胞以供细胞治疗之用的耐用和一次性部件。细胞收集模块耐用和一次性部件示于图11中。图12示出了细胞收集模块耐用部件，其连接于细胞分离模块，其中加载有供使用的一次性部件。在一个实施例中，收集模块耐用部件物理上与细胞分离单元相配合以提供电力和通信连接。收集耐用部件容纳线性致动器，其与注射器相连接以自动收集细胞分离单元中产生的细胞产物。
在另一实施例中，收集单元中的一次性部件是用来收集细胞产物的注射器。通过收集单元耐用部件上的夹子将注射器保持在适当的位置中。将注射器的顶部加载到耐用部件中，从而通过致动器的移动可以拉注射器活塞。用户将来自细胞分离模块的出口管道连接至注射器的尖端。
系统操作
在一个实施例中，用户在接通装置以前安装当前应用所需要的耐用部件(即，移植物铺坪耐用部件或细胞收集耐用部件)。当接通装置时，它导入、检测耐用模块是否适当接合、进行最初诊断，并进入备用模式。然后用户按下显示器附近的按钮以初始化装置设置。OR试剂盒进入一种模式以允许安装一次性部件。提示用户利用安装在细胞分离耐用部件上的条线码扫描器对每个一次性部件进行扫描。当用户扫描一次性部件时，OR试剂盒将验证正确的耐用部件处于适当的位置中，然后指导用户通过每个步骤以加载一次性部件并进行必要的管道连接。该装置将感测一次性部件被适当加载并确保为当前应用安装了所有需要的一次性部件。在优选实施例中，条线码扫描器位于装置上，以使一次性部件的扫描不会干扰一次性部件的加载。安装的条线码扫描器示于图13中。
在完成装置设置以后，用户按“OK”按钮以开始。装置进行空气清除操作，其中介质和血清通过流径被泵送，将空气推到具有排气口的废物收集点，该排气口使空气能够排到大气中。移植物室被绕过，以使移植物决不会暴露于空气。
然后用户被提示，将脂肪注入到离心机一次性部件上的端口中。当脂肪组织穿过固定叶片进入离心机时，浸渍脂肪组织。用户按“OK”以继续。然后用户被提示，通过相同的入口来引入蛋白酶溶液。在优选实施例中，蛋白酶溶液是胶原酶/PBS溶液。用户按“OK”以继续。用户界面显示器指示开始细胞分离过程。
在优选实施例中，从此时开始，不需要用户交互作用直到完成整个OR试剂盒过程。用户界面显示器提供过程上的连续更新，其指示正在进行的具体操作、完成该操作的估计时间、以及完成整个过程的估计时间。在一个实施例中，借助于显示器用户还可以获得其它重要工艺参数(温度、泵速等)。
在一个实施例中，移植物支架被装进一次性移植物室内的乙醇或其它合适的无菌物质中。移植物制备和以下提供的细胞分离步骤同时进行。以下步骤与用于铺坪的移植物的制备有关。(1)乙醇清除-通过使介质流过移植物室和引导液体排出到废物而从移植物室清除乙醇；(2)支架预处理-使介质再循环通过移植物室直到可获得用于移植物铺坪的细胞悬浮液。介质可以包括但不限于M199、M199E、PBS、盐水、或无双阳离子(无二价阳离子，Di-Cation Free)的DPBS。在优选实施例中，介质是M199E和来自患者的血清的6∶1混合物。
对于铺坪操作模式和细胞收集操作模式来说，细胞分离过程是相同的。在一个实施例中，细胞分离步骤包括：(1)脂肪组织消化-将离心机控制在约37℃的温度并提供低速混合作用(保持混合适当的时间以确保充分的消化)；(2)离心作用-以高RPM旋转离心机，将脂肪组织分离成其组分材料；以及(3)内皮细胞分离和再悬浮-将分离的内含物泵送到薄的透明管道中，在那里光学传感器检测内皮细胞的位置和容积。不需要的材料被引导到废物贮存器，并且特定容积的内皮细胞被返回到离心机。将M199E和血清的6∶1混合物泵送到离心机中。离心机通过低速混合作用使分离的细胞悬浮在混合物中。然后将细胞悬浮液从离心机泵送通过30微米过滤器并引导到移植物铺坪单元或细胞收集单元，用于收集到注射器中。图14示出了离心碗的一个实施例的截面图。
在移植物铺坪的过程中，液体经由铺坪模块在分离模块与移植物模块之间穿过。优选地，将移植物的温度控制在约37℃。在具体实施例中，移植物铺坪步骤包括细胞铺坪以及“进料和流出”流动。在细胞铺坪步骤中，内皮细胞悬浮液被引入到再循环流径中，使细胞悬浮液在一端流入移植物并通过移植物壁流出。最初，离开移植物室的液体混合物被引导到废物贮存器直到整个容积的细胞悬浮液已进入再循环通路。然后细胞悬浮液进行再循环直到完成移植物铺坪。微孔ePTFE允许介质/血清混合物通过，但细胞被包埋到ePTFE中。在此过程中，通过铺坪模块中的压力传感器来监控跨壁压力。在“进料和流出”流动步骤中，当达到特定的跨壁压力时，移植物流动被切换到腔流动，从而表明铺坪已完成。在此过程中，流动被交替地引导到废物贮存器和泵，用于再循环。在流动被引向废物贮存器期间，从贮存器泵送补充的介质和血清。保持“进料和流出”过程适当的时间。
