通过施用RNA改变细胞性质的方法.pdf

本发明涉及利用RNA改变细胞性质。具体地，本发明涉及改变细胞的动员、迁移、整合、增殖和/或分化的能力。例如，本发明涉及诱导干细胞的分化，包括获得迁移、整合、和增殖的能力。本发明也涉及在体外诱导干细胞的动员、迁移、整合、增殖和/或分化。因此，本发明涉及促进由干细胞介导的功能修复。本发明也涉及逆转分化细胞的分化。通过将分离的RNA在实现细胞性质的改变的条件下提供给一群细胞可以实现所有这些作用，所述分离的RNA包括可从包括所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。

权利要求书
1.  一种将一种细胞的性质向一种或多种所需细胞类型的性质改变的方法，其包括将分离的RNA在实现改变细胞性质的条件下提供给一细胞群，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。

2.  权利要求1的方法，其中将所述分离的RNA提供给患者体内的细胞群。

3.  权利要求1或权利要求2的方法，其中所述性质是表型的性质。

4.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述性质是一种细胞功能。

5.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述性质的改变涉及一种遗传转化，以使得所述细胞群获得一种改变的、可遗传的基因型。

6.  前述权利要求中任一项的方法，其中细胞性质的改变是干细胞向成体的特化细胞的分化。

7.  前述权利要求中任一项的方法，其中细胞性质的改变是成体的特化细胞向干细胞的逆分化。

8.  前述权利要求中任一项的方法，其中细胞性质的改变是特化成体细胞向具有不同特性的成体细胞的分化。

9.  前述权利要求中任一项的方法，其中细胞性质的改变是免疫学特征谱的变化。

10.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法提高了患者体内干细胞介导的修复。

11.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法在患者体内诱导干细胞的动员、迁移、整合、增殖和/或分化。

12.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法实现患病细胞的修复，改变细胞的遗传组成，诱导特异细胞类型和/或细胞命运，改变细胞的免疫学特征谱，和/或诱导特殊的所需免疫功能或性质。

13.  前述权利要求中任一项的方法，其还包括向患者提供干细胞的步骤。

14.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述提供干细胞的步骤与所述的提供分离的RNA的步骤是顺序进行的、同时进行的、或分开进行的。

15.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离的RNA包括可从处于与所处理细胞的发育阶段不同的发育阶段的细胞中提取的RNA序列。

16.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离的RNA包括可从处于比所处理细胞的增殖阶段更为活跃的细胞增殖阶段的细胞中提取的RNA序列。

17.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离的RNA包括可从来自表现出对疾病或病变具有免疫性或抗性的个体的细胞中提取的RNA序列。

18.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述分离的RNA包括可从胎儿细胞、新生儿细胞、幼体细胞或胚胎干细胞中提取的RNA序列。

19.  一种在体内或在体外诱导干细胞系的全能或多能干细胞或来源于动物或植物组织的全能或多能干细胞分化成一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。

20.  一种在体内或在体外诱导干细胞系的全能或多能干细胞或来源于动物或植物组织的全能或多能干细胞的动员、迁移、整合、增殖和/或分化的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。

21.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是于细胞。

22.  权利要求20的方法，其中所述干细胞是成年动物干细胞或成体干细胞系。

23.  权利要求20或权利要求21的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞或来源于这些细胞的干细胞系。

24.  权利要求21的方法，其中所述成体干细胞是骨髓基质细胞、造血干细胞或神经元干细胞或相应衍生的干细胞系。

25.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是人干细胞或人干细胞系。

26.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞被导致分化成一种或多种稳定的终末细胞类型。

27.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞在分化之前被遗传修饰。

28.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞来源于所述所需细胞的预期受体。

29.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述RNA包括从与所处理的细胞的个体来源不同的组织或细胞中提取的RNA，所述提取的RNA来源于具有与所需细胞的预期受体相容的免疫学特征谱的供体。

30.  前述权利要求中任一项的方法，其中一种全组织或全细胞RNA提取物作为RNA提取物被提供用于细胞摄取。

31.  前述权利要求中任一项的方法，其中可从一种或多种类型的脑细胞或脑细胞系中提取的RNA被提供用于细胞摄取。

32.  前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是骨髓基质干细胞且所提供的分离的RNA包括可从一种或多种类型的脑细胞或骨骼肌或两者任一相应的衍生细胞系中提取的RNA。

33.  权利要求1到31中任一项的一种能诱导干细胞分化的RNA在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途。

34.  权利要求32的用途，其中所述RNA适合于在体内诱导全能或多能干细胞的分化以治疗退行性脑病或脑部或脊髓损伤。

35.  权利要求32或权利要求33的用途，其中所述RNA适合于在体内诱导全能或多能干细胞的分化以治疗选自肝病、心脏病、骨骼肌或心肌疾病或I型糖尿病的疾病。

36.  权利要求32或权利要求33的用途，其中在体内诱导干细胞的分化以对抗年龄相关性退行性疾病。

37.  一种在体外逆转细胞系的分化细胞或从动物或植物组织中获得的分化细胞的分化以生成一或多种所需类型的全能或多能干细胞或干细胞系的方法，其包括将分离的RNA提供给所述分化细胞的细胞培养物由此实现所需的分化细胞向所述类型的干细胞或干细胞系类型的分化逆转，所述分离的RNA包括可从所需类型的干细胞或干细胞系中提取的RNA。

38.  权利要求36的方法，其中所述细胞是在权利要求20到24的任一项中所定义的细胞。

39.  权利要求36或37的方法，其中所述分化细胞选自皮肤细胞、骨髓细胞和造血细胞或来源于这些细胞的细胞系。

40.  权利要求36或37的方法，其中所述分化细胞是成纤维细胞或成纤维细胞系，以及RNA是可从骨髓干细胞或神经元干细胞中提取的RNA。

41.  权利要求39的方法，其中所提供的分离的RNA包括从骨髓基质干细胞、神经元干细胞或衍生自两者中任一的干细胞系中提取的RNA。

42.  一种生产分化细胞的体外方法，其包括
i)实施权利要求36到40中任一项的方法以从分化细胞中生成干细胞或干细胞系；
ii)对所述干细胞或干细胞系实施权利要求I到31中任一项的方法以生成分化细胞。

43.  权利要求41的方法，还包括将遗传修饰引入到干细胞内。

44.  通过权利要求1到31、或36到42中任一项的方法获得的细胞。

45.  权利要求43的细胞在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途。

46.  一种筛选能将所需的性质从一种细胞类型赋予给另一种细胞类型的RNA序列的方法，所述方法包括步骤：
a)从包括所需细胞类型的细胞中提取RNA；
b)将所提取的RNA分成不同的部分；
c)向测试细胞提供一个部分；
d)分析测试细胞的改变的性质，所述改变的性质是提取RNA所用的所需细胞类型所具有的；
其中将改变的性质赋予测试细胞的部分被鉴定为包括能赋予所需性质的RNA序列的部分。

