广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂及应用.pdf

本发明属于生物技术应用领域，公开了一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂，可预防和治疗流感病毒，包括禽流感病毒感染。此药物的优越性在于其特殊的组方配制和使用方法。所述的鼻腔喷雾制剂主要组分有：流感病毒NA抑制短肽为药物的主要活性成分，抑制流感病毒繁殖；多种细胞因子与抗病毒肽有明显的协同作用，以加强抗流感病毒肽的活性。天然多糖是粘膜粘附剂和稳定剂，可以增加药物在鼻腔上皮的停留时间并增加干扰素抗病毒效果。本发明中使用特殊的、定量的、鼻腔喷雾药物递送装置，可由患者自己将药物直接递送到鼻腔，使用方便，无痛苦。

权利要求书
1.   一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备方法包括：
a、以流感病毒为靶分子，从噬菌体随机9、10、11、12或15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、鉴定筛选出的拮抗多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的拮抗多肽测序，合成共有序列，得到流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。

2.   根据权利要求1所述的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其特征在于，所述的流感病毒为A型流感病毒、B型流感病毒，优选A型流感病毒，再优选A型流感病毒中的N1、N2亚型。

3.   根据权利要求1所述的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽是选自下列几种氨基酸序列或其同源序列的多肽之一，
WPKLHVHPR
SWIHHFRPH
HWHPHSHIQP
PLQASLHHIS
HKHNGKAWPLS
LNILSTLYKWR
MLKNKQIMIMKR
IMIKSMQPRMKL
LPIQMHMTMKMPRYP
PRMESIPPIAMHHLS。

4.   一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽是选自下列几种氨基酸序列或其同源序列的多肽之一，
WPKLHVHPR
SWIHHFRPH
HWHPHSHIQP
PLQASLHHIS
HKHNGKAWPLS
LNILSTLYKWR
MLKNKQIMIMKR
IMIKSMQPRMKL
LPIQMHMTMKMPRYP
PRMESIPPIAMHHLS。

5.   权利要求4所述多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、以流感病毒为靶分子，从噬菌体随机9、10、11、12或15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、鉴定筛选出的拮抗多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的拮抗多肽测序，合成共有序列，得到流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。

6.   一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂，其特征在于，包括：权利要求1或2或3或4任何一项所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖、细胞因子。

7.   根据权利要求6所述的鼻腔喷雾制剂，其特征在于，所述天然多糖为纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖或其衍生物一种或几种的组合，所述细胞因子为人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12、胸腺素β4或人乳铁蛋白一种或几种。

8.   根据权利要求6所述的鼻腔喷雾制剂，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为10-200mg/ml，所述天然多糖浓度为0.1-2mg/ml。

9.   根据权利要求7所述的鼻腔喷雾制剂，其特征在于，所述人干扰素浓度为50-500万单位/ml，所述人白细胞介素-2浓度为5-50万单位/ml，所述人白细胞介素-12浓度为5-50万单位/ml，所述胸腺素β4浓度为0.5-10mg/ml，所述人乳铁蛋白浓度为5-100mg/ml。