在本发明细胞收集过程的一个实施例中，将细胞悬浮液从分离模块泵送到收集模块中的注射器。线性致动器拉动注射器活塞，从而将细胞悬浮液吸入注射器。
当操作完成时，向用户提供视觉指示和/或听觉指示。用户被提示，除去产物(铺坪的移植物或整个注射器)。当已经除去产物时，用户在用户界面上选择“OK”。然后装置进入用于除去一次性部件的模式。在此模式中，可以从用于处置的单元中除去一次性部件。用户选择“OK”，然后装置进入备用模式，等待运行另一个过程或关闭系统。图15图解说明了系统流径。
本发明的发明人已经证明，持续压头(穿过可渗透支架材料施加于具有悬浮细胞的液体介质)提供快速细胞粘连的优点，而不需如瞬时加压铺坪技术中所使用的较大的压力梯度。借助于任何数目的装置设计，并且针对种种细胞类型、支架材料和几何形状，本领域技术人员可以容易地实施本发明。利用不超过常规实验的实验，本领域技术人员将明了或能够确定本文描述的本发明的特定实施例的许多等同替换。这样的等同替换旨在由权利要求所涵盖。
治疗应用
通过上述装置制备的组织移植物和细胞悬浮液可以用于各种治疗应用。例如，在本发明的一个实施例中，提供了通过将任何上述装置制备的至少一种组织移植物或细胞悬浮液植入组织或器官中而对处于需要中的受治疗者的组织或器官进行血管再造的方法。
在一个实施例中，组织移植物或细胞悬浮液包含选自由皮肤、骨骼肌、心肌、心脏的心耳、肺、肠系膜、或脂肪组织组成的组中的细胞。脂肪组织可以来自网膜脂肪、腹膜前脂肪、肾周脂肪、心包脂肪、皮下脂肪、胸脂肪、或附睾脂肪。
在某些实施例中，组织移植物或细胞悬浮液进一步包括适当的基质细胞、干细胞、相关细胞、或其组合。当在本文中使用时，术语“干细胞”是在广义上加以使用并且包括传统的干细胞、祖细胞、前祖细胞、补充细胞等。示例性干细胞包括胚胎干细胞、成体干细胞、多能性干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌干细胞、肌前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、周围神经系统干细胞等。对干细胞的描述(包括用于分离和培养它们的方法)可以在以下文献中找到(除了其它地方以外)：Embryonic Stem Cells，Methods and Protocols，Turksen ed.，Humana Press，2002；Weisman etal.，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17：387403；Pittinger et al.，Science，284：143 47，1999；Animal Cell Culture，Masters，ed.，OxfordUniversity Press，2000；Jackson et al.，PNAS 96(Shepherd BR et al.Rapid perfusion and network remodeling in a microvascular constructafter implantation.Arterioscler Thromb Vasc Biol 24：898-904，2004)：1448286，1999；Zuk et al.，Tissue Engineering，7：211228，2001(“Zuket al.”)；Atala et al.，尤其是3341章；以及美国专利第5,559,022号、第5,672,346号和第5,827,735号。对基质细胞的描述(包括用于分离它们的方法)可以在以下文献中找到(除了其它地方以外)：Prockop，Science，276：7174，1997；Theise et al.，Hepatology，31：23540，2000；Current Protocols in Cell Biology，Bonifacino et al.，eds.，John Wiley&Sons，2000(包括至2002年3月的更新)；以及美国专利第4,963,489号。技术人员将明了，所选的包含在组织移植物或细胞悬浮液中的干细胞和/或基质细胞通常适合于构成物的所希望的应用。
在具体实施例中，组织移植物或细胞悬浮液包括内皮细胞，这些内皮细胞能够分化成(但不限于)神经元、心肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰内分泌细胞(包括朗格汉斯胰岛)、肝细胞、肾上皮细胞、甲状旁腺细胞、莱迪希细胞、支持细胞、生殖母细胞、卵母细胞、胚泡、肝巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞、成肌细胞、卫星细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、胆上皮细胞、浦肯野细胞、以及起搏细胞。