说明书通过施用RNA改变细胞性质的方法
在此引用的所有文献以其全部内容并入参考。
技术领域
本发明涉及改变细胞性质。具体地，它涉及改变细胞的动员(mobilise)、迁移、整合、增殖和分化的一种或多种能力，其中这种能力是潜在的或显著的，以及其中可以按任何的次序表现出每种能力。例如，它涉及改变干细胞的性质，包括获得显著的或潜在的动员、迁移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在体内改变干细胞性质，包括获得显著的或潜在的动员、迁移、整合、增殖和分化的能力。它也涉及在体外改变干细胞性质，包括获得动员、迁移、整合、增殖和分化的能力，其中这种性质的改变在体外可以是显著的或潜在的，或者只是在随后导入到宿主之后在体内、或是在随后导入到体外培养物的其它阶段之后，包括导入到回体(ex vivo)的样品之后才会成为显著的。因此，它涉及促进功能性修复和/或再生。本发明也涉及在体外和在体内改变细胞的基因型。本发明还涉及诱导干细胞的分化，以及涉及逆转分化细胞的分化。
背景技术
干细胞及其在再生医学中的应用继续占据着科学的和非专业的出版物。干细胞是能自我更新以及也能分化成一种或多种分化细胞类型的未分化细胞。这种能分裂生成其它的干细胞以及分化的双重能力意味着干细胞群可以保持它们的数目，同时也能生成大量的分化细胞。
干细胞存在于植物和动物的多个部位中。尽管许多对干细胞进行的最初研究都集中于胚胎干细胞，但是成体组织也含有干细胞。干细胞在例如正常组织的修复中发挥着重要作用。干细胞也生成分化细胞以取代在机体的正常工作过程中所丢失的那些细胞。例如，造血干细胞分化生成多种祖细胞，其依次生成免疫细胞的多种细胞。因此，当成熟的免疫细胞死亡时，它们被来源于造血干细胞的新的免疫细胞所取代。通过一种类似的方式，某些类型的干细胞可以生成其它类型的干细胞。
可以常规地分离干细胞群，将其用于体外培养或者可以在体内操纵。可以从多种来源中分离到干细胞，包括正常的成体组织、植入前胚胎、胎儿组织(处于发育的不同阶段)和肿瘤。已经建立了成体干细胞系和胚胎干细胞系。可以将干细胞系或多或少不确定地保持在培养物中。也可以在培养物中操纵干细胞系，使得可以利用例如干细胞靶向的技术导入特异的遗传修饰。然后可以将在体外培养或操纵的干细胞群导入到宿主体内，或导入到组织培养物的后继形式内。
任何干细胞技术的应用核心都是在体外和在移植到受体人、动物及植物后控制干细胞动员、迁移、整合、增殖和分化的能力。尽管干细胞在体内动员、迁移、整合、增殖和分化的能力是熟知的，但是人为控制干细胞的动员、迁移、整合、增殖和分化成靶组织中的成熟细胞的能力仍处于起步阶段。现有的方法很大程度上依赖于将培养的干细胞暴露于特异的生长因子和/或生长条件中。利用这些方法只能生成相当有限数目的特异的分化细胞类型。
WO 95/12665揭示了一种用于将胚胎干细胞分化成所需细胞系的方法。用编码促进干细胞分化成特异细胞系的蛋白质或多肽的DNA工程化胚胎干细胞。所述DNA可以编码在特殊细胞系中所发现的转录因子。
Dai等(2000)表明通过逆转录病毒介导的基因转移将人促红细胞生成素受体基因转移到鼠胚胎干细胞内可以增强分化中的胚状体的红细胞生成。
WO 01/00650揭示了用于通过导入来自较少分化的细胞类型(例如卵母细胞)的细胞质而将受体细胞(例如人体细胞)去分化的方法。
Tada等(2001)证实成体胸腺细胞和胚胎干细胞的融合可以将体细胞的后生型的某些方面重设为胚胎干细胞的某些方面。例如，杂合体在体内显示出多能性。
发明内容
本发明与细胞性质的改变有关。具体地，它涉及改变细胞的分化以及细胞动员、迁移、整合、增殖和分化的能力。本发明也与细胞基因型的改变以及与分化的控制有关。
不希望受理论上的限制，本发明依据于两个假设：(a)通过经来自需要再生的组织的RNA向效应细胞转移信息而支配用于组织再生的细胞的行为；和(b)通过经RNA将信息从一个细胞转移到另一个细胞可以实现细胞基因型的改变。
因此，本发明与促进由干细胞介导的功能修复、通过影响细胞的动员、迁移、整合、增殖和分化、成体细胞和一般意义上的干细胞的分化以及它们获得动员、迁移、整合、增殖和分化的能力来治疗多种疾病状态有关。本发明也与细胞基因型的改变、和通过改变细胞基因型治疗多种疾病状态有关。本发明者已经发现诱导干细胞分化成所需的分化细胞类型是可能的，以及相反地逆转分化细胞的分化以提供干细胞也是可能的。本发明者也已经发现诱导干细胞动员、迁移、整合、增殖和分化成整合到靶组织内的所需分化细胞类型是可能的，逆转分化细胞的分化以提供干细胞是可能的，以及改变细胞的基因型也是可能的。通过向靶细胞提供特异的RNA序列可以实现这一点。
影响细胞命运或基因型的能力容许诱导多种临床有用的现象，包括容许修复患病细胞、组织和器官，容许改变细胞的遗传组成，容许诱导特异的细胞类型和细胞命运，容许随意地改变免疫学特征谱(profile)，容许诱导特殊的免疫功能等等。诱导干细胞在体内的动员、迁移、整合、增殖和分化的能力意味着可以在完整生物体中，特别是在动物体内有利地促进干细胞介导的功能修复和基因型改变。
因此，本发明提供了一种用于将一种细胞性质改变为一种或多种所需细胞类型的性质的方法，其包括将分离的RNA在实现所需细胞的细胞性质被改变的条件下提供给一群细胞，分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。
分离的RNA可以是可从一种或多种具有感兴趣的性质的细胞类型中提取的或提取的。分离的RNA可以包括可从一种或多种具有感兴趣的性质的细胞类型中提取的RNA序列。因此，并不总是必需从所需细胞类型中提取RNA；例如，利用重组表达系统可以合成产生赋予所述细胞类型有利的性质的RNA序列。通过体外扩增分离的RNA可以生成更大量的所需RNA。
可以在体外或在体内将细胞群暴露于RNA。在体外，细胞群例如可以是细胞培养物，例如在细胞培养皿或滚瓶中的细胞培养物、或生长在支持物、膜、植入物、支架或基质上的细胞；或组织，例如生长在体外的分离的组织。在体内，细胞群可以是生物体，例如人患者、或从生物体中分离到的组织，例如器官、器官的特异部分、或特异的细胞类型或多种细胞类型的集合(collection)。
可以用本发明的方法在体内或在体外提高干细胞介导的修复。在一个实施方案中，本发明的这个方面提供了诱导细胞系的全能或多能干细胞或来源于动物或植物的组织的全能或多能干细胞分化成一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。然后可以将以这种方式在体外生成的细胞输送给受体。对于体内处理而言，干细胞可以驻留在患者体内并在原位暴露于RNA。或者，可以将经过或未经过上述预处理的干细胞本身或联合本发明的RNA一起施用给组织或生物体，以诱导干细胞在治疗对象体内的动员、迁移、整合、增殖和分化。细胞和RNA也可以与治疗特殊疾病有效的其它治疗应用同时、分开或顺序施用。在一个实施方案中，可从一种或多种干细胞类型或干细胞活性组织中提取的RNA可以任选地与细胞例如干细胞同时、分开或顺序施用。例如，在一个特别优选的实施方案中，来自胚胎的或胎儿的、全身的、器官的、器官的特异部分的、或特异的细胞类型的或细胞类型的收集物的RNA与干细胞、或来源于体外处理的干细胞特别是骨髓干细胞的细胞同时、分开或顺序施用。
在一些情况中，可以用分离的RNA本身诱导原位分化。同样，可以用分离的RNA本身诱导原位动员、迁移、整合、增殖和分化。同样，可以用分离的RNA本身诱导原位基因型修饰。因此，在另一方面，本发明也提供了能诱导细胞特别是干细胞的分化的RNA在治疗或在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途。本发明也提供了能诱导细胞特别是干细胞的迁移、动员、整合、增殖和分化的RNA在治疗或在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途，包括修复患病细胞、诱导特异的细胞类型和细胞命运、改变细胞的免疫学特征谱、和诱导特殊的所需免疫功能或性质。本发明也提供了能诱导细胞特别是干细胞的基因型修饰的RNA在治疗或在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途，包括修复患病细胞、改变细胞的遗传组成、诱导特异的细胞类型和细胞命运、改变细胞的免疫学特征谱、和诱导特殊的所需免疫功能或性质。可以将分离的RNA作为一种药物提供给细胞群，其中RNA构成了药物的主要活性成分。
可以用分离的RNA诱导干细胞在体内的动员、迁移、整合、增殖和分化。因此，在另一方面，本发明提供了一种治疗方法，其包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的能诱导干细胞分化的RNA。本发明也提供了一种治疗方法，其包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的能诱导干细胞动员、迁移、整合、增殖和分化的RNA。例如，可以用这些方法促进干细胞介导的功能修复，包括修复患病细胞、改变细胞的遗传组成、诱导特异的细胞类型和细胞命运、改变细胞的免疫学特征谱、和诱导特殊的所需免疫功能或性质。
因此，可以用包括可从特殊的所需类型的干细胞或干细胞系中提取的RNA的分离的RNA促进在体内由干细胞介导的功能修复，和提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病。这些损害例如可以归结于疾病、衰老或遗传组成(makeup)或遗传突变、外伤、手术、任何其它形式的治疗、疾病、或意外的或有意的病态。
或者，可以将RNA联合其它的活性剂一起施加给细胞群，活性剂包括例如干细胞、或根据上述方法在体外来源于干细胞的细胞。可以同时地、顺序地或分开地施用RNA和其它活性剂。
可以用本发明的方法诱导干细胞动员、迁移、整合、增殖和/或分化成一种或多种所需细胞类型。本发明的这个方面提供了一种诱导干细胞系的全能或多能干细胞或来源于动物或植物的组织的全能或多能干细胞动员、迁移、整合、增殖和/或分化成一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需动员、迁移、整合、增殖和/或分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。在一些实施方案中，在体外处理全能或多能干细胞。在其它实施方案中，在患者体内，在体内处理全能或多能干细胞。所采用的干细胞可以是成体干细胞。
也可以用本发明的方法诱导成体细胞动员、迁移、整合、增殖和/或分化成一种或多种所需的干细胞类型。在这个方面，本发明还提供了一种用于获得干细胞的方法。因此，本发明提供了一种在体外逆转细胞系的分化细胞或来自动物或植物的组织的分化细胞的分化以生成所需类型的全能或多能干细胞或干细胞系的方法，其包括将分离的RNA在实现所需的将分化细胞的分化逆转成所述类型的干细胞或干细胞系类型的条件下提供给所述分化细胞的细胞培养物，所述分离的RNA包括可从所需类型的干细胞或干细胞系中提取的RNA。本发明提供了用这种方法获得的干细胞。本发明也提供了这些细胞在生产用于提高或校正组织或细胞损害或遗传疾病的药物上的用途。在其它方面，本发明提供了一种治疗方法，其包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的这些细胞。
在一些实施方案中，所采用的干细胞是成体干细胞，以及所需细胞类型包括胚胎干细胞或胚胎干细胞系。因此，本发明也提供了从成体干细胞生成胚胎干细胞或胚胎干细胞样细胞的方法。
更普遍的，所采用的干细胞可以是来自胚胎后发育阶段，例如胎儿、新生儿、幼体、或成体、或这些阶段内的任何亚阶段，以及所需细胞类型包括胚胎干细胞或胚胎干细胞系。本发明因此提供了一种从这些胚胎后阶段细胞生成胚胎干细胞或胚胎干细胞样细胞的方法。例如，本发明容许通过来自同一个体的自体(成体)干细胞的衍生作用生成用于治疗成体的、具有胚胎干细胞性质的干细胞。
某些类型的干细胞只存在于特殊的发育阶段(例如，某一类型的产红细胞的干细胞存在于胎儿发育的某一阶段的肝内，而具有这种类型的行为的肝干细胞在成体中并不存在)。因此，本发明提供了一种从在发育的其它阶段可获得的干细胞生成只存在于发育的某些特异阶段的干细胞或干细胞样细胞的方法。
在本发明的一些实施方案中，所采用的干细胞是特殊类型的干细胞(例如骨髓间质干细胞)以及所需细胞类型包括不同类型的干细胞(例如神经干细胞)。本发明提供了从一种类型的干细胞生成具有另一种干细胞性质的细胞的方法。
根据天然宿主的发育阶段，任何特殊类型的干细胞可以具有不同的能力。因此，在一些实施方案中，所采用的干细胞是特殊类型的和特殊发育阶段的干细胞(例如，成体的骨髓间质干细胞)以及所需细胞类型包括具有属于不同发育阶段的干细胞的性质的相同或不同类型的干细胞(例如，新生儿的骨髓间质干细胞)。因此，本发明也提供了一种从不同发育阶段的相同或不同的类型的干细胞生成具有属于某一发育阶段的特殊类型的干细胞的性质的细胞的方法。
从干细胞生成分化细胞的能力意味着可以获得大量的所需分化细胞。另外，从分化细胞生成干细胞的能力提供了一种比直接分离干细胞更为简单、更少劳动强度和更少侵袭性的提供干细胞的方法。这也意味着可以从成体组织中获得高度多能干细胞，这使得不必使用胚胎组织。通过联合用于生产干细胞和用于分化干细胞的技术，可以生成大量的所需分化细胞。本发明的方法和药物意味着可以在组织培养物中和在完整生物体特别是在动物中控制分化。
也可以用本发明的方法诱导成体细胞分化成其它的、不同的成体细胞类型。这些分化的实例包括修复患病(包括癌变)细胞、改变细胞的遗传组成、诱导特异的细胞类型和细胞命运、改变细胞的免疫学特征谱、和诱导特殊所需的免疫功能或性质。
本发明也提供了用上述方法获得的细胞。这些分化细胞可被用于生产用于治疗多种疾病的药物。因此，在其它方面，本发明提供了细胞在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或退化或遗传疾病的药物中的用途。本发明包括治疗方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的这些细胞。而且，分化细胞可被用于诊断和/或研究的目的和/或用于生产用于诊断和/或治疗的试剂。因此，在其它方面，本发明提供了细胞在诊断或研究和在生产用于诊断或研究的试剂中的用途。
利用本发明的方法可以诱导用本发明的方法获得的干细胞动员、迁移、整合、增殖和/或分化。因此，在其它方面，本发明提供了一种生产分化细胞的方法，其包括(a)实施本发明的方法以从分化细胞生成干细胞或干细胞系；(b)对干细胞或干细胞系实施本发明的方法以生成分化细胞。所述方法可以在体内和/或在体外实施。
本发明也提供了用这些方法获得的细胞。可以用获得的细胞治疗多种疾病。因此，本发明也提供了这些细胞在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途以及这些细胞用于诊断或研究的用途。在其它方面，本发明提供了一种治疗方法，其包括给需要治疗的患者施用治疗有效量的这些细胞。
在一些情况中，通过本方法可以将所需的遗传修饰导入干细胞、或来源于干细胞的细胞。
附图说明
图1：通过受体动物的空间学习和记忆能力评价脑RNA分化的干细胞对大鼠脑的年龄相关性损害的作用。年龄468到506天大的外饲养(ex-breeder)雄性大鼠静脉内给予未处理的骨髓干细胞或经脑RNA提取物处理的骨髓干细胞。显示了接受未处理的干细胞的对照大鼠的结果(实心块)和接受了脑处理干细胞的实验大鼠的结果(空心圆)。结果表明了实验大鼠的学习能力的显著增加。
图2：脊髓RNA分化的干细胞对运动神经元疾病的动物模型的作用。SOD1小鼠静脉内给予经脊髓RNA提取物处理的骨髓干细胞、未处理的骨髓干细胞或生理盐水。显示了接受了脊髓RNA处理的干细胞的实验小鼠的结果(实心块)、接受了未处理的干细胞的对照小鼠的结果(空心三角)和接受了生理盐水的对照小鼠的结果(实心圆)。结果表明用脊髓来源的RNA对干细胞的预处理显著地提高了干细胞治疗在已建立的进行性神经退行性疾病模型中的疗效。
图3：通过受体动物的空间学习和记忆能力评价供体组织发育阶段对脑RNA分化的干细胞对小鼠脑的年龄相关性损害的作用的影响。254-299天大的C57/B1小鼠静脉内给予经胎儿(E15)脑RNA提取物处理的骨髓干细胞、成体(90天)脑RNA提取物处理的骨髓干细胞或未处理的骨髓干细胞。显示了接受了未处理的干细胞的对照小鼠的结果(实心块)、接受了胎脑处理的干细胞的实验小鼠的结果(实心圆)和接受了成体脑处理的干细胞的实验小鼠的结果(空心三角)。结果表明实验小鼠增加了学习能力，接受了胎脑处理的干细胞的小鼠表现出显著地更快的学习能力。