10.   权利要求4-8所述的鼻腔喷雾制剂在制备预防和治疗抗流感病毒药物上的应用。

说明书广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂及应用
技术领域
本发明涉及一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂的研制，应用于预防和治疗人流感病毒感染，属于药物制剂领域。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，具有很强的传染性。流感流行病学特点是：突然爆发，迅速蔓延，波及面广。每年的季节性流感流行和周期性的流感大流行，严重危害人类健康。我国流感每年的发病率为10％-30％，流感每年在全球引起约5亿人患病，25-50万人死亡，造成巨大的经济损失和疾病负担。WHO认为，如果发生新的流感大流行，全球将有200-700万人死亡。
根据病毒抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型。A型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为16个亚型(H1～H16)，N有9个亚型(N1～N9)。其中H1N1、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的H5N1、H7N7、H9N2、等禽流感病毒，一旦发生变异或与人的流感病毒发生重组可能会具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。
目前控制流感季节性流行和全球大流行的策略主要是每年进行疫苗免疫和抗流感病毒药物的防治。由于流感病毒的抗原变异，加之在老年人、儿童和免疫缺陷的人群中，疫苗往往不能产生有效的免疫保护。另外，对于一些新出现的抗原型别来说(H5N1，H9N2)，现用疫苗的保护效果很小。因此，在面对流感大流行时，安全有效的抗病毒药物可能是最重要的短期应对方法。因此，抗流感病毒的药物研究是十分迫切的。
目前，正式上市的抗流感病毒药分为两类：离子通道阻断剂，神经氨酸酶抑制剂。由于离子通道阻断剂(如金刚烷胺、金刚乙胺)容易引起耐药毒株和交叉耐药，并对乙型流感无效，上述的缺点限制了此类药物的应用。
由于离子通道阻断剂的上述缺点，神经氨酸酶抑制剂型药物得到了广泛的应用。甲乙型流感病毒神经氨酸酶(neuraminidase，NA)又称唾液酸酶，由流感病毒RNA6节段编码的454个氨基酸组成，分子量为50kD。NA可以切断末端神经氨酸残基与临近寡乳糖之间的α(2-6)或α(2-3)糖苷键，即切断病毒HA与宿主细胞之间连接的神经氨酸残基，于是新合成的病毒粒子便能够以出芽方式从宿主细胞表面释放，进而在呼吸道内继续扩散感染其他的细胞。由于新合成的子代病毒HA能够识别临近病毒的神经氨酸残基并与之结合，致使子代病毒自我聚集而无法扩散。NA能够切断病毒表面的神经氨酸残基，抑制子代病毒聚集，利于其扩散。NA还能够破坏呼吸道粘蛋白中的神经氨酸残基，降低粘滞度，利于病毒穿过呼吸道粘液层进入上皮细胞。另外，NA还与转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素(IL)和肿瘤坏死因子(TNF)激活有关。因此，流感病毒的NA与病毒侵袭、复制、成熟和释放有关，抑制流感病毒NA活性可以有效控制流感所引发的疾病。每个甲或乙型流感病毒粒子表面有大约100个蘑菇状的NA四聚体分子，在每个亚单位表面的口袋状结构中都有NA活性位点，并且在所有的甲、乙型流感病毒中均高度保守，因此NA抑制剂为广谱抗流感病毒药物，是应对流感大流行的有效方法
现在临床上获准使用的神经氨酸酶抑制剂有两种，分别是Zanamivir(扎那米韦，粉剂雾化吸入剂)和Oseltamivir(奥司他韦，商品名达菲，口服胶囊或冲服粉剂)，在临床应用中显示了很好的预防和治疗作用，是目前世界卫生组织向世界各国推荐的预防流感大流行的储备药物。但是″达菲″的生产周期长，生产一批达菲需要12个月和10个阶段，其中3个阶段必须要由专业公司来承担。另外，达菲的价格不菲，一个疗程5天需要10片达菲，在市场上的售价为86.5美元，若达到理想效果必须要服用达菲长达6周的时间，因此需要花费数百美元，这对于许多发展中国家的普通百姓来说显然是一笔不小的开支。“达菲”的主要成分是从八角茴香中提炼出的莽草酸。八角茴香是我国南亚热带地区的珍贵经济林树种，主要生长于我国广西等4个省份，每年的3月至5月间收获，供应量极其有限。因此即使大规模提高生产能力，但是因为原料供应短缺，其生产也受到很大制约。
而且在人群中广泛应用时，流感病毒均可对此药产生一定程度的耐药性，加上价格较高，生产时间长，不能满足预防流感/禽流感大流行的需要，所以使用新技术开发有NA抑制活性的抗流感病毒新药是急需的、必要的。
发明内容
本说明书中使用的氨基酸缩写的含义如下：
K：赖氨酸S：丝氨酸L：亮氨酸R：精氨酸H：组氨酸N：天冬酰胺Q：谷氨酰胺P：脯氨酸W：色氨酸V：撷氨酸D：天冬氨酸I：异亮氨酸G：甘氨酸Y：酪氨酸T：苏氨酸
本发明的目的在于提供一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。
本发明的又一目的在于提供一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂。
本发明的还一目的在于提供一种根据上述鼻腔喷雾制剂在制备预防和治疗抗流感病毒药物上的应用。
本发明提供的一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其制备方法包括以下步骤：
a、以流感病毒为靶分子，从噬菌体随机9、10、11、12或15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、鉴定筛选出的拮抗多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的拮抗多肽测序，合成共有序列，得到流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。其中，上述流感病毒为A型流感病毒、B型流感病毒，优选A型流感病毒，再优选A型流感病毒中的N1、N2亚型。