在另一具体实施例中，组织移植物或细胞悬浮液包括至少一种干细胞、祖细胞或相关细胞，其可以是但不限于神经元、心肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、胰内分泌细胞(包括朗格汉斯胰岛)、肝细胞、肾上皮细胞、甲状旁腺细胞、莱迪希细胞、支持细胞、生殖母细胞、卵母细胞、胚泡、肝巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞、成肌细胞、卫星细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、胆上皮细胞、浦肯野细胞、以及起搏细胞。
当在本文中使用时，术语“相关细胞”是指这样的细胞，基于组织移植物或细胞悬浮液的所希望的用途，这些细胞适合于加入通过本发明的装置所制备的组织移植物或细胞悬浮液中。例如，适合于受损肝的修复、血管再造、或种群恢复的相关细胞可以包括但不限于肝细胞、胆上皮细胞、肝巨噬细胞、成纤维细胞等。用于加入组织移植物或细胞悬浮液的示例性相关细胞包括神经元、心肌细胞、肌细胞、软骨细胞、胰腺腺泡细胞、朗格汉斯胰岛、骨细胞、肝细胞、肝巨噬细胞、成纤维细胞、肌细胞、成肌细胞、卫星细胞、内皮细胞、脂肪细胞、前脂肪细胞、胆上皮细胞等。可以通过本领域已知的常规技术来分离和培养这些类型的细胞。典型的技术可以参见(除其它地方以外)：Atala et al.，尤其是第932章；Freshney，Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques，4th ed.，WileyLiss，John Wiley&Sons，2000；Basic Cell Culture：A PracticalApproach，Davis，ed.，Oxford University Press，2002；Animal CellCulture：A Practical Approach，Masters，ed.，2000；以及美国专利第3,516,681号和第5,559,022号。
技术人员将明了，可以在制备期间或制备以后将这样的基质细胞、干细胞、和/或相关细胞加入到组织移植物或细胞悬浮液中。例如，但不限于，可以实现将细胞悬浮液、干细胞、相关细胞、和/或基质细胞结合于液态三维培养物，如胶原、血纤蛋白等中，或者在组织移植物中或之上接种或铺坪干细胞、相关细胞、和/或基质细胞。用于加入组织移植物或细胞悬浮液中的适当的干细胞、基质细胞、以及相关细胞的示例性组合包括：组织移植物或细胞悬浮液中的朗格汉斯胰岛和/或胰腺腺泡细胞，用于受损胰的血管再造；组织移植物或细胞悬浮液中的肝细胞、肝祖细胞、肝巨噬细胞、内皮细胞、内皮层干细胞、肝成纤维细胞、和/或肝补充细胞，用于受损肝的血管再造。例如，但不限于，用于组织移植物或细胞悬浮液(用于血管形成、修复、以及重建受损或患病肝)的适当的干细胞或基质细胞可以包括肝补充细胞、肝祖细胞，如但不限于肝成纤维细胞、胚胎干细胞、肝干细胞、心肌细胞、浦肯野细胞、起搏细胞、成肌细胞、间充质干细胞、卫星细胞、和/或骨髓干细胞，用于再造受损的或缺血性心脏(参见，例如，Atkins et al.，J.of Heart and LungTransplantation，December 1999，at pages 1173 80；Tomita et al.，Cardiovascular Research Institute，American Heart Association，1999，at pages 92 101；Sakai et al.，Cardiovascular Research Institute，American Heart Association，1999，at pages 108 14)等等。
在一个实施例中，组织移植物或细胞悬浮液进一步包括一种制剂，该制剂选自由细胞因子、趋化因子、抗生素、药物、镇痛药、消炎药、免疫抑制剂、或其组合组成的组。