图4：通过受体动物的空间学习和记忆能力评价直接注射骨髓干细胞来源的RNA对大鼠脑的年龄相关性损害的作用。将骨髓干细胞RNA或经RNaze处理的骨髓干细胞RNA注射到年龄433到579天之间大的外饲养的雄性大鼠的右侧脑室内。显示了接受了RNaze处理的干细胞RNA的对照大鼠的结果(实心块)和接受了干细胞RNA的实验大鼠的结果(空心圆)。结果表明对照大鼠不能学习任务，而经干细胞RNA处理的动物能学会任务，其具有与年轻大鼠相当的能力。
详细描述
本发明者已经发现给细胞提供来自特殊来源的RNA序列可以影响细胞性质。因此，在一个方面，本发明与促进由干细胞介导的功能修复有关。“修复”意思是组织的恢复、再生、加固、更新、复壮、或部分或完全再生或更新。由干细胞介导的修复可以出现在体外或出现在体内。本发明也与干细胞向成体的、特化的细胞的分化、成体特化的细胞向干细胞的分化、和特化的成体细胞向不同特化的其它成体细胞的分化有关。通过给靶细胞提供特异的RNA序列可以实现这一点。本发明也与在体外或体内对细胞的基因型的修饰有关。
本发明通常与细胞性质的改变有关。“性质”意思是细胞的任何所需的性质，包括为存在于细胞表面之内或之上的、或细胞所分泌的生物分子类型反映的生物性质。所需性质包括细胞内的特殊生物分子的活性状态、或细胞所具有的一种特殊行为的能力。
性质可以是潜在的性质或者是细胞内明显的性质。性质可以是一种特殊的表型，其意思是任何可观察到的生理的或生化的特征。这样的表型变化可以是例如细胞表面标记物的表达、改变的免疫功能、改变的MHC限制、改变的一种或多种蛋白的活性等等。所需的表型变化可以是更为极端的，例如细胞功能从一种组织更改(redirection)为另一种组织，例如肝细胞更改为肾细胞。这样的表型变化可以是肿瘤细胞活性向健康细胞活性的逆转。
因此性质可以是细胞所拥有的任何所需功能。术语“功能”意思是包括所需细胞类型所实现的任何生物活性。功能实例包括那些特异于特殊组织的功能，特殊组织例如是脑(例如，皮层、小脑、海马、视网膜、黑质、脑室下区)、脊髓、肝脏、肾脏、肌肉、神经组织(周围神经、中枢神经、神经元、神经胶质)、心脏组织(例如，心房、心室、瓣膜、心脏神经支配)、免疫细胞、血液、胰腺组织、胸腺组织、脾脏、皮肤和胃肠道、肺、骨、软骨、肌腱、毛囊、感觉器官(例如，耳、眼)、任何腺体包括内分泌、外分泌、旁分泌腺体，例如甲状腺、胸腺、垂体、肾上腺、胰腺、生殖系统(例如，睾丸、前列腺、精囊、卵巢、子宫、输卵管、乳腺)、牙、血管、消化道组织(例如，胃、胆囊、小肠、结肠)。在更详细的水平上，组织类型内的特殊细胞类型的功能可能是感兴趣的功能，例如在脑组织内，神经元细胞或皮质神经元或神经胶质细胞在脑内具有更为特化的功能。仍在更详细的水平上，所需功能可以是在分子水平上的功能，其中需要在细胞表面上表达特异分子，例如对于免疫系统的T细胞就需要特异的T细胞受体。彻底地罗列所有的所需功能是不可能的，在每种情况中可能需要的等价功能对于本领域技术人员是显而易见的。
性质的改变可能造成细胞进行向着更为特化的形式或功能的分化，例如从干细胞向具有特化功能的成体细胞(例如肝细胞)的分化。改变也可以造成细胞进行向着较少特化的形式或功能的逆向分化，例如从成体特化细胞向干细胞的逆向分化。改变也可以造成细胞及其子代获得了动员、向一种或多种组织、器官或其它部位迁移、和/或与之整合、和增殖的行为。“动员”意思是休眠静息状态的干细胞的变化，以及当在体内时，指的是其离开休眠静息的位置。“迁移”意思是干细胞从它们的动员或人为输送的位点移向和移到靶组织。“整合”意思是干细胞的相互作用以及它们与靶细胞群及环境的整合。
改变也可以造成细胞及其子代获得了在迁移和整合之前、之中或之后增殖的行为。“增殖”意思是细胞及其子代的分裂以提供新组织。
改变也可以造成细胞进行遗传转化以获得改变的、可遗传的基因型。这样一种改变的基因型可以逆转细胞通过体细胞突变获得的或细胞已经继承的遗传突变。通过这种方式，可以治疗或预防遗传疾病。这样一种改变的基因型可以提供一种遗传改变，它提供了一种附加的、修饰的、可去除的或有缺陷的功能。这种转化方法是一种基因治疗的形式，其中细胞被遗传学改变，优选地是可遗传的，使得改变可以被传递给任何子代。因此，用于提供被遗传学修饰的，优选的是可遗传的细胞的本发明的方法可用于体细胞或生殖细胞的基因治疗。其它的实例对于本领域技术人员是显而易见的。
因此，在一个方面，本发明提供了一种指导干细胞分化为一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述群中的干细胞的所需分化的条件下提供给一群干细胞，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。本发明也提供了一种在体外指导干细胞动员、迁移、整合、增殖和分化为一种或多种所需细胞类型、或在体内与靶组织整合的方法，其包括将分离的RNA在实现所述群中的干细胞的所需分化的条件下提供给一群干细胞，所述分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。RNA可以是可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的或提取到的。
本发明容许将分化的方向指定为一种特殊的特化(speciality)。例如，可以将干细胞指定为肝功能，或更特异地指定为肝细胞的功能。本发明容许特殊类型的干细胞，例如骨髓间质干细胞的动员。本方法容许迁移并整合到特殊的组织内，例如左侧股骨。
本发明提供了用于可控地操纵任何细胞特别是干细胞以诱导细胞分化成所需分化细胞类型的方法和药物。这些方法包括通过指定干细胞的动员、迁移、整合、增殖和分化提高由干细胞介导的修复。
这些方法包括诱导干细胞分化成一种或多种所需的成体细胞类型。另外，本发明也提供了用于诱导逆转分化细胞的分化以提供干细胞的方法。可以组合两种方法，使得例如可以从分化细胞获得干细胞，然后分化以提供不同的或相同的细胞类型的分化细胞。在后一种分化之前，可以扩增干细胞的数目和/或按所需的模式操纵例如以导入所需的遗传修饰。
例如，可以诱导干细胞分化以实现特异的终末分化状态。利用本发明的方法，保证分化细胞与预期受体是免疫相容的也是可能的。选择诱导干细胞分化成哪种类型的细胞的能力意味着可能从单一的干细胞系或干细胞系生成多种不同的细胞类型。可以将本发明的RNA分子、或所获得的分化细胞类型应用于治疗，或应用于生产用于治疗多种疾病的药物。具体的，它们可以被用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病。本发明也提供了用于在体内诱导干细胞动员、迁移、整合、增殖和/或分化以及促进由干细胞介导的功能再生和/或修复的方法和药物。
这些方法包括：诱导一种细胞类型的干细胞分化成一种或多种其它的所需干细胞类型；诱导成体细胞分化成一种或多种所需的干细胞类型以及诱导成体细胞分化成其它的、不同的成体细胞类型。
利用RNA影响细胞命运的能力容许修复患病细胞，容许改变细胞的遗传组成，容许诱导特异的细胞类型和细胞命运，容许随意改变免疫学特征谱，容许诱导特殊的免疫功能等等。
干细胞
可以用本发明生成或分化任何合适的干细胞。也可以用本发明在体内诱导干细胞动员、迁移、整合、增殖和分化。干细胞一般被理解为一种能自我更新的细胞，它也能分化成一种或多种特异的分化细胞类型。干细胞可以是多能的，即它们可以能生成多种不同的分化细胞类型。在一些情况中，干细胞可以是全能的，即它们可以能生成其所来源的生物体中的所有不同的细胞类型。本发明适用于多能干细胞或全能干细胞。
在特别优选的实施方案中，用本发明分化或获得成体干细胞。已知干细胞出现在动物体内的多个部位。通过本发明分化或获得的干细胞可以是那些来自其中存在干细胞的任何器官和组织的干细胞。实例包括来自骨髓、造血系统、神经元系统、脑的干细胞、肌肉干细胞或脐带干细胞。具体地，干细胞可以是骨髓基质干细胞、神经元干细胞或造血干细胞，在一个优选的情况中，它们可以是骨髓基质干细胞或神经元干细胞。具体地，当用本发明的方法诱导干细胞分化时，干细胞是骨髓基质细胞。
干细胞可以是植物或动物干细胞。
在一个优选的情况中，干细胞是动物干细胞和优选地是哺乳动物干细胞。在一个优选的实施方案中，干细胞可以是人干细胞。或者，干细胞可以是来自非人动物以及特别是来自非人哺乳动物。干细胞可以是那些家养动物或农业上重要的动物的干细胞。动物可以是例如绵羊、猪、牛、马、公牛、或家禽或其它商业饲养的动物。动物可以是狗、猫或鸟，以及特别是家养动物。动物可以是非人灵长类动物，例如猴。例如，灵长类动物可以是黑猩猩、大猩猩、或猩猩。干细胞可以是啮齿类动物干细胞。例如干细胞可以来自小鼠、大鼠、或仓鼠。
在另一个优选的情况中，干细胞可以是植物干细胞。已知干细胞存在于种子和发育中的或成体的植物中的多个部位。在本发明中分化的或获得的干细胞可以是那些来自其中存在干细胞的任何组织的干细胞。实例包括来自顶端和根部分生组织的干细胞。在一个优选的实施方案中，干细胞来自农业上重要的植物。植物例如可以是玉米、小麦、水稻、马铃薯、生产可食用水果的植物或其它商业上种植的植物。
在多种情况中，可以用分化细胞治疗对象或用于药物的生产。在这些情况中，干细胞可以来自预期受体。特别地可以是这样一种情况，其中为了逆转分化细胞的分化以提供干细胞，利用本发明的方法获得干细胞。在其它的情况中，干细胞可以来源于不同的对象，但是选择与预期受体免疫相容。在一些情况中，干细胞可以来自预期受体的亲属，例如同胞、半同胞、表亲、父母或孩子、以及特别地是来自同胞。干细胞可以来自无关对象，其已经被组织分型并且发现其具有一种免疫学特征谱，它使得预期受体不会形成免疫应答或只会形成很少的免疫应答，对对象无害。但是，在多种情况中，干细胞、或用于生成干细胞的分化细胞可以来自无关对象，只要可以用本发明使得干细胞与预期受体免疫相容。例如，干细胞和受体可以具有或可以不具有组织相容单元型(例如，HLA单元型)。
在一些情况中，干细胞可以是胚胎干细胞、胎儿干细胞、新生儿干细胞、或幼体干细胞。胚胎、胎儿、新生儿、或幼体干细胞可以是多能干细胞以及特别地是全能干细胞。细胞可以是来自发育的任何阶段或亚阶段，具体地它们可以是来源于胚泡的内细胞团(例如胚胎干细胞)。胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞可以来自或来源于在此提及的任何生物体。胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞可以是人干细胞或非人干细胞及特别地是非人动物干细胞(例如非人灵长类动物)。胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞可以是啮齿类动物干细胞，以及特别地是小鼠胚胎干细胞。在一些情况中，可以回收胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞，然后将其用于生产治疗同一对象的药物，通常是在他们生命的一些阶段。在一个实施方案中，其中采用了胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞，它们是来自于已经建立了的胚胎、胎儿、新生儿或幼体干细胞系。特别地这是针对人细胞的情况。在一些情况中，干细胞可以从胚胎外组织中获得或来源于此。干细胞可以来自脐带，以及特别地可以来自脐带血。
因为公共政策的原因，在某些司法管辖区内，干细胞不可以是具有形成人的能力的全能干细胞。特别的情况是干细胞是人胎儿或胚胎干细胞。
本发明也适用于干细胞系。干细胞系通常是已经从生物体中分离到的并维持在培养物中的干细胞群。因此，本发明可以适用于干细胞系，包括成体、胎儿、胚胎、新生儿或幼体干细胞系。干细胞系可以是克隆干细胞系，即它们可能来源于单一的干细胞。在一个优选的实施方案中，本发明可以适用于现有的干细胞系，特别地适用于现有的胚胎和胎儿干细胞系。在其它情况中，本发明可以适用于新建立的干细胞系。
干细胞可以是现有的干细胞系。可以用于本发明的现有的干细胞系的实例包括Geron提供的人胚胎干细胞系和Reneuron提供的神经干细胞系。在优选的情况中，干细胞系可以是一种可免费获得的干细胞系，其使用权限是对外开放的，以及特别地它是一种现有的干细胞系。
对于人胚胎干细胞系，在一个优选的情况中，将使用预先存在的干细胞系。在本发明的一个特别优选的实施方案中，其中使用了人胚胎干细胞系，细胞系可以是这样一种细胞系，其中在2001年8月9日下午9时EDT之前开始的衍生过程(与胚胎的破坏一起开始)。人胚胎干细胞系优选地可以是一种从因生殖目的所捐赠的胚胎中所生成的细胞系，其中该胚胎已经不再需要被用于最初的目的，因为例如它们对于需求已经是过剩的。优选地应该获得了使用胚胎生成细胞系的知情同意书。在一个优选的情况中，所采用的人胚胎干细胞系将满足布什总统在2001年8月9日所宣布的要求，这对于获得用于胚胎干细胞研究的美国联邦基金是必需的。这些被认为满足要求的干细胞系是来自澳大利亚BresaGen Inc.、CyThera Inc.、瑞典斯德哥尔摩的Karolinska研究所、澳大利亚墨尔本的Monash大学、印度Bangalore的国立生物科学中心(National Centre for Biological Sciences)、印度Mumbai的Reliance Life Sciences、以色列海法的Technion-IsraelInstitute of Technology、加州大学旧金山分校、瑞典Goteborg的Goteborg大学、和Wisconsin Alumni Research Foundation的干细胞系。
在此对干细胞的参考文献通常包括也适用于干细胞系的所提及的实施方案，除非例如有证据显示靶细胞是新分离的干细胞或干细胞是体内固有的干细胞。本发明适用于新分离的干细胞以及也适用于包括干细胞的细胞群。也可以用本发明控制干细胞在体内的分化。
在本发明的方法中的最初步骤可以是分离适当的干细胞。用于分离特殊类型干细胞的方法在本领域是熟知的，并且可以用于获得在本发明中所使用的干细胞。可以用本方法例如从本发明药物的预期受体中回收干细胞。可以用干细胞的细胞表面标记物特征分离干细胞，例如通过细胞分选。可以从在此所提及的任何类型的对象中获得干细胞，特别地是从那些患有在此所提及的任何疾病的对象中获得。
在一些优选的实施方案中，可以利用本发明的方法逆转分化细胞的分化生成干细胞而获得干细胞。具体地，从对象中回收分化细胞，在体外处理以生成干细胞，然后在回输到对象之前(和/或之后)可以按需操纵并分化所获得的干细胞。因为干细胞通常只占个体内存在细胞的极少数，因此这个方法可能是优选的。这也意味着从特异个体中获得干细胞是更为容易的，并且可以消除了对胚胎干细胞的需要。另外，这样的一个方法通常比分离干细胞本身的方法有着更少劳动强度和花费。在一些情况中，可以从对象中分离出干细胞，在体外将其分化，然后回输到相同的对象中。这样的回体方法是特别优选的。
在一些情况中，靶干细胞可能是原位的，即它们可能是存在于对象体内。因此，在其它方面，本发明提供了本发明的能诱导干细胞分化的RNA在生产用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的药物中的用途。本发明也包括使用本发明的分离的RNA提高或矫正组织或细胞损害或治疗遗传疾病的方法，其中分离的RNA能诱导干细胞的分化。这样的一种方法可以被用于例如治疗退行性脑病或脑或脊髓损害。它也可以被用于治疗例如肝病、心脏病、骨骼肌或心肌疾病和I型糖尿病的疾病。此外，它可以被用于对抗年龄相关性退行性疾病。
在这些实施方案中，干细胞可以是在此所提及的任何类型的干细胞，以及可以是在此所提及的任何生物体中的干细胞。靶干细胞可以存在于此处所提及的、干细胞所存在的机体内的任何器官、组织或细胞群中。靶干细胞通常是天然存在于对象中的固有干细胞，但是在一些情况中，可以将利用本发明的方法所生成的干细胞转移到对象内，然后用RNA转移诱导分化。
多种用于在培养物中分离、维持、扩增、定性和操纵干细胞的技术是已知的，并且都可以被采用。在一些情况中，可以将遗传修饰导入到干细胞的基因组内。干细胞本身接受这样的操纵，用例如PCR或Southern印迹技术可以建立并容易地筛选出克隆系。可以用例如基因打靶或随机整合的技术将变化导入到细胞的基因组内。
