一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL18基因共表达DNA疫苗PIRESM/IL18.pdf

本发明涉及动物医药生物工程研究领域，是一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18。本发明将pIBVM、pIRES-EGFP/DsRed质粒用NheI和XhoI双酶切后，胶回收M基因和载体片段进行连接，构建真核表达质粒pIRES-M/DsRed。以pDNAIL-18质粒为模板，PCR获取禽源IL-18基因。将IL-18、pIRES-M/DsRed质粒用BamHI和NotI双酶切后，胶回收IL-18基因和载体片段进行连接，构建了一种禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18。该疫苗可用于预防禽传染性支气管炎。

权利要求书
1.  一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18，其特征在于用分子生物学方法将禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株M基因和禽IL-18基因插入真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed中，构建能表达M基因和禽IL-18基因共表达质粒，研制DNA疫苗pIRES-M/IL18，该DNA疫苗pIRES-M/IL18能用于预防禽传染性支气管炎。

2.  权利要求1所述的禽传染性支气管炎DNA疫苗pIRES-M/IL18，其特征在于用禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株M基因经NheI和XhoI双酶切，禽IL-18基因经BamHI和NotI双酶切后，插入真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed中，构建真核表达质粒，研制DNA疫苗pIRES-M/IL18。

3.  权利要求2所述的一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18用于预防禽传染性支气管炎。