示例性细胞因子可以包括但不限于血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF，包括但不限于VEGF-165)、白细胞介素、成纤维细胞生长因子(例如，但不限于，FGF-1和FGF-2)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β(TGF-β)、内皮素(如ET-1、ET-2、以及ET-3)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、血管形成素(如Ang-1、Ang-2、Ang-3/4)、血管形成素样蛋白(如ANGPTL-1、ANGPTL-2、ANGPTL-3、以及ANGPTL-4)、血小板衍生生长因子(PDGF，包括但不限于PDGF-AA、PDGF-BB以及PDGF-AB)、表皮生长因子(EGF)、内皮细胞生长因子(ECGF，包括ECGS)、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、胎盘生长因子(PLGF)等。细胞因子(包括重组细胞因子)和趋化因子通常可购自许多来源，例如，R&D Systems(Minneapolis，Minn.)；Endogen(Woburn，Wash.)；以及Sigma(St.Louis，Mo.)。技术人员将明了，用于加入特定组织移植物或细胞悬浮液中的趋化因子和细胞因子的选择将部分地取决于要血管化、再造、增大或重建的目标组织或器官。
在某些实施例中，组织移植物或细胞悬浮液进一步包括至少一种基因工程细胞。在某些实施例中，包含至少一种基因工程细胞的组织移植物或细胞悬浮液将组成性地表达或诱导性地表达由至少一种基因工程细胞编码的至少一种基因产物，这是由于在由本技术领域已知的技术诱导的至少一种基因工程细胞内的遗传变更导致的。示例性基因工程技术的描述可以参见(除其它地方以外)：Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology(包括至2002年3月的增补)，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1989；Sambrooket al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2.sup.nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3.sup.rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；Beaucage et al.，Current Protocols in Nucleic AcidChemistry，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，2000(包括至2002年3月的增补)；Short Protocols in Molecular Biology，4.sup.th Ed.，Ausbel，Brent，and Moore，eds.，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1999；Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology，McGraw HillProfessional Publishing，1995；Molecular Biology Protocols(参见highveld.com万维网站)，以及协议在线(protocol-online.net)。用于基因修饰本发明基因工程细胞的示例性基因产物包括纤溶酶原激活物、可溶性CD4、因子VIII、因子IX、冯-维勒布兰德因子、尿激酶、水蛭素、干扰素(包括α-干扰素、β-干扰素以及γ-干扰素)、肿瘤坏死因子、白细胞介素、造血生长因子、抗体、葡糖脑苷脂酶、腺苷脱氨酶、苯丙氨酸羟化酶、人生长激素、胰岛素、红细胞生成素、VEGF、血管形成素、肝细胞生长因子、PLGF等。
在本发明的实施例中，组织或器官选自由心脏组织、肺组织、心肌组织、横纹肌组织、肝组织、胰组织、软骨、骨、心包、腹膜、肾、平滑肌、皮肤、粘膜组织、小肠、大肠、以及脂肪组织组成的组。
将细胞悬浮液注射到受治疗者组织或器官中的步骤可以包括但不限于利用至少一个注射器、针、插管、导管、管、或显微针。当在本文中使用时，术语“注入”、“注射”、或其变型是指排出或挤出物质的任何方式，通常通过管或包括孔或外部孔口的结构。上述管或结构可以是柔性的、刚性的，或可以包括至少一个柔性部分和至少一个刚性部分。示例性注射装置包括具有或没有针的注射器、插管、导管、柔性管道等。还可以通过使用刺透组织的装置(如显微针)来输送特定的细胞悬浮液。与传统的用标准规格皮下注射针进行注射相反，通过产生微观孔，显微针(通常用约1μm的曲率半径加以定义)或显微针阵列刺透皮肤或内皮细胞层。这些孔实际上作为用于材料输送的导管并可以增强本发明的细胞悬浮液附着或输送到血管、组织、或器官。因此，技术人员将明了，任何包括孔或外部孔口(通过所述孔或外部孔口至少一种细胞悬浮液可以被挤出到组织或器官之上或之中)的结构、或任何可以刺穿组织或器官(包括工程组织)表面的结构均在本发明的范围内。在某些实施例中，在注射以后，上述注射的成分在体外聚合。