在一些时候，干细胞可以来源于具有遗传缺陷的个体。然后可以进行修饰以纠正或改善缺陷。例如，可以将缺失或缺陷基因的功能拷贝导入到细胞的基因组内。可以用基因打靶导入所需的特异变化以及特别地是修饰缺陷基因使其变为正常。可以用位点特异性重组酶去除在基因打靶过程中所涉及的选择标记物。在一个特别优选的实施方案中，可以从具有遗传缺陷的个体中获得分化细胞，利用本发明的方法从分化细胞中获得干细胞，纠正或改善遗传缺陷，然后将从其中获得的干细胞或分化细胞用于治疗原始对象或用于生产用于治疗原始对象的药物。
在一些情况中，可以选择干细胞，因为它们具有特异的基因型。例如，可以用干细胞生产分化细胞以治疗具有遗传缺陷的对象。干细胞可能缺少遗传缺陷。例如，可以从从缺少该缺陷的对象亲属中获得的分化细胞中获得或生产干细胞。例如，细胞可以来源于未患有该疾病的同胞。在一个优选的情况中，可以用本发明的方法使得细胞与预期宿主免疫相容或更好的免疫相容。
RNA分子
为了生成所需的细胞性质的变化，本发明采用特异的RNA。所采用的RNA是包括可从包括下述细胞类型的组织或细胞中提取的RNA的RNA，所述细胞类型是诱导靶细胞具有一种细胞性质或用于治疗受体所需的，所采用的RNA是包括可从包括组织或细胞类型的组织或细胞类型中提取的RNA的RNA，所述组织或细胞类型是再生或修复所需的。因此，在其中目标是例如诱导干细胞分化成所需的分化细胞类型的情况中，给靶细胞所提供的RNA通常是一种分离的RNA，它包括可从包括所需分化细胞类型的组织或细胞中提取的RNA序列。分离的RNA可以包括一种可从包括所需分化细胞类型的组织或细胞中提取的或提取到的RNA。
RNA来源的均一程度部分是由所需组织类型的特异性决定的。RNA可以是从特殊的组织类型中提取的，或RNA序列可以来源于特殊的组织类型，例如脑(例如，皮层、小脑、海马、视网膜、黑质、脑室下区)、脊髓、肝脏、肾脏、肌肉、神经组织(周围、中枢、神经元、神经胶质)、心脏组织(例如，心房、心室、瓣膜、心脏神经支配)、免疫细胞、血液、胰腺组织、胸腺组织、脾脏、皮肤、和胃肠道、肺、骨、软骨、肌腱、毛囊、感觉器官(例如，耳、眼)、任何内分泌、外分泌、或旁分泌腺体、例如甲状腺、胸腺、垂体、肾上腺、胰腺、生殖系统(例如，睾丸、前列腺、精囊、卵巢、子宫、法罗皮奥管、乳腺)、牙、血管、消化道组织(例如，胃、胆囊、小肠、结肠)。这些组织是由多种不同的细胞类型所构成的，例如脑组织的组成细胞包括多种亚型的神经元和神经胶质细胞、血管组织、结缔组织和脑固有干细胞。RNA可以来自特殊部位的特殊类型的组织，例如左侧胫骨或左侧额叶。因此，更为均一的细胞群可以包括神经元，因此其中所需的细胞命运本身是特异的(例如，用于治疗年龄相关性脑病)，RNA可以是从神经元提取的，或RNA序列可以是来源于神经元。更为特异的，RNA可以来自特异的神经元类型例如皮层神经元。更为特异地，RNA可以是来自特异类型的皮层神经元，例如多巴胺能皮层神经元。在这样的一些实施方案中，RNA来自纯化的细胞来源。
在一些实施方案中，本发明所采用的RNA来源于特殊的组织类型或细胞或细胞系或细胞类型的组、或一个细胞系或单一细胞类型，或RNA序列来源于这样的来源，还可以使用来自特异发育阶段的供体中的这些材料的来源。因此，RNA可以来源于来自特殊发育阶段的神经元，其中发育阶段与预期受体的发育阶段相同、或更早或更晚。例如，用于治疗心脏退行性的RNA是可以从幼体供体的心脏组织中提取的。发育阶段包括胚胎、胎儿、新生儿、幼体或成体、或任一这些阶段的任一亚阶段。
在一些实施方案中，本发明所采用的、用于治疗处于某一发育阶段的受体中的组织或器官的RNA可以来源于与靶组织相关的组织或细胞类型，但是其中确切类型的来源组织只出现在不同的发育阶段。例如，可以用来源于新生儿或年轻幼体的牙组织的RNA治疗成体中的牙组织。
在本发明中所用的其它优选的均一的、纯化的RNA来源包括胎儿、新生儿或幼体细胞的纯制品以及胚胎干细胞的纯制品。
在需要将分化细胞的分化逆转为所需的干细胞类型的情况中，所提供的RNA通常是一种分离的RNA，其包括可从希望获得的所需干细胞类型中提取的RNA序列。RNA可以从包括所述所需细胞类型的细胞中提取或提取到。
在本发明的一些实施方案中，为了实现在体内的再生或修复，所采用的RNA来源于干细胞，并将其施用到整个生物体、或器官、或组织内。这可以造成受体干细胞群本身的再生和活化，并对通常由这些干细胞所支持的组织随之产生继发的再生作用。在这种情况中，所提供的RNA通常是分离的RNA，其包括可从干细胞类型或干细胞活性组织中提取的RNA序列。RNA可以是可从干细胞类型或干细胞活性组织中提取或提取到的RNA。富含干细胞的组织的实例包括胎儿组织和胚胎组织、或来自正在进行生长修复或再生期的更迟发育阶段的组织。
细胞RNA提取物通常包括一个异质群的不同的RNA分子种类。在异质群中的RNA分子类型可以包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、不均一核RNA(hnRNA)、核内小RNA(snRNA)、胞质内小RNA(scRNA)、核仁小RNA(snoRNA)、转录相关RNAs、剪接相关RNAs、信号识别颗粒RNAs、线性RNA、环状RNA、抑制RNA(例如siRNA)、单链RNA、双链RNA等等。在一个优选的实施方案中，RNA包括包括所需细胞类型的组织或细胞的RNA提取物，具体地RNA可以包括或基本上由来自所需细胞类型的提取物所组成。
因此优选地从供体材料制备富含RNA的提取物。供体材料可以是例如死后所获得的器官类型的来源。也可以从与受处理的细胞相同的来源、或从与所处理的细胞的预期受体获得供体材料。例如，RNA提取物可以来自器官或组织或从器官或组织中分离到的细胞。例如，RNA提取物可以来自器官、组织或从下组中所分离到的细胞，所述组包括但不限于脑、脊柱、心脏、肾脏、脾脏、皮肤、胃肠道或肝脏。在一些实施方案中，可以用本发明的方法或药物处理来源器官、组织或细胞一或多次。提取物可以来自具有特异选择的表型的细胞系、原代细胞培养物、或具有特异的免疫学特征谱的供体组织。
RNA通常包括可从与所处理的靶细胞相同的物种中提取的RNA序列。因此，在对于为其提供RNA的靶细胞是动物细胞的情况中，RNA常常包括可从动物细胞，以及特别地从与所处理的靶细胞相同物种动物中提取的RNA序列或提取到的RNA。同样，对于靶细胞是植物细胞的情况，RNA常常包括可从植物细胞中，以及与靶细胞相同物种的植物细胞中提取的RNA序列或提取到的RNA。
RNA可以包括从在此所提及的任何生物体或生物体组中可提取的RNA序列或提取到的RNA。RNA可以包括从在此所提及的任何干细胞类型或分化细胞类型中可提取的RNA序列或提取到的RNA。
在一些实施方案中，RNA可以包括可从与所处理的细胞的受体不同的发育阶段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，发育阶段可以比所处理的细胞的受体更为不成熟。或者，发育阶段可以是更活跃的细胞产生阶段。例如，通过用从供体胚胎组织获得的来自神经系统的RNA治疗可以实现对脊髓损害的治疗。发育阶段也可以是一个表现出干细胞活性增强的阶段。例如，在本发明的一些优选的实施方案中，RNA可以包括可从胎儿、新生儿、幼体或胚胎发育阶段中提取的RNA序列或提取到的RNA。例如，对于RNA是可从脑细胞或组织中提取的情况，供体可以是处于正在发生广泛的神经发生的发育阶段，例如胎儿发育阶段。本发明者已经证实提供可从早期发育阶段的细胞中提取的RNA具有有利的作用，特别是对于启动由干细胞介导的组织修复。
在其它实施方案中的发育阶段可以比所处理的细胞的受体更成熟，或是更不活跃的细胞产生阶段。在一些实施方案中，RNA可以包括可从已经被以任何方式预处理(例如，化学或物理处理)的或预条件化的(例如，锻炼肌肉组织或诱导生殖组织的特殊生殖阶段)组织中提取的RNA序列或提取到的RNA，这些预处理或预条件化可以修饰可提取的RNA的活性。例如，可以从已经被应激或损害的组织中提取RNA。
用如上讨论的本发明的RNA进行的对细胞性质的改变可以造成靶细胞采取与从中可提取RNA的生物体相似或相同的免疫学特征谱。术语“免疫学特征谱”在此用于包括预期受体中的靶细胞的免疫学性质。因此，可以用本发明按所需方式改变靶细胞的免疫学特征谱。可以用此确保所生成的细胞、或从细胞中所生成的产物具有特异的免疫学特征谱。具体地，因此可以选择提供给靶细胞的RNA，使得所形成的细胞、或细胞的产物具有一种免疫学特征谱，这样它们在预期的受体体内不具有免疫原性或只生成很小的不显著的免疫应答，优选地这不会形成有害的表型。因此，在优选的情况中所提供的RNA是可从预期受体或免疫相容的对象的细胞或组织中提取的RNA序列或提取到的RNA，特别是从中可提取的RNA。这些方法学在给患者提供同种异体移植物或异种移植物时是特别有用的，可将排异的危险减少到最小或预防排异的危险。
改变细胞的免疫学特征谱的能力可以意味着提供RNA的干细胞或分化细胞本身与预期受体不必是免疫相容的。这意味着细胞例如干细胞可能不必必需是从预期受体中分离到的，例如可以使用现有的干细胞或来自更为便利来源的干细胞。这也可以意味着可以采用具有特异的所需基因型的细胞以及具体的是干细胞，并将其转化成相容的免疫学特征谱。例如，预期受体可以具有遗传缺陷，而向其提供了RNA的干细胞或分化细胞可以来自不具有相同缺陷的不同对象。利用本发明可以使得供体细胞与预期受体免疫相容，同时也代偿了遗传缺陷。
因此可以用利用本发明的RNA对细胞性质的改变改变细胞的免疫性质，这样就可以施用相对于所治疗的个体是同种异体的或甚至是异种的细胞，这具有最小化的细胞排异危险。例如，可以将在注射之前用人RNA处理过的猪细胞导入到人患者体内，通过细胞表面分子表达的改变以及将它们用自身分子取代而将排异的危险最小化，否则，所述细胞表面分子将被所治疗的个体识别为非自身的。因此，分离的RNA可以包括可从与所处理的靶细胞不同的物种中提取的RNA序列或提取到的RNA。
可以用利用如上讨论的本发明的RNA对细胞性质的改变增强患病患者的免疫功能。例如，可以从或经自然抗性或经疫苗接种对疾病免疫或相对免疫的患者或物种中分离到用于治疗的RNA序列。RNA可以具有给所治疗的对象赋予抗性的作用，例如通过诱导从中提取到RNA的个体的细胞所已经具有的所需免疫功能或性质。一个实例是病原性或病毒性疾病的发病率。在这样的情况中，可能是从相同或不同物种的抗病个体的免疫细胞例如T细胞中提取的RNA赋予了所治疗的个体所需的免疫功能。一个实例可以是HIV的情况，其对黑猩猩或某些组的人都具有很小的致病作用。为了赋予人患者对AIDS的抗性，可以将从黑猩猩或这些组的人的免疫细胞中提取的RNA施用给人或给从人中分离到的免疫细胞，然后将其重新导入到人体内。
可以用利用如上讨论的本发明的RNA对细胞性质的改变逆转肿瘤生长。在此假定通过将肿瘤细胞暴露到可从健康细胞、或处于早期发育阶段中的细胞中提取的RNA序列或提取到的RNA，肿瘤细胞可以被诱导逆转成为正常的、健康的表型，或变得易感于免疫系统或遗传完整性维护系统例如p53介导的凋亡的清除。
RNA的制备
目前存在着多种用于提取供体RNA的技术。可以用这些技术获得提供给靶细胞的RNA。或者，可以用这些技术提供RNA以鉴定RNA提取物中的必需RNA分子的序列(例如通过分级分离和筛选)。因此，本发明包括一种用于筛选RNA序列的方法，所述RNA序列能将所需的性质从一种细胞类型赋予给另一种细胞类型，其包括步骤：
i.从包括所需细胞类型的细胞中提取RNA；
ii.将所提取到的RNA分成不同的部分；
iii.将一个部分提供给一种或多种测试细胞和/或测试受体；
iv.分析测试细胞或受体的从中提取出RNA的所需细胞类型
所具有的改变的性质。
其中将向测试细胞或受体赋予改变的性质的部分鉴定为包括能赋予所需性质的RNA序列。
通过将RNA提取物分级分离并利用合适分析的分析RNA功能，这个筛选方法鉴定出能将所需性质从一种细胞类型赋予给另一种细胞类型的RNA序列。合适分析的一个实例是在下面的实施例1中所述类型的实验。分析包括将分离的RNA提供给一群细胞，分离的RNA包括可从包括特殊细胞类型的细胞中提取的RNA；并确定细胞性质是否被改变为所述所需细胞类型的性质。这样，提取物中的RNA可以被鉴定为对于本发明的目的不是必需的，并可以将其忽略(即将RNA组合物简单化或标准化)，最终只留下起到所需活性作用的RNA分子或RNA分子的组。
因此，本发明也预期了(envisage)在RNA提取物中的已经被鉴定为能将所需性质从一种细胞类型赋予到另一种细胞类型的特异RNA序列、特异RNA亚型、或特殊RNA结构的用途。可以人工合成这些RNA分子。在一些情况中，RNA可以是基于可提取序列的序列的人工或合成的RNA或RNA类似物。类似物可以根据稳定性或能进入靶细胞的能力或其它所需性质选择。
因此，在本发明中所采用的RNA也可以是一种包括可从包括如下一或多种细胞类型的组织或细胞中提取的RNA序列的RNA，所述一或多种细胞类型所具有的一种细胞性质是意欲诱导靶细胞以便使之具有的细胞性质。因此，对于目标是例如诱导干细胞分化成所需的分化细胞类型的情况，提供给靶细胞的RNA通常可以是一种分离的RNA，其包括可从包括所需分化细胞类型的组织或细胞中提取的RNA序列。
或者，可以例如从供体来源中制备RNA。合适的技术包括用冷或热苯酚提取法制备。或者，通过采用商业化可获得的试剂盒可以从特异组织或细胞中制备RNA，特别地，这些试剂盒基于蛋白的变性以及经离心分离RNA。例如，在一个优选的提取方案(冷苯酚)中，将原代供体组织或细胞匀浆于一体积的生理盐水中。加入等体积的95％饱和苯酚，最初在超速离心机中在18,000rpm下离心30分钟。保留水相，并通过加入1M MgCl2将其变成0.1M MgCl2溶液。然后加入两体积乙醇，沉淀约30分钟。在6,000rpm下最终离心15分钟，生成了富含RNA的沉淀，可以将其保留并储存在乙醇中。或者，可以用任何商业化可获得的RNA提取试剂盒(例如，RNAzolTM)制备活性的富含RNA的提取物。但是，提取RNA的精密方法学对于本发明通常不是关键的。
在一些情况中，可以采用RNA提取物的特异部分。例如，可以根据提供给靶细胞的RNA种类的大小和特殊的重量范围将RNA群分级分离。分级分离也可以基于重量、电荷、或可识别的普通化学特征(例如，结构、核苷酸特殊的共有序列或形式的存在)、或大小、重量或电荷或普通化学特征的任何组合。
在一些实施方案中，所采用的RNA可以包括或由提取物中存在的mRNA序列组成。在一些实施方案中，RNA部分或RNA分子可以特异地影响分化过程的一些部分，但不影响其它部分。例如，一种RNA类型或分子可以只诱导遗传改变，但对例如迁移、终末分化、整合或增殖都没有任何作用。在另一个实施方案中，RNA类型或分子可以影响除遗传修饰以外的所有因素。在另一个实施方案中，RNA类型或分子只能影响迁移的定位、或只能影响增殖的程度、或只能影响终末分化的表型细胞类型，但不能影响任何其它方面。在一些情况中，RNA可以包括可从不同的细胞类型或组织中提取的序列的混和物。例如，RNA种类可以包括可从两种、三种、四种、五种或更多的不同的细胞类型中提取的序列的混和物。对于需要分化干细胞的情况，RNA可以是例如可从不同的细胞类型中提取的，以生成具有两种细胞类型特征的分化细胞。对于将RNA提供给具有遗传缺陷的靶细胞的情况，RNA可以是可从包括和缺乏该缺陷的细胞中提取的序列的混和物。例如，RNA可以包括从来自具有缺陷的对象的细胞和来自缺乏缺陷的另一个对象的相同类型的细胞中提取的RNA提取物的混和物。在一些情况中，可以不存在可从所需细胞类型中提取的特异序列。例如，可以去除缺陷基因的转录物。例如，通过选择性降解或通过杂交可以实现对特异序列的去除。可以用核酶分解特异序列。也可以用具有一定程度特异性的RNase分子。
可以往可提取序列中加入或从中去除特异序列。例如，在一些情况中，RNA可以来源于预期为所产细胞的最终受体的对象，以及该对象可以缺乏特异的基因序列或具有有缺陷的基因序列。在这些情况中，可以往提取物中加入对应于编码缺失或缺陷基因的表达产物的RNA的额外RNA。在这些情况中，可以修复、修饰、去除或选择性降解靶向的遗传序列。
对于RNA是可从干细胞中提取的情况中，优选干细胞包括在此所提及的任何干细胞，以及特别是成体干细胞。干细胞例如可以是造血干细胞、骨髓基质干细胞或神经元干细胞。对于RNA是可从分化细胞中提取的情况中，分化细胞可以是任何的分化细胞，以及特别是成体分化细胞。在一个优选的实施方案中，分化细胞可以选自骨髓细胞、神经元细胞、或造血细胞。分化细胞可以来自任何的哺乳动物器官，例如肾脏、肝脏、心脏、胰腺、中枢神经系统、生殖器官和其它器官。