上述的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽是选自下列几种氨基酸序列或其同源序列的多肽之一，
WPKLHVHPR
SWIHHFRPH
HWHPHSHIQP
PLQASLHHIS
HKHNGKAWPLS
LNILSTLYKWR
MLKNKQIMIMKR
IMIKSMQPRMKL
LPIQMHMTMKMPRYP
PRMESIPPIAMHHLS
本发明还提供了一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其特征在于，所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽是选自下列几种氨基酸序列或其同源序列的多肽之一，
WPKLHVHPR
SWIHHFRPH
HWHPHSHIQP
PLQASLHHIS
HKHNGKAWPLS
LNILSTLYKWR
MLKNKQIMIMKR
IMIKSMQPRMKL
LPIQMHMTMKMPRYP
PRMESIPPIAMHHLS
本发明还提供了上述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、以流感病毒为靶分子，从噬菌体随机9、10、11、12或15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、鉴定筛选出的拮抗多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的拮抗多肽测序，合成共有序列，得到流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。
此外，本发明又提供了一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂，包括：上述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖和细胞因子。
所述天然多糖为纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖或其衍生物一种或几种的组合。
所述细胞因子为人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12、胸腺素β4或人乳铁蛋白一种或几种。
所述流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为10-200mg/ml，所述天然多糖浓度为0.1-2mg/ml。
所述人干扰素浓度为50-500万单位/ml，所述人白细胞介素-2浓度为5-50万单位/ml，所述人白细胞介素-12浓度为5-50万单位/ml，所述胸腺素β4浓度为0.5-10mg/ml，所述人乳铁蛋白浓度为5-100mg/ml。
本发明还提供上述鼻腔喷雾制剂在制备预防和治疗抗流感病毒药物上的应用。
具体的说，本发明提供的一种流感病毒神经氨酸酶抑制多肽，其制备方法为，以流感病毒为靶分子，按照所购买肽库说明书中的肽库筛选操作指南，从噬菌体随机9、10、11、12、15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽，鉴定筛选出的拮抗多肽的神经氨酸酶抑制活性，然后将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，得到流感病毒神经氨酸酶抑制多肽。其中，所述的流感病毒为A型流感病毒、B型流感病毒，优选A型流感病毒，再优选A型流感病毒中的N1、N2亚型。
以下是根据上述方法得到的共有序列，即流感病毒神经氨酸酶抑制多肽：
WPKLHVHPR
SWIHHFRPH
HWHPHSHIQP
PLQASLHHIS
HKHNGKAWPLS
LNILSTLYKWR
MLKNKQIMIMKR
IMIKSMQPRMKL
LPIQMHMTMKMPRYP
PRMESIPPIAMHHLS
本发明还提供了一种广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂，包括：
药物的主要活性成分流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制多肽；
佐剂天然多糖和细胞因子。
佐剂中天然多糖为纤维素、淀粉、几丁质、壳聚糖或其衍生物一种或几种的组合，细胞因子为人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12、胸腺素β4或人乳铁蛋白一种或几种。
其中，在鼻腔喷雾制剂中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为10-200mg/ml，天然多糖的总浓度为0.1-2mg/ml，细胞因子各组分如果含有的话，其浓度分别为：人干扰素浓度为50-500万单位/ml，人白细胞介素-2浓度为5-50万单位/ml，人白细胞介素-12浓度为5-50万单位/ml，胸腺素β4浓度为0.5-10mg/ml，人乳铁蛋白浓度为5-100mg/ml，
本发明还提供了上述的鼻腔喷雾制剂在制备抗流感病毒药物上的应用，所述药物优选喷雾剂型药物。将上述制剂溶于生理盐水中，即可得喷雾剂。喷雾剂的pH优选5.5-6.5，不破坏鼻腔环境，喷雾剂中应不含任何可能有对鼻腔有刺激性的物质，而且喷雾剂应在无菌条件下生产包装，以排除发生污染的可能。喷雾剂的使用方法为每疗程连续使用5天，共使用10次，每日喷2次，每次左右鼻孔各喷1下。如流感病毒感染严重或合并其他呼吸道病毒感染时，可以酌情每日使用3次。
同时，本发明还提供了一种定量鼻腔药物递送装置，使根据本发明制备的喷雾剂型药物的使用更加准确方便。上述定量鼻腔喷雾剂平台由盛液罐、药用泵和喷头组成，其中药用泵由基本泵、外套、外垫圈、推动钮组成。基本泵由以下几部分组成：活塞、塔盖、活门、弹簧、泵体、吸管，基本结构见图1。使用时将药液倒入盛液罐中，用食指或中指推动活塞杆3，使活塞4向下移动，泵体5内的空气推开钢珠7排出，泵内形成负压松开手指，活塞4向上移动，将盛液罐中的药液吸入泵体5中，再下压食指和中指，泵体5中的药液就进入活塞杆3和推杆1之间的空腔中，并在活塞4的推送下经喷嘴雾化喷出。通过这种定量鼻腔药物递送装置，患者自己将药物直接递送到鼻腔，使用方便无痛苦。