说明书一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18
[技术领域]本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18。
[背景技术]禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是冠状病毒科冠状病毒属的禽传染性支气管炎病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性的传染病，其特征为病鸡出现呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒可感染所有日龄的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。
禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其抗原性异常复杂，目前世界上分离的临床毒株已超过100多株，分属30种以上血清型。禽传染性支气管炎病毒属于单股正链的RNA病毒，基因组全长27.6kb，主要编码三种结构蛋白：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、核蛋白(N)。许多研究表明，S蛋白裂解为S1和S2两个亚单位，其中S1蛋白可诱导产生中和抗体和血凝抑制抗体，为IBV的主要免疫原。N蛋白携带着T细胞表位，在免疫和保护上可能发挥作用。M蛋白的免疫原性较低，也有报道M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应(参见：殷震，刘景华等.动物病毒学(第二版).北京：科学出版社，1997)。
禽传染性支气管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血清型毒株之间交叉保护力弱。在防制上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，多价疫苗可较好解决防治问题。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返强的问题，且能激发良好的体液免疫反应。其不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较高。加之灭活疫苗不能诱发机体产生细胞免疫，而一系列的研究证实在IBV的免疫保护中，体液免疫和细胞免疫占有重要地位(参见：王红宁主编.禽呼吸系统疾病.北京：农业科技出版社，2002；BW卡尔尼克主编.禽病学(第九版).北京：北京农业大学出版社，1991，407-418；Kusters J G，Niesters，H G M，et al.Virology，1989，169：217-221；AvellanedaG E，Villeges P，Jackwood M W，et al.Avian Dis，1994，38：589-597)。
近年来许多研究者试图研究禽传染性支气管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的进展。步志高等(参见：步志高，江国托等.中国兽医学报，1998，18(6)：527-530)以国内类M41地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA免疫表达质粒，并对其免疫原性进行了初步分析。结果表明该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免疫反应。陈洪岩等(参见：陈洪岩，江国托，杨奇伟等.中国预防兽医学报，1999，21(4)：250-253)将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株S1基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质粒，经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高，至35日龄左右达到高峰，但血清IgG抗体升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40％的鸡可耐过强毒的攻击。刘思国等(参见：刘思国，康丽鹃，江国托等.中国兽医学报，2001，21(1)：14-16)将鸡传染性支气管炎HB株的N基因亚克隆到pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA-N。用该质粒两次免疫SPF雏鸡一周后进行攻毒试验，结果保护率为40％，表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用。Kapczymki DR等(Kapczynski D R，Hilt D A，Shapiro D，et al.Avian Dis，2003，47：272-285)将构建的表达S1蛋白的DNA疫苗通过胚内接种或肌注，结果显示，18日龄的鸡胚先用此疫苗免疫，在雏鸡孵出2周后再用弱毒苗加强免疫，可使鸡得到100％保护，而单用DNA疫苗胚内接种或弱毒苗肌注雏鸡，保护率都小于80％。刘兆球等(刘兆球，姜世金，常维山等.中国兽医学报，2005，25(3)：241-243)用IBV S1基因构建了真核表达载体pcDNA-S1，研究表明构建的DNA疫苗能诱导鸡体产生特异性的免疫应答，抵抗强毒感染。DNA疫苗预防传染性支气管炎的研究发现，单一抗原的DNA疫苗存在免疫原性差、诱导机体产生的免疫保护率低等缺点。因此，如何提高机体免疫应答效率，增强DNA疫苗的免疫效果成为当前疫苗研究的关键问题。
随着对细胞因子研究的不断深入，许多细胞因子被发现具有明显的分子佐剂效应，能特异性增强抗原的免疫原性或增强机体对抗原的免疫反应性，而且细胞因子的网络化作用能优化宿主的特异性免疫反应，诱导机体产生有效的免疫保护力。
其中IL-18具有多种生物学活性，可提高NK细胞的细胞毒性，提高T细胞产生IFN-γ和GM-CSF的能力，促进Th1克隆反应。IL-18作为佐剂可显著增强DNA疫苗的免疫效果。Marshall(Marshall D J，Rudnick K A，McCarthy S G，et al.Vaccine，2006，24：244-53)等将PSA DNA疫苗与IL-18质粒共同注射小鼠后，结果发现，IL-18能显著提高CD4+、CD8+T淋巴细胞应答和抗原特异性免疫应答及疫苗效能。Billaut等(Billaut-Mulot 0，IdziorekT，Loyens M，et al.Vaccine，2001，19：2803-11)研究发现，IL-18DNA质粒与表达HIV-1Gag，Tat和Nef蛋白的多价DNA疫苗共免疫，可缩短CTL诱导时间2周，增加抗原诱导的IL-2和IFN-γ的分泌，增强抗原特异性TH细胞的增殖，而降低抗HIV抗体滴度。Kim等(Kim SH，Cho D，Hwang SY，et al.Vaccine，2001，19：4107-14)构建了pOVA/IL18、pOVA、pIL18真核表达质粒，将以上质粒分别或共同肌注免疫小鼠后，检测OVA特异性IgG2a和IFN-γ的分泌，结果发现pOVA/IL18组免疫效果较pOVA组显著升高，表明IL-18能增强Th1型免疫应答，且这种增强作用依赖于它与抗原的共表达。
[发明内容]本发明将pIBVM、pIRES-EGFP/DsRed质粒用NheI和XhoI双酶切后，胶回收M基因和载体片段进行连接，构建真核表达质粒pIRES-M/DsRed。以pDNAIL-18质粒为模板，PCR获取禽源IL-18基因。将IL-18、pIRES-M/DsRed质粒用BamHI和NotI双酶切后，胶回收IL-18基因和载体片段进行连接，构建了一种禽传染性支气管病毒中国分离株SAIBk株M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗。该疫苗可用于预防禽传染性支气管炎。
[具体实施方式]
1.本发明所使用的真核表达质粒pIBVM、pDNAIL-18和真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed由本实验室构建并提供；宿主大肠杆菌JM109由本实验室保存；禽传染性支气管炎病毒攻毒用毒株SAIBk株由实验室鉴定并保存。
2.引物的设计及合成是根据国内外已在GenBank中登录的鸡白细胞介素18基因序列经多重比较后设计。根据真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed上的酶切位点，上游引物设计在起始密码子处，并加上BamHI酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上NotI酶切位点。
引物序列为：上游引物：5′-CTCGGATCCACCATGGCCTTTTGTAAG-3′；下游引物：5′-AATGCGGCCGCTCATAGGTTGTGC-3′。
3.真核表达质粒pIRES-M/DsRed的构建，将pIBV M用NheI和XhoI进行双酶切处理，胶回收0.7kb的条带，以同样的方法对pIRES-EGFP/DsRed质粒进行双酶切处理，胶回收5.3kb左右DNA片段。
分别取5μL双酶切后胶回收的M基因片段，加入10xT4DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，酶切处理载体pIRES-EGFP/DsRed 1μL，ddH202μL，16℃连接18小时。将连接产物转化JM109感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上37℃培养。
4.真核表达质粒pIRES-M/DsRed的鉴定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定。将pIRES-M/DsRed真核表达质粒用NheI和XhoI进行双酶切，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳观察，pIRES-M/DsRed双酶切后产生约0.7kb和5.3kb的两条条带，证明M基因已经替换了pIRES-EGFP/DsRed质粒中的绿色荧光基因(EGFP)。
5.共表达质粒pIRES-M/IL18的构建，以pDNAIL-18质粒为模板，PCR获取禽源IL-18基因，将IL-18基因的PCR产物用酚氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。IL-18基因的PCR纯化产物用BamHI和NotI进行双酶切处理，胶回收0.5kb的条带。以同样的方法对pIRES-M/DsRed质粒进行酶切处理，胶回收5.3kb左右的条带。
分别取5μL双酶切后胶回收的IL-18基因片段，加入10xT4DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL，酶切处理载体pIRES-M/DsRed 1μL，ddH2O 2μL，16℃连接18小时。将连接产物转化JM109感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上37℃培养。
6.共表达质粒pIRES-M/IL18的鉴定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA进行双酶切鉴定。将pIRES-M/IL18真核表达质粒用BamHI和NotI进行双酶切，酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶电泳观察，pIRES-M/IL18双酶切后产生约0.5kb和5.3kb两条条带，证明已经成功构建了真核表达质粒pIRES-M/IL18。
7.一种禽传染性支气管炎M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18的研制。从LB固体培养基中挑取单菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37℃震荡过夜培养。在1000ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入5ml的菌种，37℃，200rpm/min，培养20h.。用常规提取质粒的碱裂解方法进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法进行纯化。电泳鉴定质粒的纯度和含量。质粒用PBS缓冲液稀释到1mg/ml，即为一种禽传染性支气管炎M基因与禽IL-18基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL18。该DNA疫苗用肌肉注射的方法进行预防接种。