在一些实施方案中，可从细胞中提取的并在本发明的方法中所用的分离的RNA在衍生作用上是天然的。这意味着RNA不含有非天然的序列，并完全是由来自细胞所属物种的RNA组成的。在一些实施方案中，RNA不含有病毒的、外源逆转录病毒或病原体序列。在一些实施方案中，RNA是均一的混和物，不含有siRNA、miRNA或其它类型的干扰RNA。在一些实施方案中，RNA可以不编码蛋白(例如，RNA在没有位于蛋白编码区两侧的框内起始和终止密码子)。在一些实施方案中，RNA不是可从肿瘤细胞中提取的。在一些实施方案中，RNA不含有一类直接激活抗病毒的免疫应答的双链RNA(例如，通过与Toll受体结合)。在一些实施方案中，RNA不含有反义RNA(例如，没有与也存在的RNA转录物的有义链互补的RNA)。本发明所用的RNA可以是整合的或非整合的。它能或不能复制。它可以有或可以没有5’帽。它可以有或可以没有聚腺苷酸尾。它可以作用为或可以不作用为内源性逆转录酶的底物。
修饰的RNA和类似物
本发明一般涉及RNA的用途。该RNA包括能从包括所需特征的细胞中提取的序列。RNA向靶细胞的转移引起了靶细胞的所需变化，该变化是由RNA决定的。
如在此所示的，决定变化的RNA是活性的，甚至当在靶细胞RNA的苯酚提取物内被输送时仍是活性的。该苯酚提取物含有多种不同的RNA分子。如果活性与提取物内特异的RNA分子和/或序列有关，为了简化制备和质量控制，优选地是输送特异的RNA而不是复合物混和物。通过纯化RNA提取物可以制备特异的RNA，或者可以合成或人工制备特异的RNA(例如，通过化学合成，至少部分化学合成，或通过在从模板核酸中转录出特异的RNA之后的纯化)。
因此本发明提供了一种用于制备本发明所用的RNA的方法，其包括用化学手段、至少部分合成RNA的步骤。本发明也提供了一种用于制备本发明所用的RNA的方法，其包括步骤：将所述RNA的模板与RNA聚合酶接触，从而聚合酶可以与模板相互作用以生成所述RNA。RNA聚合酶可以是RNA依赖性RNA聚合酶，但通常是DNA依赖性RNA聚合酶(即模板优选是DNA，例如质粒形式的DNA)。
可以修饰RNA分子以增加细胞内稳定性和半衰期。可能的修饰包括，但不限于在分子的5’和/或3’末端添加侧翼序列或在分子的骨架内应用硫代磷酸或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶键。这个概念在生产PNA中是固有的，并可以将其扩展到这些分子的任何一种分子中，通过包含非传统的碱基例如次黄嘌呤核苷、queosine和butosine、以及腺嘌呤、胞嘧啶核苷、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰化、甲基化、硫化及相似的修饰形式，这些修饰形式是不容易被内源性内切核酸酶所识别的。碱基例如假尿嘧啶、甲基胞嘧啶和次黄嘌呤核苷可以存在于这些RNA分子中。也可能包括DNA核苷酸以形成DNA/RNA嵌合体。修饰骨架的应用是本发明的修饰RNA分子的优选特征。
也可以使用RNA类似物和模拟物。可以用例如Kirshenbaum等(1999)所述的方法制备并使用模拟天然RNA结构的聚合物。这些修饰的分子和类似物在此可以被认为是“RNA”，尽管从严格的化学观点上看，它们并不是简单的核糖核酸。
给靶细胞提供RNA
可以在体外或在体内给靶细胞提供RNA。RNA也可以被用于生产用于在原位给靶细胞提供RNA的药物的生产。这特别是对于将RNA提供给动物体内的靶细胞的情况。对于植物，本发明也提供了在体外和在体内将RNA提供给靶细胞的方法。通过任何合适的技术都可以将RNA提供给靶细胞。
用于给细胞提供核酸分子的多种方法都是已知的，并且都可以采用。例如，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体包囊化(encapsulation)、脂质体介导的转染、微球包囊化、利用病毒包膜颗粒的转导和微注射。可以采用Graham&van der Eb(1978)的磷酸钙沉淀法。在美国专利No.4,399,216中已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面，可以将其采用。对于多种用于转化哺乳动物细胞的技术，见Keown等(1990)和Mansour等(1988)。在一些情况中，RNA或被包裹的RNA可以与化学试剂结合，这增强了靶细胞对其的摄取。例如，可以将含RNA颗粒的RNA与特异于合适受体的抗体连接。这样的靶向化学物可以增加所有细胞类型的摄取，或可以具有特异于特殊细胞类型或干细胞类型的作用。或者，可以施用没有与这些试剂结合的RNA，例如裸RNA。在一些情况中，可将RNA简单地加入到细胞的培养基中一段合适的时间。例如，可以将细胞和RNA一起培养从1分钟到10天，优选的是从1个小时到5天，更优选的是从6个小时到2天。在一个优选的实施方案中，可以将RNA与细胞一起培养12到24个小时，特别是12个小时。对于提供的RNA是包括RNA序列的脂质体形式，可以采用相似的时间段。
在其它实施方案中，RNA可以被用于治疗方法或用于容许将RNA在体内提供给干细胞或其它细胞的药物的生产。在这些情况中，RNA通常被配制，使得药物是适合于施用给预期对象的形式。
药物可以是RNA处于脂质体内以促进输送或被包装在病毒包膜颗粒内的形式。RNA可以是裸RNA分子或与蛋白质、特别是与已知能增加细胞对核酸摄取的蛋白质复合的RNA分子。
可以在给予其它治疗之前、与之同时或之后联合施用药物，这增加了药物在体外或在体内保持其活性状态的时间。例如，可以将已知的RNase抑制物用于这种治疗。或者，可以给予饱和剂量的无效(inactive)或牺牲(sacrificial)RNA以阻断现有RNase活性。
可以在全身或局部给予其它治疗之前、与之同时或之后联合施用药物，这增加了药物在体外或在体内的摄取或作用。例如，在组织损害后以局灶或全身方式分泌的分子可以增强药物的摄取。这些分子可以来源于受损组织本身，或来源于干细胞来源。在另一个实例中，可以联合本发明的RNA在体外使用已知的特异组织的组织分化非RNA诱导物，例如用视黄酸有助于神经元组织的分化。在另一个实例中，可以与药物联合使用已知的组织培养物的非RNA支持物，例如在脊髓神经元培养物中的碱性成纤维细胞生长因子。
可以用任何合适的途径输送包括RNA的药物。例如，可以肠胃外施用药物，并可以经静脉内、直肠、口服、耳、骨内、动脉内、肌内、皮下、皮肤、皮内、颅内、鞘内、腹腔内、局部、胸内、眶内、脑脊液内、经皮、鼻内(或其它粘膜)、肺、吸入、或其它适当的给药途径输送药物。可以将药物直接施用到所需器官或组织上，或可全身施用。在特别优选的给药途径中，包括通过直接器官注射、血管通路、或通过肌内、静脉内、或皮下途径。可以以这种方式配制RNA以有助于向靶细胞输送。
可以提供金属颗粒上的RNA。在一些情况中，可以施用药物，使得将裸RNA提供给靶细胞。对于所提供的RNA存在于脂质体或其它颗粒内的情况，在颗粒表面上可以具有靶向分子，以容许靶向预期的干细胞。例如，颗粒可以包括靶干细胞或靶分化细胞上的受体的配体。在一个优选的实施方案中，将RNA经用Felgner等(1987)的方法所制备的脂质体输送到细胞内。其它合适的脂质里包括免疫脂质体(例如，US4,957,735)。
也可以将RNA制品与细胞例如干细胞一起施用给生物体。施用可以是同时的、分开的或顺序的。也可以与治疗特殊疾病的其它有效的治疗同时地、分开地或顺序地施用本发明的细胞和RNA。在一个实施方案中，可以与细胞例如干细胞同时地、分开地或顺序地施用可从一种或多种干细胞类型或干细胞活性组织中提取的RNA。例如，在优选的实施方案中，可以与干细胞特别是骨髓干细胞同时地、分开地或顺序地施用全胚胎RNA、胎儿RNA、新生儿RNA、或幼体RNA。表明通过共注射胚胎衍生的RNA部分与干细胞提高了由干细胞介导的组织修复和再生。
细胞和药物组合物
本发明提供了用本发明的方法获得的细胞。提供的细胞可以是在合适容器中的冷冻细胞。可以提供培养物中的细胞。也提供了细胞的提取物，例如全细胞提取物。
本发明也提供了包括本发明的多种RNA分子、干细胞和/或分化细胞的药物组合物。可以将RNA分子、干细胞和分化细胞与在药物领域常规的标准的药学可接受的载体和/或赋形剂一起配制。可以采用合适的用于配制细胞和核酸的技术。可以提供生理盐水或注射用水中的细胞或核酸。配方的确切性质将依赖于一些因素，包括所施用的特殊物质和所需的给药途径。在Remington’s Pharmaceutical Sciences，19th Edition，Mack Publishing Company，Eastern Pennsylvania，USA中充分地描述了合适的剂型类型，通过引用的方式将其全文并入本申请。基于RNA的药物在本领域是已知的。例如，“Ampligen”(Hemispherx Pharma)是一种包括双链RNA分子的药物。
除了上面提及的成分之外，本发明的组合物通常还包括一种或多种药学可接受的载体，其包括本身不会诱导生成对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、糖、和脂聚集物(例如油滴或脂质体)。这些载体对于本领域技术人员都是熟知的。组合物也可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油等。另外，可以存在辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等等。无菌无致热原的、磷酸缓冲的生理盐水是一种常用的载体。在Gennaro(2000)中可得到对药学可接受的赋形剂的全部讨论。
本发明的组合物通常是水样的形式(例如，溶液或悬浮液)，但是它们还可以是干燥的形式(例如冻干)。液体制剂容许直接施用来自其包装形式的组合物，不需要在水性介质中进行复水(reconstitution)，因此其是注射用的理想剂型。组合物可以存在于药瓶内，或它们可以存在于预先填满的注射器中。注射器可以有或没有针头。一个注射器将包括单一剂量的组合物，其中一个药瓶可以包括单个剂量或多个剂量。
可以以单位剂量的形式或以多个剂量的形式包装本发明的组合物。对于多个剂量的形式，药瓶优选地是预先填满的注射器。可以常规建立有效的剂量体积，但是用于注射的典型的人剂量体积是0.5ml。
用于患者给药的组合物的pH值优选地是在6和8之间，优选地约为7。通过在组合物中包含缓冲液可以维持稳定的pH值(例如，组氨酸或磷酸缓冲液)。组合物通常将是无菌的和/或无致热原的。组合物相对于人体应当是等渗的。本发明的组合物可以包括提供张力的钠盐(例如氯化钠)。
本发明的组合物可以包括一种抗微生物素，特别是当组合物被包装成多剂量形式时。用于给靶细胞提供在此所讨论的RNA的多种RNA制品和组合物也可以包括增加RNA稳定性的试剂。例如，它们可以包括RNase抑制剂或其它稳定RNA和/或不含RNA避免降解的试剂。也可以处理RNA制品以去除其它类型的分子，例如可以用蛋白酶或DNase处理去除蛋白和/或DNA。因此，组合物可以基本上没有DNA和/或蛋白。
本发明的一些药物组合物包括根据上述任一实施方案的从细胞或组织中提取到的RNA的组合，单独或与干细胞联合。可以与其它的活性试剂一起给患者施用本发明的细胞，例如一种或多种抗炎剂、抗凝剂和/或人血清白蛋白(优选地是重组的)，它们通常是在同一个注射液中。通常给患者施用细胞，细胞基本上是其离开培养物时的形式。但是，在一些情况中，可以在生产和施用之间处理细胞。可以在生产和施用之间保存细胞(例如深低温保存)。细胞可以存在于维持培养基中。
特别感兴趣的特异组合包括从脑组织、神经元细胞、皮层神经元等中提取到的RNA与干细胞例如骨髓间质干细胞的组合物；脊髓RNA与干细胞例如骨髓间质干细胞的组合；胎儿RNA与干细胞例如骨髓间质干细胞的组合；胚胎来源的RNA例如胚胎干细胞RNA与干细胞例如骨髓间质干细胞的组合。治疗的实例包括：用骨髓干细胞和胎儿脑RNA治疗Alzheimer病；用骨髓干细胞和来自从幼体供体中获得的多巴胺能神经元细胞的培养物的RNA治疗帕金森病；用来自幼体或成体尸体的RNA处理过的骨髓干细胞治疗心脏病；用来自正常成体尸体的胰腺的胰岛细胞的RNA处理的CD34+的循环干细胞治疗糖尿病；用经来源于少突胶质的原代培养物的RNA处理过的骨髓干细胞治疗多发性硬化。将这些组合物同时地、分开地或顺序地施用给患有疾病的患者体内，疾病是适合于本发明治疗的疾病(尽管在每种情况中，通过只给受体直接施用RNA也可以实现治疗)。上面显示了这些疾病的实例。其中，一起施用干细胞和RNA，它们可以被分开或混和包装，然后它们可以被分开或混和施用。
给对象施用治疗有效量的药物、组合物、细胞或RNA分子。根据多种参数可以确定出剂量，特别是根据所用的物质、所治疗的患者的种族、年龄、体重和病变包括免疫状态、给药途径、和所需的用药方案。医生能为任何特殊的患者确定出所需的给药途径和剂量。可以结合所治疗的对象的年龄、体重和病变、退行性的类型和严重度以及给药的频率和途径确定出剂量。
提供给靶细胞的RNA的量将足以给细胞性质带来所需的改变。例如，RNA的浓度(例如在本发明的组合物中)可以从10ng到5mg/ml，优选地从100ng/ml到2.5mg/ml，更优选地从1μg/ml到500μg/ml，甚至更优选地从5μg/ml到100μg/ml，以及仍更优选地从10到50μg/ml。在一个特别优选的情况中，RNA浓度可以从15到40μg/ml，优选地从20到35μg/ml以及特别是25μg/ml。这些浓度可以应用于体外或体内的应用。在一些情况中，可以施用总共100ng到0.1g的RNA，优选地从1μg到50mg，更优选地从100μg到10mg，仍更优选地从250μg到1mg的RNA。可以提供任何合适的浓度和/或量的RNA。可以采用大范围的浓度和/或量的RNA，以及根据向靶细胞或组织输送RNA的方法、RNA的来源和是否在体外或在体内提供，精确的浓度和/或量都可以有所不同。为了带来所需的改变，常规将提供给靶细胞的RNA的量最优化。
本发明提供了一种包括本发明的RNA(包括RNA模拟物、类似物和修饰RNA)的药物组合物，其中组合物：(i)具有6和8之间的pH值；(ii)包含一种缓冲液；(iii)是无菌的；以及(iv)基本上没有致热原。组合物中的RNA优选地是均一的。RNA优选地是组合物中的活性药物制剂。组合物优选地位于一个容器内，将容器标签以说明组合物的药用目的。
用于治疗对象的药物和方法
可以用本发明所提供的干细胞、RNA和分化细胞治疗大量疾病以及生产合适的药物。具体地，可以用本发明的RNA和细胞提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病，以及生产合适的药物。
本发明可以采用多种方法治疗这些疾病并提供合适的药物。具体地，给所治疗的对象施用本发明的药物可以造成：
(a)为了在原位诱导细胞(例如干细胞)的分化，给对象施用本发明的RNA；或为了在原位诱导细胞(例如干细胞)的动员、迁移、整合、增殖和分化，给对象施用本发明的RNA；
(b)给对象施用本发明获得的干细胞；
(c)给对象施用利用本发明的方法获得的分化细胞；
(d)在施用细胞(例如干细胞或分化细胞)之前、与之联合或之后给对象施用本发明的RNA，其中通过本发明的方法可能已经改变或没有改变细胞；和/或
(e)在给对象施用细胞之前、或之后，用本发明的RNA处理干细胞。
(f)给对象施用利用本发明的方法所获得的具有改变的性质的细胞或干细胞；
一般而言，在本发明的(b)到(f)的部分，在一些情况中，可能需要利用本发明的方法提供在数目上有所缺少、耗竭或有功能缺陷的细胞类型。可以给特异的部位或更大的区域提供本发明的细胞。例如，可以给损害或损伤的组织或器官的部位例如伤骨或断骨提供细胞。可以给神经损伤的部位提供细胞，特别是给脊柱损伤的部位。可以给受损的或患病的肝脏、肾脏、心脏或其它器官提供细胞。对于受损的或有缺陷的心肌疾病的情况，例如心脏病的情况，死亡的或受损的细胞可以被放大或取代。同样地，可以给患有肝病例如肝纤维化或其它类型的肝脏损害的对象提供细胞。通常提供了利用本发明的方法获得的分化细胞或具有改变的性质(潜在的或明显的)的细胞，但是在一些情况中，可以提供利用本发明的方法获得的干细胞，并容许其原位分化。
a)RNA治疗
在此显示了给对象施用从脑细胞中提取到的RNA具有刺激患者体内的固有干细胞以增厚脑皮层的作用。此外，已经证实从已知显示出增加干细胞活性的发育阶段中制备的RNA能刺激内源性修复机制。在上述方法学的一个实施方案中，给对象施用本发明的RNA在原位诱导了细胞(例如干细胞)的分化，通过这种方式促进了由干细胞介导的功能修复。给药可以在原位诱导细胞的动员、迁移、整合、增殖和分化，以促进由干细胞介导的功能修复。