与抗流感病毒化学药物“达菲”相比，本发明药物属于生物多肽药物，生物多肽药物具有在体内代谢后分解为氨基酸，对人体的毒副作用小、无污染、疗效高等优点；更为重要的是，多肽药物合成不受原料的限制，易于大规模生产，面对流感大流行时可以保证供给；规模化多肽合成的成本也不高，一旦规模化生产其售价会大大低于“达菲”，这将使其不仅在发达国家，而且在更为广大的发展中国家也能普及应用。另外，已有的研究显示，扎那米韦和奥司他韦都不仅能抑制人流感病毒NA，也可以抑制禽流感病毒的NA(H5N1，H9N2)，由于作用机理的类似，这也提示我们对人流感病毒有抑制活性的多肽对禽流感病毒的NA也可能有抑制活性，为我们应对人和禽流感大流行提供新思路和新方法。
同时，肽类药物的给药途径可以是鼻腔给药、肺部给药和口服给药。由于鼻腔部位存在丰富的毛细血管和淋巴管，鼻腔上皮与血管壁紧密相连，上皮细胞间间隙较大，具有较高的渗透性，能避免肝脏的首过效应。另外，鼻腔部位蛋白酶含量也比胃肠中少，低分子量的药物极易被吸收进入血液循环。鼻腔给药方式有滴鼻给药法和喷雾给药法，采用后一方法可获得相对较高的生物利用度。目前国内外市场上还没有流感病毒NA抑制活性的多肽药物。
此外，本发明鼻腔喷雾制剂中佐剂对流感病毒NA抑制多肽活性还有积极的协同作用。佐剂中干扰素是一种具有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性的蛋白质，近半个世纪的基础和临床研究证明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤药物。干扰素首先与特异性细胞受体结合，调节信号传递，激活细胞基因表达，诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，抑制病毒在细胞内繁殖，提高免疫功能。人干扰素存在多个型别，如干扰素-α、β、δ、γ、ε、κ、λ、τ、ω、limitin等，它们的主要特点和可能的临床应用各不相同，我们的大量研究已经证明重组人干扰素-α2b可以预防和治疗鼻病毒、冠状病毒、流感病毒等呼吸道病毒感染。人白细胞介素-2(IL-2)可扩张毛细血管，促进药物的利用，同时又可以刺激自然杀伤细胞的活性，利于流感病毒的清除。胸腺素β4(Thymosin-beta-4，TB4)作为一种多功能的酸性小肽，具有广泛而复杂的生物学活性。TB4可以加速创伤愈合，同时具有抗炎症作用，有利于减轻流感病毒感染症状，加速病情的恢复。壳聚糖等天然多糖可以增加喷雾剂的粘稠度和在粘膜表面停留的时间，扩展上皮细胞层的细胞间隙，使多肽和细胞因子进入粘膜上皮内。
而且，本发明使用鼻腔喷雾给药，具有以下优点：
1、鼻腔喷雾制剂可以将药物直接喷雾到病毒繁殖的部位。
2、药瓶有特殊定量装置，不仅安全，而且投药剂量准确。
3、如果在流感病毒感染时合并有其他呼吸道病毒感染，易于扩展新适应症。
4、鼻腔喷雾给药，病人可以在家自行用药，使用方便简单无痛苦。
附图说明
图1本发明定量鼻腔药物递送装置中基本泵结构
【主要组件说明】
1、推杆2、塔盖3活塞杆4、活塞5、泵体6、弹簧7、钢珠
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更详细描述，但本发明不受这些实施例限制。所有实施例中噬菌体随机肽库购于美国NEB公司或发明人自己构建，各种流感病毒购于美国ATCC(美国菌种保藏中心)或由中国疾病预防控制中心病毒病所分离，天然多糖中各组分均购于美国Sigma公司。细胞因子中人干扰素是购买自北京远策药业股份有限公司生产的干扰素α2b(商品名：远策素)，人白细胞介素-2(IL-2)是购买自北京远策药业股份有限公司生产的IL-2(商品名：远策欣)
细胞因子的其他组分为自制，其参考文献如下：
人乳铁蛋白参考文献：应革，吴淑华，王静，赵小东，陈建明，张晓光，侯云德。重组巴氏毕赤酵母高密度发酵表达人乳铁蛋白的研究，中华实验和临床病毒学杂志，2002(4)：181-185胸腺素β4(TB4)参考文献：
(1)Che YK，Yang H，Lu F，Pu Q，Li RD，Zhao ZL.Cloning expression in E.coli and biological activityof human thymosin beta(4).Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao(Shanghai).2002Jul；34(4)：502-505.
(2)Li QY，Jones PL，Lafferty RP，Safer D，Levy RJ.Thymosin beta4 regulation，expression andfunction in aortic valve interstitial cells.J Heart Valve Dis.2002 Sep；11(5)：726-35.人白细胞介素-12(IL-12)参考文献：
(1)王自力，梁国栋，付士红，周国林，刘礼初，陈飞，施侣元，侯云德.重组腺病毒介导的白细胞介素-12(IL-12)在肝癌细胞中的表达.病毒学报，1999，15(2)：119-124
(2)曲春枫，孙宗棠.人IL-12的克隆、表达及生物活性的鉴定.中国免疫学杂志，1999，15(1)：13-19
(3)Leong SR，Chang JC，Ong R，Dawes G，Stemmer W P，Punnonen J.Optimized expression andspecific activity of IL-12by directed molecular evolution.Proc Natl Acad Sci.2003，100(3)：1163-8.
实施例1
1、流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备
a、按照肽库筛选操作指南，以A/PR/8/34(H1N1)流感病毒为靶分子，从噬菌体随机9肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、经过ELISA和体外NA活性抑制实验鉴定筛选出的多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，共有序列为WPKLHVHPR或SWIHHFRPH。