在一种具体实施例中，本发明的组织移植物或细胞悬浮液包括选自由皮肤、骨骼肌、心肌、心耳、肺、肠系膜、或脂肪组织组成的组的细胞。脂肪组织可以选自由网膜脂肪、腹膜前脂肪、肾周脂肪、心包脂肪、皮下脂肪、胸脂肪、或附睾脂肪组成的组。
还提供了用于增大需要中的受治疗者的组织或器官的方法，包括将通过本发明的装置制备的组织移植物植入器官或组织中，或将通过本发明的装置制备的细胞悬浮液注入组织或器官中。当在本文中使用时，“增大”是指增加组织或器官的体积和/或密度。
还提供了用于通过将本文描述的装置制备的至少一种组织移植物植入组织或器官中或通过将本发明的装置制备的至少一种细胞悬浮液注入组织或器官中而再生受治疗者中的组织或器官的方法。当在本文中使用时，“再生”是指通过形成新的组织来替代丧失的、患病的或在不同的情况下受损的组织。
技术人员将明了，本发明的受治疗者可以是任何动物，包括两栖动物、鸟类、鱼、哺乳动物、以及有袋类，但优选为哺乳动物(例如，人；家畜，如猫、狗、猴子、小鼠、以及大鼠；或市售动物，如奶牛、马或猪)。另外，本发明的受治疗者可以具有任何年龄，包括胎儿、胚胎、儿童、以及成人。在本发明的优选实施例中，受治疗者是人。在一个实施例中，受治疗者是马，并且本发明的方法用来在动物的蹄中和周围再生组织。在另一实施例中，受治疗者是人，并且组织再生的方法用来预防或治疗，例如，关节炎和眼的疾病，其包括但不限于青光眼和黄斑变性。
另外，用于在需要的受治疗者中重建组织或器官的方法，包括将通过本文描述的装置制备的至少一种组织移植物植入组织或器官中，或将通过这些装置制备的至少一种细胞悬浮液注入组织或器官中。当在本文中使用时，“重建”是指重建、重新构成、改形和/或修复组织或器官。在本发明的一个实施例中，例如，受治疗者具有脂肪团，因此给受治疗者皮下注射适当的细胞悬浮液以便局部重建脂肪组织，从而改善受治疗者的美容性外观。在一个实施例中，受治疗者是术后受治疗者。
还提供了用于通过将本文描述的装置制备的至少一种组织移植物植入组织或器官或通过将这些装置制备的至少一种细胞悬浮液注入组织或器官而治疗或预防受治疗者的组织或器官中原发感染和继发性感染的方法。
还提供了利用由本发明的装置制备的细胞悬浮液和组织移植物来预防组织或器官中形成瘢痕组织、和/或治疗或预防受治疗者的组织或器官中的炎症的方法。
还提供了用于通过将本发明的装置制备的至少一种细胞悬浮液或组织移植物注入组织或器官而预防需要的受治疗者的组织或器官中粘连形成的方法。
在一个实施例中，提供了一种用于治疗或预防受治疗者的急性心肌梗死的方法，该方法通过以下方式来实施：将通过本文描述的任何装置制备的至少一种细胞悬浮液注入心脏，其中增加了通往心脏组织的脉管系统。在另一实施例中，提供了用于治疗受治疗者的心肌炎的方法，包括将通过本发明的任何装置制备的至少一种细胞悬浮液注入受治疗者的心包液。
还提供了通过将本发明的装置制备的至少一种细胞悬浮液注入到伤口而用于治疗受治疗者伤口的方法。在一个实施例中，受治疗者是术后受治疗者。
本发明还提供了通过将本发明的装置制备的至少一种细胞悬浮液注入受治疗者的组织或通过将本发明的装置制备的至少一种组织移植物植入受治疗者的组织而用于治疗或预防受治疗者的组织缺氧的方法。
本发明还提供了用于人工组织或器官的产生的方法，以及用于人工组织的血管形成的方法。在一个实施例中，给人工组织注射通过本发明的任何装置制备的至少一种细胞悬浮液。在具体实施例中，血管形成发生在体外。在另一实施例中，血管形成发生在体内。
另外，提供了利用本发明的装置制备的细胞悬浮液和组织移植物来筛选对受治疗者具有有益治疗效应的候选药剂的方法。在一个实施例中，组织移植物或细胞悬浮液与候选药剂接触，然后分析组织移植物或细胞悬浮液的至少一种细胞的至少一种有益效应。
本发明还提供了用于筛选受治疗者所关心的药剂的有害效应的方法。在一个实施例中，包含受治疗者组织移植物或细胞悬浮液的组织移植物或细胞悬浮液与所关心的化合物接触；然后分析组织移植物或细胞悬浮液的至少一种细胞的至少一种有害效应。在一个实施例中，所关心的药剂是药物。在另一实施例中，所关心的药剂是潜在的过敏原。
本发明提供了持续加压铺坪法和自动化的临床程序：从组织分离患者细胞的所希望的部分，并且过滤、洗涤、加热、浸渍、蛋白水解释放、分离、再悬浮、然后将细胞加压铺坪到可渗透移植物上。利用不超过常规实验的实验，本领域的技术人员将明了或能够确定本文描述的本发明实施例的许多等同替换。这样的等同替换是由以下权利要求所涵盖。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式结合于本说明书，如同每个单独的出版物、专利或专利申请以引用方式具体地和单独地结合于本文。
以上描述和实例仅用来说明实现本发明的目的、特点、以及优点的优选实施例，而不是用来限制本发明。