因此，本发明的这个方面提供了一种在体内指导细胞命运分化为一种或多种所需细胞类型或组织的功能或性质的方法，其包括将分离的RNA在实现所述细胞的所需分化的条件下提供给一群细胞，分离的RNA包括可从包括所需细胞类型的细胞中提取的RNA序列。RNA可以是可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的或提取到的。细胞群优选是组织，例如生长在体外的分离的组织或生物体例如人类患者。
本发明也提供了一种提高或矫正对象中的组织或细胞损害或遗传疾病的方法，方法包括诱导对象中的全能或多能的固有干细胞分化(例如具有动员、迁移、整合和增殖)成一种或多种所需的细胞类型(例如在靶位置)，该方法包括将分离的RNA序列在实现所述干细胞的所需分化(例如动员、迁移、整合和增殖)的条件下提供给原位固有干细胞，分离的RNA序列包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。RNA可以是可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的或提取到的。可以用本发明的方法在体内或在体外提高由干细胞介导的修复。
在一个实施方案中，本发明的这个部分提供了一种诱导动物或植物的组织中的全能或多能干细胞分化成一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所述分化的条件下提供给所述干细胞，分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA序列。RNA可以是可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的或提取到的。干细胞停留在生物体内并在原位暴露于RNA。
可以用本发明治疗、缓解和逆转肿瘤生长。上面假设通过将肿瘤细胞暴露于可从健康细胞或处于早期发育阶段的细胞中提取的RNA序列(例如胎儿RNA、胚胎细胞RNA、新生儿RNA或幼体RNA)，可以诱导肿瘤细胞逆转为更正常、健康的表型。在本发明的这个部分，用于治疗肿瘤细胞的RNA序列可以来源于从患者或相关个体、无关个体、或甚至不同物种的个体中分离到的健康细胞。优选地，RNA是来自紧密相关的个体。用于治疗的RNA所起源的细胞类型优选是与致肿瘤组织相似的细胞类型或相同的细胞类型。如熟练人员所知道的那样，目前存在多种用于分型肿瘤细胞的技术。
在本发明的其它实施方案中，可以用本方法在患者体内(任选地在原位)将一种细胞类型的所需性质任意地赋予给另一种细胞类型。例如，通过相同的方式，可以将所需的免疫学特征谱赋予给靶细胞，通过从具有所需性质的细胞类型中提取RNA并将靶细胞暴露于该RNA可以将特殊细胞类型所具有的所需性质赋予靶细胞。实例包括从训练有素的运动员的肌肉细胞中提取RNA，以赋予被治疗患者所需的功能；转移疫苗接种或天然抗病个体中对疾病的抗性；和强化患病患者的免疫功能。
在一些情况中，本发明的药物和方法可以包括将本发明的RNA提供给原位靶干细胞。这可以造成固有干细胞分化生成所需的分化细胞类型。可以将这样的一种方法用于任一种上面所提及的病变和疾病。在这样的一种方法中，通常输送RNA，使得它仅仅影响相当局限的一群干细胞。优选地，靶向的干细胞可以是那些生成疾病所涉及的特殊细胞类型的细胞，但并不一直都是这样。例如，对象可能患有免疫系统疾病，就可以靶向于造血干细胞。
通过给适合的组织或器官局部提供RNA可以实现向所选定的干细胞群的输送。例如，RNA的施用可以是静脉内、直肠、口服、耳内、骨内、动脉内、肌肉内、皮下、皮肤、皮内、颅内、鞘内、腹腔内、局部、胸内、眶内、脑脊液内、结节内、病灶内、经皮、鼻内(或其它粘膜)、肺、或吸入到感兴趣的位置。例如，可以通过局部注射提供RNA。可以通过将RNA注射到血管或其它脉管内并到达所需的靶位置以提供RNA。可以通过局部注射到所需组织以施用RNA。可以通过在此所提及的任一途径施用RNA，如肌内注射或经ballistic输送。在一些情况中，可以实现局部输送，因为所提供的RNA是一种能特异地将RNA靶向于所选定细胞的形式。例如，可以提供脂质体或其它颗粒内的RNA，它们具有针对于特异的所需干细胞类型的靶向分子。在优选的实施方案中，可以经直接器官注射、血管通路、或经肌内、腹腔内或皮下途径施用RNA。
在一个优选的实施方案中，如下实现RNA的施用：
●从包括任一在此所提及的组织类型的所需组织类型中制备RNA提取物；
●直接给受影响的器官注射RNA或经如上定义的全身输送的方式注射RNA；和
●RNA诱导固有干细胞的分化，造成了例如所需细胞类型的增殖、迁移和修复。
在一些实施方案中，RNA序列是可从一种或多种分化细胞类型中提取的或提取到的。例如，在一个特异的实施方案中，RNA来源于原代组织，例如脑组织。在其它的实施方案中，RNA是可从一种或多种干细胞类型或干细胞活性组织中提取的。例如，在一个特异的实施方案中，RNA来源于成体干细胞，例如骨髓干细胞。在另一个特异的实施方案中，RNA来源于胎儿、新生儿、幼体或胚胎组织。
b)利用干细胞的治疗
在一些情况中，可以给对象施用利用本发明的方法获得的干细胞，而不是施用具有用本方法经来自非干细胞的细胞的RNA所改变的性质的分化细胞或干细胞。可以施用干细胞以放大那些已经存在于对象体内的干细胞。在一些情况中，可以给组织损害的部位施用干细胞，然后容许其自然分化。在一些情况中，可以加入干细胞以放大那些已经作为缺少固有干细胞群中存在的一些缺陷和特别是遗传缺陷的附加干细胞存在的干细胞。例如，对象可以具有一种遗传疾病，它造成了特殊细胞类型或细胞系的缺失、特殊细胞类型或细胞系数目的减少或造成了特殊细胞类型或细胞系的缺陷。然后可以转移缺少缺陷的干细胞以补偿遗传缺陷，因为它们可以生成所需的细胞类型或细胞系或者它们生成了缺少功能缺陷的细胞或细胞系。施用的干细胞可以增殖以保持它们的数目，并且也生成了分化细胞，因此具有长期持续的作用，减少了频繁治疗的需要。事实上，干细胞的转移可以造成病变的永久治愈或缓解。
对象例如可以具有遗传缺陷所引起的一种免疫缺陷。转移利用本发明获得的没有缺陷的干细胞群可能足以治疗疾病，因为所生成的免疫细胞群将缺少缺陷并且是有功能的。在一些情况中，疾病可能是由感染特别是由病毒感染所引起的，并且干细胞可能具有避免干细胞被感染的一些修饰。在其它情况中，可以将利用本发明的方法获得的干细胞转移到其自身干细胞群已经被清除的对象中。例如，对象已经被暴露于放射线或化学剂，造成了干细胞数目的减少。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，对于干细胞被转移到对象的情况，干细胞来源于同一个对象，利用本发明从它们的分化细胞中生成干细胞。在其它情况中，干细胞可以分化自一个免疫相容的无关个体。在一些情况中，用于获得干细胞的分化细胞可以来自不同的个体，但是提供给细胞的RNA可以来自预期受体或遗传相容的受体。RNA的提供可以造成干细胞与预期受体是免疫相容的。
c)利用分化细胞的治疗
在一个其它的实施方案中，可以给对象施用利用本发明获得的分化细胞。在一个优选的实施方案中，可以从预期受体中获得或生成用于获得分化细胞的干细胞。可以施用在此所提及的任何一种分化细胞类型，以及对象可以患有在此所提及的任何一种疾病和病变。
可以给疾病所影响的局限部位施用分化细胞。例如，在糖尿病中，它们可以被输送到胰腺；在脊髓损害中，它们可以被输送到脊髓神经；对于脑部疾病，可以输送到脑部等等。在一些情况中，可以给对象提供出现在一种结构中的或作为结构的一部分的分化细胞。例如，可以将分化细胞包被的支架插入到血管中或者可以给受损的或患病的肝脏提供置于基质上的肝细胞。
本发明也提供了一种提高或矫正对象中的组织或细胞损害或遗传疾病的方法，方法包括给对象施用在体外通过诱导干细胞系的全能或多能干细胞或从动物的组织中获得的全能或多能干细胞分化成一种或多种所需细胞类型而获得的有效量的分化细胞，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA。在一个特别优选的方法中，从所治疗的对象中获得所用的干细胞。在一个甚至更优选的实施方案中，通过利用本发明的方法在体外诱导逆转分化细胞的分化以提供干细胞而获得所用的干细胞，以及特别地从对象中获得用于获得干细胞的分化细胞。
d)RNA和细胞的联合治疗
本发明的RNA可以联合其它的活性剂施用给细胞群，活性剂包括例如于细胞(具有或不具有改变的、潜在的或明显的性质)或分化细胞。可以同时地、顺序地或分开地施用RNA和其它的活性剂。
也可以采用这些成分的组合。例如，可以给对象施用包括干细胞的药物，然后可以施用包括本发明的能诱导分化的RNA的药物，以在原位诱导它们的分化或改变。在其它的方法学中，可以在导入RNA后导入干细胞。可以同时地、分开地或顺序地施用本发明的细胞和RNA。也可以与治疗特殊疾病有效的其它治疗同时地、分开地或顺序地施用本发明的细胞和RNA。在一个实施方案中，可以与细胞例如干细胞同时地、分开地或顺序地施用可从一种或多种干细胞类型或干细胞活性组织中提取的RNA。例如，在优选的实施方案中，可以与干细胞特别是骨髓干细胞同时地、分开地或顺序地施用全胚胎RNA、胎儿RNA、新生儿或幼体RNA。显示了通过共同注射胚胎来源的RNA部分和干细胞提高了由干细胞介导的组织修复和再生。
e)在施用之前用RNA处理细胞
施用本发明这个方面的本发明的药物可能包括在给对象施用干细胞之前用本发明的RNA处理干细胞。这个方法具有增强对象中干细胞的动员、迁移、整合、增殖和/或分化的作用。在一个优选的实施方案中，用根据本发明上述的任一实施方案从一种或多种分化细胞类型中可提取的或提取到的RNA序列处理干细胞。例如，在一个特异的实施方案中，可以在将骨髓干细胞施用给对象之前用脑RNA预处理骨髓干细胞，对象是例如患有年龄相关性脑部损害的对象。在此已经成功地证实逆转并因此治疗了年龄相关性脑部疾病。在另一个特异的实施方案中，在将骨髓干细胞施用给对象之前，用脊髓RNA预处理骨髓干细胞，例如对象患有运动神经元病。在此已经证实这对于公认的运动神经元病的模型是有效的。
f)利用具有改变的性质的干细胞的治疗
在一个其它的实施方案中，可以给对象施用利用本发明获得的具有改变的性质的干细胞。在一个优选的实施方案中，在体外用RNA处理之后即刻，在当一些改变的性质仍是潜在的而不是明显的时候，施用细胞，其中可以在受体体内出现更晚阶段的迁移、整合、增殖和分化。在另一个实施方案中，在增殖和分化都已经是明显的时候施用细胞。在一个优选的实施方案中，可以从预期受体中获得或衍生的用于获得具有明显的或潜在的改变的性质的干细胞。相对于在此所提及的任一分化细胞类型，可以施用具有潜在的或明显的改变的性质的细胞，以及对象可以是患有在此所提及的任一疾病和病变的对象。
可以将具有潜在的或明显的改变的性质的细胞施用给受疾病所影响的局部部位。例如，在糖尿病中，它们可以被输送到胰腺；在脊髓损伤中，它们可以被输送到脊髓神经；对于脑部疾病可以输送到脑部等等。在一些情况中，可以给对象提供存在于一种结构上或作为结构的一部分的所述细胞。例如，可以将经所述细胞包被的支架插入到血管内或可以给受损的或患病的肝脏提供基质中的肝细胞。在另一个实施方案中，可以根据更常用的途径施用具有改变的性质的细胞，例如通过施用到循环内、腹腔内、施用到脑脊液内、胸腔内。
通过给例如合适的组织或器官局部提供细胞可以实现具有潜在的或明显的改变的性质的细胞的输送。例如，细胞的施用可以是经静脉内、骨内、动脉内、肌肉内、皮下、皮肤、皮内、颅内、鞘内、腹腔内、局部、胸腔内、眶内、脑脊液内、结节内、病灶内、经皮、鼻内(或其它粘膜)、肺、吸入到相关位置。例如，可以通过局部注射提供细胞。通过将细胞注射到血管或其它管路内使其到达所需的靶位置。可以通过给所需组织局部注射而施用细胞。可以通过在此所提及的任一途径例如经肌肉内注射施用细胞。在优选的实施方案中，可以经直接器官注射、血管通路、或经肌肉内、腹腔内、或皮下途径施用细胞。
本发明也提供了一种提高或矫正对象中的组织或细胞损害或遗传疾病的方法，方法包括给对象施用有效量的具有明显的或潜在的改变的性质的细胞，这些细胞是在体外通过改变干细胞系的全能或多能干细胞或从动物的组织中获得的全能或多能干细胞的性质而获得的，方法包括将分离的RNA在实现所述干细胞的性质的改变的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，分离的RNA包括可从包括所述所需细胞类型或组织的组织或细胞中提取的RNA。在特别优选的方法中，从所治疗的对象中获得所用的干细胞。在另一个优选的实施方案中，通过利用本发明的方法在体外诱导分化细胞的分化的逆转以提供干细胞而获得所用的干细胞，以及特别的，从对象中获得用于获得干细胞的分化细胞。
可以用本发明治疗或改善退行性脑病、脑或脊髓损伤或其它神经元疾病。在优选的实施方案中，可以给患有退行性疾病的对象提供细胞，特别是患有年龄相关性退行性疾病的对象。利用本发明的药物所治疗的疾病或损害可以影响脑部。对象例如可以是患有退行性脑病的对象。脑部疾病的实例具体地包括帕金森病、帕金森型疾病、Alzhermer’s病、痴呆、其它年龄相关性脑部病变和运动神经元病。也可以治疗多发性硬化。可以治疗的另一种疾病是糖尿病，特别是1型和2型糖尿病，通过提供产胰岛素的朗格汉斯细胞岛取代或放大(augment)有缺陷的细胞。本发明也可以用于患有由关节的损害，例如关节炎所引起的疾病对象。
本发明也提供了一种用于提高或矫正组织或细胞损害或遗传疾病的制剂(agent)，该制剂包括在此定义的RNA或分化细胞(或具有潜在的或明显的改变性质的细胞)、或两者的组合。例如，本发明提供了对退行性疾病和年龄相关的任何器官的退行性，例如心脏病、充血性心脏衰竭、心脏瓣膜功能不全、静脉瓣膜功能不全、退行性肾脏疾病、和退行性肝脏疾病的治疗。本发明也提供了在血管意外所引起的损害之后的组织再生，血管意外例如是缺血、血栓形成、动脉瘤和褥疮。
本发明也提供了一种用于再生、修复或取代经任何形式的病理学、年龄或外伤所引起的受损的或缺失的组织的方法。例如，本发明提供了一种用于在脊柱的外伤性损害之后的再生和修复的方法。
在上述的治疗对象的方法中，可以如在此的任何地方所定义的那样定义干细胞、分化细胞、改变细胞、RNA、提供RNA和其它方面。对于上述的试剂，RNA或分化细胞或改变细胞可以是任何的在此所定义的RNA或分化细胞或改变细胞。
在体外用于逆转分化细胞的分化以提供干细胞的方法
本发明提供了逆转分化细胞的分化以生产干细胞的方法。因此本发明提供了一种在体外逆转细胞系的分化细胞或从动物或植物的组织中获得的分化细胞的分化以生产所需类型的全能或多能干细胞或干细胞系的方法，其包括将分离的RNA在实现将分化细胞的分化逆转成所述类型的干细胞或干细胞系类型的条件下提供给所述分化细胞的细胞培养物，分离的RNA包括可从所需类型的干细胞或干细胞系中提取的RNA序列。RNA可以是可从包括所述所需类型的细胞中提取的或提取到的。
现有的用于分离干细胞的方法常常是辛苦的并需要来自对象的大量材料，逆转分化细胞的分化以提供干细胞的能力提供了更为便利的可选择方法，它更不费时，更经济和更少侵袭性。具体地，对于需要从患有疾病的对象中获得干细胞的情况，由于从患者中回收干细胞或有限量的可回收材料所需方法的侵袭性，从这样一个对象中直接分离到干细胞简直是不现实的。本发明的方法也具有的优点是它可以获得很广范围的干细胞以及所获得的干细胞具有分化成很广范围的分化细胞类型的能力。
在本发明中所采用的分化细胞可以是任何适合的分化细胞，包括在此所提及的任何分化细胞。具体地，分化细胞可以是容易接近的细胞。可以从皮肤样品或从口腔中获得分化细胞。在一个特别优选的情况中，分化细胞可以是成纤维细胞以及特别是皮肤成纤维细胞。在一些情况中，可以从体液以及特别是从血液中获得细胞。在一些情况中，可以使用白细胞例如淋巴细胞。
利用在此所述的任何方法都可以提供RNA。在给细胞提供RNA之后，可以培养并传代所形成的干细胞。通过检查细胞形态并检查干细胞特异标记物的存在可以确认分化的逆转。通过检查被传代的细胞经几代后没有发生分化也可以确认干细胞自我更新的能力。也可以检测细胞分化成特异细胞的能力。可以确定出所获得的干细胞的核型，特别是可以检查其核型以保证细胞的核型在经过数代后仍是稳定的。可以扩增干细胞。可以将干细胞的样品冷冻用于以后的施用或参照。具体地，可以冷冻已经进行少数代传代的细胞的样品，例如已经进行少于10代、少于5代、两代或1代传代的细胞。从常用的干细胞群中可以建立克隆干细胞系，并选择出其特异的所需特征例如它们的发育能力。