2、广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾剂的制备
将以上制备的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖壳聚糖、细胞因子人干扰素置于100ml容量瓶中，加生理盐水至刻度。其中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为10mg/ml，壳聚糖浓度为0.1mg/ml，人干扰素浓度为50万单位/ml。
实施例2
1、流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备
a、按照肽库筛选操作指南，以A/FM/1/47(H1N1)流感病毒为靶分子，从噬菌体随机10肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、经过ELISA和体外NA活性抑制实验鉴定筛选出的多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，共有序列为HWHPHSHIQP或PLQASLHHIS。
2、广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾剂的制备
将以上制备的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖淀粉、细胞因子人干扰素、人白细胞介素-2置于100ml容量瓶中，加生理盐水至刻度。其中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为200mg/ml，淀粉浓度为2mg/ml，人干扰素浓度为500万单位/ml，人白细胞介素-2浓度为5万单位/ml。
实施例3
1、流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备
a、按照肽库筛选操作指南，以A/Sydney/5/97(H3N2)流感病毒为靶分子，从噬菌体随机11肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、经过ELISA和体外NA活性抑制实验鉴定筛选出的多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，共有序列为HKHNGKAWPLS或LNILSTLYKWR。
2、广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾剂的制备
将以上制备的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖淀粉和壳聚糖、细胞因子人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12置于100ml容量瓶中，加生理盐水至刻度。其中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为50mg/ml，淀粉浓度为0.2mg/ml，壳聚糖浓度为0.3mg/ml，人干扰素浓度为100万单位/ml，人白细胞介素-2浓度为50万单位/ml，人白细胞介素-12浓度为5万单位/ml。
实施例4
1、流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备
a、按照肽库筛选操作指南，以H5N1流感病毒为靶分子，从噬菌体随机12肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、经过ELISA和体外NA活性抑制实验鉴定筛选出的多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，共有序列为MLKNKQIMIMKR或IMIKSMQPRMKL。
2、广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾剂的制备
将以上制备的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖淀粉和壳聚糖、细胞因子人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12、胸腺素β4置于100ml容量瓶中，加生理盐水至刻度。其中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为100mg/ml，几丁质浓度为0.3mg/ml，壳聚糖浓度为0.7mg/ml，人干扰素浓度为200万单位/ml，人白细胞介素-2浓度为20万单位/ml，人白细胞介素-12浓度为50万单位/ml，胸腺素β4浓度为0.5mg/ml。
实施例5
1、流感病毒神经氨酸酶抑制多肽的制备
a、按照肽库筛选操作指南，以B型流感病毒中的B/jiangsu/10/2003流感病毒为靶分子，从噬菌体随机15肽库中筛选流感病毒拮抗多肽；
b、经过ELISA和体外NA活性抑制实验鉴定筛选出的多肽的神经氨酸酶抑制活性；
c、将鉴定后的多肽测序，合成共有序列，共有序列为LPIQMHMTMKMPRYP或PRMESIPPIAMHHLS。
2、广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾剂的制备
将以上制备的流感病毒神经氨酸酶抑制多肽、天然多糖淀粉和壳聚糖、细胞因子人干扰素、人白细胞介素-2、人白细胞介素-12、胸腺素β4、人乳铁蛋白置于100ml容量瓶中，加生理盐水至刻度。其中，流感病毒神经氨酸酶抑制多肽浓度为150mg/ml，纤维素浓度为0.3mg/ml，壳聚糖浓度为0.6mg/ml，淀粉浓度0.1mg/ml，几丁质浓度0.3mg/ml，人干扰素浓度为400万单位/ml，人白细胞介素-2浓度为30万单位/ml，人白细胞介素-12浓度为20万单位/ml，胸腺素β4浓度为10mg/ml，人乳铁蛋白浓度为5mg/ml。
实施例6-10
各种方法均同实施例1，其他组分及浓度见表1。
表1实施例6-10