也可以操纵所形成的干细胞以导入所需的遗传修饰。例如，如果原有的分化细胞包括一种遗传缺陷，就可以纠正该缺陷。可以导入能功能性弥补缺失的或有缺陷的序列的序列。可以导入缺失的或有缺陷的基因的功能拷贝或其它序列。可以用例如PCR和Southern印迹技术筛选和鉴定具有所需修饰的克隆。可以分化并评价所获得的干细胞，以检查缺陷是否已经被纠正。可以用例如基因打靶技术将位点特异性改变导入到基因的内源性拷贝中。可以联合位点特异性重组酶采用这些技术以去除在打靶中所用的选择性标记。具体地，利用这些技术可以纠正单基因疾病。可以纠正显性和隐性疾病。
在本发明利用干细胞的任一方面都可以使用所获得的干细胞。它们也可以被用于干细胞的任何其它应用。例如，它们可以被用于非人嵌合动物和转基因的非人动物的产生。
在此显示了利用从胚胎干细胞中提取到的RNA可以从成体干细胞生成胚胎干细胞样细胞。也显示了当用多种干细胞来源的RNA部分处理时，其它的分化成体组织可以被分化成干细胞样组织。
本发明提供了利用上述方法获得的细胞。在一些情况中，可以提供作为在合适容器中等份冷冻的细胞。本发明也提供了细胞的细胞提取物。
用于在体外诱导干细胞分化的方法
本发明也提供了用于在体外诱导干细胞分化的方法。通过给细胞提供一种RNA序列实现分化，所述RNA序列包括可从需要将干细胞分化为其的细胞类型中提取的RNA。RNA可以是可从包括所述所需细胞类型的细胞中提取的或提取到的。具体地，本发明提供了一种在体外诱导干细胞系的全能或多能干细胞或从动物或植物的组织中获得的全能或多能干细胞分化成一种或多种所需细胞类型的方法，其包括将分离的RNA在实现所述干细胞的所需分化的条件下提供给所述干细胞的细胞培养物，分离的RNA包括可从包括所需细胞类型的组织或细胞中提取的RNA序列。
在本方法中可以使用任何干细胞，包括在此所提及的任一干细胞。在一个优选的实施方案中，利用本发明的方法逆转分化细胞的分化以提供干细胞可以获得被分化的干细胞。在预计所获得的分化细胞被用于对象的治疗或用于生产治疗对象的药物的情况中，干细胞可以来源于预期受体。在一些情况中，干细胞可以来源于具有遗传缺陷的受体，在这些情况中，优选地可以纠正或改善干细胞中的遗传缺陷。
利用在此所讨论的任一方法可以将RNA提供给靶干细胞。
可以将干细胞诱导成任何所需细胞类型，包括在此所提及的任一细胞类型。在一个优选的情况中，干细胞被分化成稳定的终末分化的细胞类型。终末分化细胞类型一般可以被认为是一种不会天然分化生成任何其它细胞类型的细胞类型，以及它通常处于谱系的末端。在一些情况中，干细胞可以被分化成干细胞和谱系终末细胞之间的中间细胞。这些中间物可以具有一定程度的增殖能力。
分化细胞可以是器官或组织中的细胞，例如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、皮肤、胃肠道、眼、或生殖器官。在一个优选的实施方案中，分化细胞类型可以是一种在特殊病变下缺少的、数目减少的或有缺陷的细胞类型。病变可以是在此所提及的任一病变，包括损伤、退行性疾病或遗传疾病所造成的病变。在一个特别优选的实施方案中，分化细胞可以是朗格汉斯细胞岛，所形成的细胞可以被用于治疗糖尿病。在另一种情况中，分化细胞可以是中枢神经系统中的一种细胞，它可以被用于治疗中枢神经系统的疾病或损伤，特别是治疗脑部疾病或脊髓损伤。在一个优选的实施方案中，骨髓基质细胞可以被分化成神经元细胞。
在一些情况中，被分化的干细胞可以是多能干细胞，而不是全能干细胞。在这些情况中，干细胞例如可以被分化成一种细胞类型，该细胞类型是已知干细胞在其从中分离的生物体中可以分化的一种细胞类型。
在一个优选的实施方案中，骨髓基质干细胞可以被分化成神经元细胞。具体地，它们可以被分化成表达神经元标记蛋白(NeuN)的神经元细胞。典型地，通过提供分离的RNA可以将骨髓干细胞分化成神经元细胞，所述分离的RNA包括可从一种或多种类型的脑细胞或脑细胞系中提取的RNA。在一些情况中，RNA可以包括可从脑组织中提取的RNA，特别地它可以包括一种可从脑组织中提取到的RNA。在一个特别优选的情况中，RNA可以包括可从皮层神经元或皮层神经元细胞系中提取的RNA。在一些情况中，可以采用可从在非脑的其它部位所发现的神经元中提取的或可从来源于这些神经元的细胞系中提取的RNA。
在另一种优选的实施方案中，可以诱导骨髓干细胞分化成肌肉细胞，特别是骨骼肌细胞。所提供的RNA序列典型地包括可从肌肉细胞或肌肉细胞系中、特别是从肌肉干细胞中提取的或提取到的RNA。
在另一个优选的实施方案中，用脊髓来源的RNA预处理骨髓干细胞，显著地提高了干细胞治疗已建立的进行性神经退行性疾病模型的疗效。在这个实施方案中，所提供的RNA序列典型地包括可从脊髓细胞或周围神经系统的其它细胞中提取的或提取到的RNA。这个方法学也可以包括在体内施用这些RNA以原位影响干细胞的增殖、迁移和功能整合。
在另一个优选的实施方案中，已经显示用脑来源的RNA对干细胞的预处理增加了它们的增殖、迁移和功能整合到受体的神经系统中。此外，来源于更不成熟的发育阶段、处于活跃细胞增殖阶段的RNA表现出更为显著的对干细胞刺激的作用以及它们对年龄和疾病相关性损害的必然的改善作用。本方法学也可以包括在体内施用这些RNA以原位影响干细胞的增殖、迁移和功能整合。
本发明提供了利用上述方法获得的细胞。在一些情况中，可以提供作为合适容器中的等份冷冻的细胞。本发明也提供了细胞的细胞提取物。
在一些情况中，当干细胞被分化时，干细胞可以存在于一种结构之内或之上，例如支持物、膜、植入物、支架或基质，或者分化细胞可以被加入到这样一种结构中。然后可以将结构用于生产用于治疗在此所提及的任一病变的药物。例如也可以制备不同的分化细胞类型的混和物以模拟在体内出现在一起的群。
在一个优选的实施方案中，体外方法可以包括：
●根据已建立的方案提供并在体外培养干细胞群；
●给干细胞提供从所需靶组织类型(例如神经元、神经胶质细胞、肌肉或上面所提及的任一分化细胞类型)中提取的RNA；和
●将细胞维持在培养物中；
在一个其它的优选实施方案中，体外方法还可以包括步骤
●从所需靶组织类型(例如神经元、神经胶质细胞、肌肉或上面所提及的任一分化细胞类型)中提取RNA。
在本发明的这些实施方案中，或1)作为裸RNA提取物，或2)经脂质体介导的转移，或3)经对受体细胞的电穿孔或其它已建立的方法，可以将RNA优选地提供给干细胞。
然后优选地可以将所形成的分化细胞配制成药物，其能通过合适的途径例如经皮下、真皮下、静脉内或腹腔内途径给施用给对象。
一般概念
术语“包括”涵盖了“包含”和“组成”，例如包括“X”的组合物可以由X唯一地构成，或可以包含一些附加的物质例如X+Y。
术语“基本上”并不排除“完全地”，例如“基本上没有”Y的组合物可以完全不含Y。如果需要，可以从本发明的定义中删除术语“基本上”。
与数值x有关的术语“大约“意思是例如x±10％。
具体实施方式
下面的实施例举例说明了本发明。
实施例1：从骨髓基质干细胞产生神经元和肌肉细胞
骨髓采集和培养
从成体Sprague Dawley大鼠中获得骨髓基质(间质)干细胞。该技术基于Owen和Fridenstein(1988)的方案，并代表着一种典型的已建立的适用于体外扩增的成体干细胞来源。简单地，在按计划杀死鼠(断颈)之后，在死亡的5分钟内切下胫骨和股骨。去除骨骼上的所有结缔组织和肌肉组织，在无菌条件下进行所有的其它操作。
通过用含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的培养基(α-MEMS-Gibco Invitrogen Co.UK)冲洗骨骼，排出骨骼中的骨髓。通过将连接在5ml塑料管上的25号针头插入到骨骼的颈部(远端和近端的切口)并经骨骼排出2ml培养基而实现冲洗。将培养基和骨髓样品收集在无菌的通用容器内。随后，通过经19号针头轻轻地碾磨约10次将骨髓细胞分离。然后将1ml抽吸物放置到6孔板(SLS Ltd.UK)内。然后往每个孔内加入2ml新鲜的α-MEMS，使得每个板内的细胞密度为约12,000-15,000个细胞/ml。然后将板在37℃、5％CO2的空气中孵育并留置24到48个小时(Harrison&Rae，1997)。
在这个时间段之后，通过抽吸板内的培养基，从非塑料粘附的细胞中分离出骨髓来源的干细胞。留下了塑料粘附的骨髓基质干细胞，然后加入2ml新鲜的α-MEMS(10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素)支持。每48个小时供应一次新的培养基，直到板被经显微镜分析确认的集落形成单位(CFU)铺满(Owen&Friedenstein，1988，如前)。在优化条件下，在37℃需要5到7天。所形成的细胞经形态学和免疫组化确认为基质干细胞。
RNA操作
制备脑匀浆液，并用RNA的商业分离试剂盒或标准的基于苯酚的操作法分离RNA。在最初的实验中，用基于Kirby(1956)的冷苯酚提取法制备RNA。从8只新近杀死的大鼠中新近切下脑。称量除了小脑的8克脑，并加入5ml磷酸缓冲盐水(PBS)。在玻璃Teflon匀浆器内将混和物匀浆约4分钟。加入相同体积的95％饱和苯酚。将所形成的溶液在室温下放置15分钟，然后在超速离心机内在18,000rpm离心30分钟。保留水相，并加入1M MgCl2使得MgCl2的浓度为0.1M。然后加入2倍体积的乙醇，然后沉淀约30分钟。最后在6,000rpm下离心15分钟生成富含RNA的沉淀，将其保留并储存在乙醇中。将所形成的RNA风干并溶解在如上定义的6ml新鲜培养基内。
往每个铺满骨髓干细胞的孔内加入1ml含有RNA的培养基，24小时。24小时之后，去除RNA培养基并用新鲜培养基取代。每12小时观察细胞的表型变化。
另外，将细胞进行免疫组织化学分析以确定RNA在骨髓干细胞中所诱导的是神经元表型。通过测试所处理的细胞的神经元标记物NeuN的表达可以实现这一点。在下面的表中显示了所获得的结果。
细胞形态    NeuN未处理细胞保留CFU形态    -脑RNA处理的细胞发育的神经元型形态    +
对细胞的检查表明在应用脑来源的RNA后24个小时，RNA诱导细胞分化变为清晰的神经元表型。未处理的骨髓干细胞仍保持经典的集落形成单位形态。但是，早到处理后12个小时，脑RNA处理的干细胞就表现出经典的神经元和神经胶质细胞的形态。另外，这些细胞表达常用于神经元的免疫化学标记物。对照细胞没有表达。表型的这种变化可传代存活(x3)，因此表现为受体干细胞分化中的稳定变化。通过随后的实验确认了供体组织RNA改变干细胞分化的作用，其中经RNaze的预处理消除了RNA的诱导作用，而其对强蛋白酶胰蛋白酶对供体脑RNA的处理具有抗性。
用来源于骨骼肌的供体RNA重复实验以确认所诱导的分化的特异性。如上制备干细胞并用肌肉来源的RNA(利用商品化可获得的试剂盒RNAzol制备的)处理干细胞，清楚地表现出向肌肉表型的稳定的分化改变。通过用受磷蛋白和毒伞素的免疫染色确认这一点。在肌肉研究中，经不同方法的RNA输送，将干细胞暴露于肌肉来源的RNA(用不同的RNA分离技术所获得的)。经用Felgner等(1987)的方法制备的脂质体将RNA输送给干细胞。从这些研究中可以得出结论：对干细胞的诱导是特异于供体组织来源的，经通常适用于将核酸输送给细胞的多种技术可以给干细胞添加RNA。
实施例2：通过受体动物的空间学习和记忆能力评价脑RNA分化的干细胞对大鼠脑的年龄相关性损害的作用
如上实施例1所述在体外制备骨髓间质干细胞。当细胞铺满时，将细胞暴露于脑RNA(如上制备)12小时。供体干细胞来源于有色大鼠品系(Lister Hooded)。提供了来自不同大鼠品系(SpragueDawley)的供体RNA和受体动物。
受体Sprague Dawley大鼠是年龄在468-506天之间的外饲养雄性大鼠。已知这些高龄动物不能学会找到水迷宫中的隐藏平台(Stewart&Morris，1993；Bagnall&Ray，2000)。实验动物接受0.5ml脑RNA处理的干细胞的静脉内注射，等同于一个6孔板的脑RNA处理细胞的产量。对照动物接受相同量的未处理的干细胞。简单地，通过用橡胶刮棒将细胞与塑料板机械分离并经抽吸收集培养基中的细胞，从板中收集细胞，包括处理的(实验)或未处理的(对照)细胞。经在1000rpm下旋转5分钟浓缩细胞，并使细胞达到上面所列的浓度。不知情地进行所有的注射操作。对于两组而言，经尾部静脉实施注射。
在注射后14天，在常用的空间学习任务Morris水迷宫中不知情地评价老龄大鼠。每只动物在3天的时间内接受每天3次游泳，试验中间间隔10分钟(Stewart&Morris，1993)。记录下每只动物在每个试验中发现平台的潜伏期。每个试验由60秒的游泳构成。如果在间隔之后，动物还没有找到平台，试验者轻轻地将其引导到平台。在达到平台之后，容许动物停留10秒钟以便在回到饲养笼之前定位其位置。通过在重复试验中缩短找到平台的时间可以证明学习能力。
在图1中显示了研究的结果。静脉内接受没有暴露于RNA的干细胞的对照大鼠(n＝9)不能学会这个任务，在多次试验中都没有缩短其反应潜伏期。但是，接受了经脑RNA处理的干细胞的实验动物表现出与年轻啮齿类动物相当的显著的学习能力(p＜0.0000000001)。从这个研究中可以得出两个结论。首先，经RNA处理的干细胞能显著地改善年龄相关的空间学习缺陷。对照未处理的干细胞则不能。第二，应当注意到所捐赠的干细胞是来自于不同的大鼠品系，以及不需要受体动物成为免疫缺陷的。因此，结果提示实验组细胞不仅分化成了能功能改善的合适的神经组织，它们还获得了一种使得它们能被受体接受的免疫状态。应当注意到供体脑RNA来源于受体的同胞动物，供体细胞来源于不同系。
结果不仅确认了RNA分化的干细胞能通过恢复行为能力修复年龄相关性损害，而且这样处理的细胞还获得了供体RNA的免疫特征。这就提供了一种改变干细胞系或干细胞库的免疫学特征谱以生成具有与受体特异相容性的分化细胞的策略。
实施例3：经外源性RNA刺激的分化、迁移和整合对固有干细胞的体内刺激。
在实施例1和2中获得了外源性RNA对干细胞的强刺激作用，和这些细胞对修复哺乳动物模型中的年龄相关性损害的作用，现在进一步给出其它的实施例，确立原代组织来源的RNA对宿主动物的固有干细胞的作用。为此，新生大鼠在出生后第1天就接受了腹腔内注射供体表达GFP的粗制骨髓。每只动物接受了含有约800,000个细胞的0.2ml注射液。这些外来细胞容易与宿主骨髓整合，并因为其生物学环境而容易被观察到。在90天大时，随机地将GFP骨髓移植动物分成两组。
实验动物接受脑RNA注射，对照动物接受生理盐水注射。如实施例1所述制备实验脑RNA。进行皮下注射。每只动物接受了含有与一个全脑等价的供体RNA的0.5ml注射液。对照接受了等价的生理盐水注射液。
所获得的结果显示实验动物比对照动物具有显著增厚的受体皮层(p＜0.0001)。另外，在实验动物中的显著数量的分化神经元和神经胶质细胞都表现出GFP的表达，说明在应用外源性脑RNA之后固有骨髓干细胞对脑部的浸润。
实施例4：通过从皮层神经元的原代细胞培养物中分离到的外源RNA诱导干细胞的分化。
根据Saneto和de Vellis(1987)的方案，在实验室中建立了胚胎皮层神经元的纯化培养物。简单地，在怀孕16天时，杀死定时交配的Sprague Dawley雌性大鼠。用70％乙醇消毒腹部区域，并暴露出子宫。然后切下含有胚胎的子宫，并将其放置在100mm培养皿内。为了预防污染，所有的上述操作都在无菌罩外面的净化台上进行。在无菌条件下进行所有的其它操作。
然后用生理盐水冲洗整个子宫，并将其转移到另一个无菌培养皿内。然后从子宫中切割下胚胎并将其放置在一个新的用于脑部切割的培养皿内。暴露出脑组织并用刮勺轻轻地将其取出，在解剖显微镜下解剖出皮层。然后在生理盐水中清楚地切开脑膜。在处理了皮层之后，反复地通过10ml玻璃吸管将其轻轻地弄碎。然后将细胞悬浮液流经Nitex130过滤器(筛孔大小130μm)，并在40g下离心过滤。然后将沉淀重新分散在无血清的基础培养基中(Saneto&deVellis，1987，如前)，并流经Nitex130(筛孔大小33μm)，计数细胞。
往悬浮液中补加胰岛素(5μg/ml)和运铁蛋白(100μg/ml)以形成神经元专用培养基。将细胞按1×105个细胞/孔的密度种植在经多赖氨酸(2.5μg/ml)预先包被的24孔培养板上。用表达标记物神经纤维蛋白，而不表达星形胶质细胞及少突胶质细胞的生化及免疫标记物的免疫学标准确认培养物中含有超过95％的神经元(Saneto&deVellis，1987，如前)。在铺板后，每3天更换培养基，并在RNA提取之前维持培养物12天。