注：Hlf为人乳铁蛋白；TB4为胸腺素β4；HIFN为人干扰素；IL-2为人白细胞介素-2；IL-12为人白细胞介素-12；IU为国际单位
实验例1
此实验为喷雾剂对小鼠的攻毒保护
选6周雌性Balb/c小鼠，在10LD50剂量(半致死量)A/PR/8/34病毒滴鼻攻击前4小时滴鼻给予实施例1制备的喷雾剂20ul。攻毒后再用20ul上述喷雾剂连续滴鼻5天，每天一次。对照组滴鼻给予磷酸缓冲液，攻毒后每天监测小鼠体重和生存率。按以下公式计算死亡保护率、延长生命率和体重变化。
死亡保护率(％)＝(对照组病死率—实验组病死率)×100％

结果见表2
表2

所以：
死亡保护率＝40％
延长生存率＝36％
因此，根据本发明喷雾制剂制备得喷雾剂对流感病毒有较好得预防和治疗作用。
序列表
<110>北京金迪克生物技术研究所北京远策药业有限责任公司
<120>广谱抗流感病毒拮抗肽鼻腔喷雾制剂及应用
<130>4834-015
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>1
Trp Pro Lys Leu His Val His Pro Arg
1                 5
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>2
Ser Trp Ile His His Phe Arg Pro His
1                   5
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>3
His Trp His Pro His Ser His Ile Gln Pro
1                 5                       10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>4
Pro Leu Gln Ala Ser Leu His His Ile Ser
1                 5                       10
<210>5
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>5
His Lys His Asn Gly Lys Ala Trp Pro Leu Ser
1                  5                      10
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>6
Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Tyr Lys Trp Arg
1                  5                      10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>7
Met Leu Lys Asn Lys Gln Ile Met Ile Met Lys Arg
1                 5                       10
<210>8
<211>12
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>8
Ile Met Ile Lys Ser Met Gln Pro Arg Met Lys Leu
1                   5                       10
<210>9
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>9
Leu Pro Ile Gln Met His Met Thr Met Lys Met Pro Arg Tyr Pro
1                 5                      10                   15
<210>10
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>NA抑制多肽
<400>10
Pro Arg Met Glu Ser Ile Pro Pro Ile Ala Met His His Leu Ser
1                 5                         10                15