根据厂商的说明利用商业试剂盒(RNAzol)从原代皮层神经元培养物中提取RNA。收集所形成的RNA并在应用到如实施例1中所制备的大鼠骨髓细胞的铺满集落之前将其重新溶解在骨髓培养基中(如实施例1所定义)。每个受体骨髓培养孔都接受了从一个完整的24孔原代神经元培养物中提取的总RNA(尽管多种外源性RNA的浓度都获得了相似的结果)。
在应用溶解在培养基中的外源性RNA后24个小时，显微镜下检查骨髓干细胞。对照骨髓干细胞接受了相等量的RNAzol制备的骨髓干细胞RNA。
结果显示所有实验干细胞孔都清楚地产生了分化神经元，其神经元标记物染色阳性。在骨髓RNA处理的孔中没有发现干细胞分化的可观察到的变化。这些结果说明来自纯化细胞来源的供体RNA可以诱导高度特异的干细胞分化。
外源性RNA部分的分化诱导作用对于RNaze对供体RNA的预处理是敏感的，而对胰蛋白酶是不敏感的。这说明是RNA介导了这个作用。利用包括脂质体或电穿孔的多种输送方法和载体外源输送广泛范围的RNA剂量可以重复这些作用。
实施例5：经外源性应用从干细胞来源中获得的RNA部分对终末分化细胞的逆转化
在实施例1到4中给出了RNA组织提取物对干细胞分化的强大的和特异的作用，提供最后一个技术实施例。在此，从培养的于细胞中获得了供体的富含RNA的提取物。通过向终末分化的成体成纤维细胞外源性应用干细胞来源的RNA部分以探讨受体的成熟分化细胞是否能再分化成干细胞的特征和行为，并测试其逆转分化的能力。所获得的结果显示可以从分化组织中生成干细胞类型组织。
根据Kawaja等(1992)的方案，获得成体大鼠(Lister Hooded)的成纤维细胞，并将其保持在培养条件下。将皮肤的活检物(近1cm2)放置在含有磷酸缓冲盐水(PBS)(pH7.4)的无菌Petri皿内。然后将活检物浸泡(3x)在另一个装满70％乙醇的皿中，然后放回到新鲜的PBS中，并将其切成1-2mm的碎片。将这些分离块放置到预先装有1ml Delbecco基本必需培养基(加有10％胎牛血清(FBS)和0.1％谷氨酰胺，也加有10单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的60mm组织培养皿内。在5％CO2和37℃下孵育培养物。
在这些的培养条件下两天之后，成纤维细胞开始从分离块中迁出，在此阶段加入附加的2-3ml营养培养基。
当板达到近90％被铺满时，通过将培养物与1-2ml胰蛋白酶溶液孵育将细胞传代，转移到15ml离心管内，然后在台式离心机(benchcentrifuge)中室温下离心10分钟。去除上清液，将细胞沉淀物重悬在10ml培养基中。将细胞在未处理的6孔板中保持到汇合，每个板都加有含有0.5ml细胞悬浮液的2ml培养基。此时它们还可以被进一步传代。
供体DNA来源于如实施例1中所报道的保持在培养物中的成体大鼠骨髓间质干细胞或来源于根据Reynolds&Weiss(1992)的方案培养的神经干细胞(神经球)。按照产品说明，用RNAzole分离法制备所有的富含RNA的提取物。因此，可以获得两种供体RNA部分：
1)骨髓干细胞RNA(BMS-RNA)和2)神经干细胞RNA(NS-RNA)。按从0.75μg/ml到500μg/ml的不同浓度将这些RNA部分分别溶解在成纤维细胞生长培养基中，并将其加入到保持在最终培养孔中的成体分化成纤维细胞5天。用干细胞来源的外源性RNA对成纤维细胞的转化表现出跨度范围很大的剂量。
在所获得的结果中，没有用外源性干细胞RNA处理的分化成纤维细胞没有表现出表型的变化。在RNA应用48个小时之后，用25μg/ml RNA剂量的外源性的NS-RNA或BMS-RNA处理的成纤维细胞都表现出清楚的形态学变化。NS-RNA处理的受体成纤维细胞所形成的浮球具有神经球的表观和特征，从这些神经表型细胞中开始发散出那些容易在形态上被鉴定为神经元和神经胶质细胞的细胞。例如在25μg/ml的BMS-RNA处理的受体成纤维细胞表现出间质干细胞的经典的双极形态并且能粘附塑料。
随后的试验显示当如实施例1中所述用外源性RNA进一步诱导时，这些细胞能生成神经元和肌肉组织。外源性干细胞来源的RNA部分的逆分化诱导作用对于用RNaze对供体RNA的预处理是敏感的，而对胰蛋白酶是不敏感的。这说明作用是由RNA所介导的。利用经各种转运方法和载体包括脂质体或电穿孔外源性转运的广泛范围的RNA剂量可以重复这些作用。
因此，当分化的成体组织被各种干细胞来源的RNA部分处理时，它们可被逆分化成干细胞样组织。所形成的细胞的性质反映出供体干细胞的形态学、行为和能力。因此，提供了一种新的和伦理上较少争议的获得用于各种在退行性医学上的应用的全能和多能干细胞的方法。
实施例6：脊髓RNA处理的骨髓干细胞和未分化的骨髓干细胞在运动神经元病的动物模型中的比较
SOD1小鼠是一种已建立好的人运动神经元病的动物模型。这些转基因动物在70-90日龄时表现出后肢瘫痪，以及运动神经元的进行性丢失并在120-135日龄时死亡。在这个研究中使用了30只动物。确认所有的动物都表达SOD1基因型。将动物随机地分成如下的三个组：
(i)组1-与脊髓RNA一起孵育的骨髓干细胞；
(ii)组2-仅有骨髓干细胞；和
(iii)组3-PBS注射液。
如实施例1所述收集并培养供体骨髓干细胞。利用在实施例1中所述的Kirby方案从新近杀死的成体C57/B1小鼠中制备出脊髓RNA。将在组1中所用的干细胞与脊髓RNA孵育5个小时(250μg/ml)，在新鲜培养基中洗涤两次，然后将其浓缩在0.1ml中，以用于给每只动物注射约90,000个细胞。将组2中用于注射的干细胞保持在培养物中，不暴露于RNA并给予5个小时对新鲜培养基的等价暴露。
每个组中的受体动物都接受了经尾部静脉的注射。利用30G针头实施注射。对72日龄到86日龄之间的受体动物实施注射，此时所有的动物都表现出后肢瘫痪。每日记录下在每种条件中存活动物的数目。另外，在简单的跑步测试中每周评价肢体运动以观察后肢和前肢的功能。
在图2中显示了这个研究的结果。用脊髓来源的RNA对干细胞的预处理显著地提高了干细胞治疗在已建立的进行性神经退行性疾病模型中的疗效。未处理的骨髓来源的干细胞的确具有一些作用，但是用RNA预分化干细胞这一新的步骤显著地提高了作用。从这个实施例中还注意到，在RNA干细胞组中的所有存活动物(6)以及在仅有干细胞组中的存活者(1)的治疗前瘫痪完全复原，并且所述治疗防止了这种正常地进行性疾病的进一步进展。
实施例7：RNA供体组织的年龄和发育阶段对干细胞迁移、整合和修复的作用
已经在各种应用中认识到了供体组织来源的RNA对干细胞的作用，这里提供了一个进一步的实施例，探讨了在RNA提取之前的供体组织的发育阶段对干细胞增殖、迁移和整合到宿主组织内的作用。
如在实施例1中所列的从表达Tau-GFP的小鼠中收集并培养骨髓干细胞。受体动物(N＝24)是254-299天大的C57/B1小鼠，它们被随机地分成三个受体组(n＝8)。干细胞培养物被随机分到三种用于注射前RNA处理的条件：
(i)组1：胎儿(E15)脑RNA+干细胞；
(ii)组2：成体(90天)脑RNA+干细胞；和
(iii)组3：干细胞+没有RNA。
利用在实施例1中详细描述的Kirby法提取RNA，并将上面详细描述的合适来源的RNA以200μg/ml的浓度溶解在培养基中。每孔的受体培养物在2ml补加1ml含RNA培养基(组1和2)的新鲜培养基中或3ml新鲜培养基(组3)中孵育12个小时。然后洗涤细胞两次并将其在0.3μl新鲜培养基中浓缩为含有约40,000个细胞以用于注射。将动物麻醉，并利用立体定位系统将细胞注射到脑的左侧脑室内。在手术后20天，利用在实施例2中报告的用于大鼠的相同的训练方案，在小鼠Morris水迷宫中评价所有的组。这个年龄的小鼠表现出与利用该训练方法的老龄大鼠相似的空间学习的缺陷。在训练之后，杀死受体大鼠，并检查脑组织的皮层厚度，并用荧光显微镜评价表达GFP的细胞的存活、增殖和迁移。
在图3中显示了行为的结果。当与组3中的动物比较时，在组1和组2中的动物在Morris水迷宫中都表现出极好的学习能力。这还显示出外源性RNA处理对干细胞在修复年龄相关性脑损害中的刺激作用(见实施例2和6)。另外，胎儿RNA+干细胞组比成体RNA+干细胞组表现出显著更快的任务的达成(p＜1×10-10)。这些数据说明当用于处理用于组织修复的干细胞时，来源于正出现广泛神经发生时的发育阶段的RNA可能具有更为显著的作用。对皮层厚度的检查进一步支持了这个结论。
对在每只动物中的20个同一解剖横切面中的皮层厚度的测定显示出成体RNA+干细胞受体和仅有干细胞组之间的显著差异(p＜1×10-5)，这证实了相似的大鼠的数据(见实施例3)。但是，在胎儿RNA+干细胞组中的皮层测定值也显著地比成体RNA组更厚。在荧光显微镜下的光学观察显示成体RNA+干细胞组在整个被注射侧的以及对侧的半球都有广泛分布的表达GFP的细胞。但是，胎儿RNA+干细胞动物在整个两个半球的皮层内比成体RNA组多约30％的细胞。在仅有干细胞组中，表达GFP的细胞主要位于注射的侧脑室的下缘以及嗅球。只是偶尔有细胞位于同侧皮层。
从这个研究中可以得出结论：用脑来源的RNA对干细胞的预处理增加了干细胞的增殖、迁移和功能迁移到受体神经系统内。另外，来源于更不成熟的发育阶段(活跃的细胞繁殖阶段)的RNA可能对干细胞刺激以及干细胞所造成的年龄和疾病相关的改善作用具有更为明显的作用。
实施例8：成体干细胞来源的RNA对内源性神经干细胞及其活性的刺激作用的比较
在实施例3中提供的证据显示内源性RNA对固有骨髓干细胞恢复年龄相关性行为缺陷具有刺激作用。也描述了(实施例5)干细胞来源的RNA能影响分化组织。本实施例探讨了直接注射骨髓干细胞来源的RNA是否能刺激内源性修复机制改善年龄相关性行为缺陷。现在已知各种内源性神经修复方法，包括神经干细胞介导的直接神经生成以及干细胞分泌能影响受损的分化组织的生存因子。
如实施例1中所述收集并体外培养骨髓干细胞。然后选择用于RNA提取的汇合的培养物。利用商业产品RNAzol按产品说明书实施RNA提取。然后将所形成的骨髓RNA溶解在PBS(200μg/ml)中，准备用于注射到受体体内。
受体Sprague Dawley大鼠是年龄在433天和570天之间的外饲养(ex-breeder)的雄大鼠。因为严重的年龄相关性对CNS的损害，这些动物不能学习或记忆Morris水迷宫任务。匹配年龄将受体分成两组，每组10只动物：
(i)组1-接受15μl干细胞RNA注射；和
(ii)组2-接受15μl用RNaze处理的干细胞RNA注射(见实施例1)。
在麻醉下，经立体定位将RNA注射到右侧脑室内。简而言之，将受体大鼠麻醉，刮干净头部并将其置于立体定位框内。用100％乙醇消毒皮肤，经纵向切口暴露出颅骨。在囟门前1.5mm和中线外侧1.5mm处钻出1.5mm宽的孔。用30G皮下针头的尖部切开可见的硬脑膜。经立体定位将装满内容物的管子插入到侧脑室内，并以5μl逐渐地射入内容物。在去除之前将管子在原位留置2分钟，用缝线闭合切口。
在注射后14天，如实施例2中所述在Morris水迷宫中盲向评价老龄大鼠。
在图4中显示了这个研究的结果。接受失活的干细胞RNA(RNase处理过的)对照大鼠不能学会任务。在试验过程中没有应答时间的缩短。但是，用干细胞RNA处理的动物都学会了任务，其在能力上与年轻大鼠相当。
干细胞来源的RNA对刺激老龄受体脑中的内源性修复机制具有显著的作用(p＝1.28×10-45)。通过对固有神经干细胞神经生成本身的刺激或通过增加在组织修复中所涉及的分泌性分子产物的产生都可以实现这个作用。
也已经用125μg/μl剂量的胎儿(E12)来源的全脑RNA(n＝8)和注射PBS的对照(n＝8)重复了这个试验，具有相似的刺激作用。注射胎儿RNA的动物比对照进行地明显更好(p＜1×10-5)。这个重复试验说明从已知显示增加的干细胞活性的发育阶段中制备的RNA也能用于刺激内源性修复机制。
实施例9：胎脑提取的RNA对受损的脑组织的体外作用
实施例8中的两个研究的结果说明来源于干细胞活性组织的外源性RNA或干细胞来源的RNA不仅可能影响内源性干细胞，也可能影响固有分化细胞。实施例5也显示了这一点。当前的描述探讨了胎脑来源的RNA对放置在体外的成体脑皮层细胞的作用。
已经知道胎儿神经元能在组织培养物中存活，而成体皮层神经元不能很好地存活。主要原因是细胞在最初的细胞制备和铺板过程中遭受的损害。已知分解外伤能产生不可修复的损害。已经假设来自活跃发育的(胎儿)组织中的RNA可以修复这样的损害，并增强这些细胞的存活。
利用在实施例1中所述的Kirby方案从3g新鲜的胎儿(E18)皮层中提取RNA。
通过在实施例4中所述的技术(Saneto&deVallis，1987)培养成体神经组织。这个方案生成了极好的胎儿皮层神经元的培养物，但是利用这个方法，成体皮层的制备物不能存活。从48天大的SpragueDawley大鼠中切割下来源皮层，并将其以约1×105个细胞的密度铺板到24孔板内。据此制备出96孔板。在铺板后24个小时，观察到所有的孔都有大量的死亡的、坏死的和即将死亡的细胞。用150μg溶解在神经元培养基中的胎脑RNA处理每个24孔板中的12个孔。每个对照孔接受新鲜的培养基。再留置细胞48个小时，然后所有的孔都接受新鲜培养基的培养基更换。每3天重复培养基更换一次。每24个小时观察细胞一次。
在培养基更换后24个小时的最初观察显示所有对照孔都是死亡细胞。没有看到活细胞，观察到漂浮的碎片块，并且在所有对照孔的底部发现了厚厚一层的死物质。发现所有的对照孔都具有混浊的变色的提示死培养物的培养基。试验孔表现为较健康，但仍含有一些死物质。但是，可看到活细胞。
在72个小时(第二次培养基更换)之后，所有对照孔都是死细胞(并被清除)。试验孔含有经培养基更换清除了的细胞碎片，但是在所有孔中，仍有一些活细胞粘附在板上。从许多细胞中都可看到向外长出小的轴突以及清楚的神经形态学。
在96个小时之后，所有试验孔都具有茂密的神经元，许多都具有可见的轴突和树突样结构。17/48(35％)孔表现出广泛的细胞接触和连通性。
在120个小时之后，所有试验组都含有大量的表现出神经元和神经胶质细胞形态的细胞群。在所有孔中都有明显的广泛的神经网络。
再保持细胞30天，并始终都表现出神经形态学。
这个实施例显示了出用于培养成体神经组织的新的方法学。此外，它说明从富含干细胞的胎儿组织来源中提取到的RNA对受损细胞具有明显的解救作用。这提示了一种通过可经各种方法被转运到老龄的、患病的组织或难治的创伤或伤口的胎儿的或培养的干细胞而进行组织修复和再生的新方法。
实施例10：大鼠胚胎RNA增加干细胞参与组织再生的用途
成年哺乳动物包括人类在多个组织和器官中都具有比胎儿阶段更差的再生能力，在胎儿阶段常常具有广泛的再生能力。与这种再生能力丧失有关的两个主要因素是疤痕组织的形成和将新细胞补充到受损组织中的分泌分子的丧失。虽然多个实验室已经报告所注射的干细胞在受损组织内的整合，但这只是相当小的级别。假设如果可以在成体中重演胎儿阶段的信号传导的机制，应该可以提高干细胞实现表现出很少的修复或没有表现出修复的结构的主要再生的能力。这包括与疤痕相关的旧损伤，已知疤痕能抑制干细胞迁移、整合和修复的能力。所用的方法是完整胚胎RNA和干细胞的共注射。所提供的实施例举例说明了在注射完整大鼠胚胎RNA和骨髓干细胞之后，成体大鼠中的已有的耳穿孔病灶的完全再生。
从定时配对的Lister Hooded大鼠的子宫中取出15天大的胎儿。用Turex匀浆器在冷PBS中机械地分离胎儿组织。利用在实施例1中所述的Kirby方案提取RNA。
如实施例1中所述培养骨髓干细胞，并如实施例7中所述将其浓缩成注射液。
损伤模型包括在注射时年龄为137和149天之间的雄性ListerHooded大鼠。所有大鼠在注射日期之前30天时接受了一个左耳的1.5mm的穿孔损伤，以建立一个旧损伤的模型。在这个年龄的大鼠不再生耳组织。
试验动物(n＝6)都接受了尾部静脉注射800μg溶解在0.3ml PBS中的胚胎RNA。1个小时之后，动物接受了第二次注射，注射了悬浮在0.3ml α-MEMS培养基中的约2×105个骨髓干细胞。对照动物(n＝6)接受了初次尾部静脉注射约2×105个骨髓干细胞，随后在1个小时之后第二次注射了0.3ml PBS。另一组是没有处理的对照(n＝6)，它们是耳部受损的但没有接受处理。
每天观察动物的任何耳部损伤再生的征象。结果显示在未处理对照组没有组织修复或重塑的证据。相似地，仅仅注射干细胞的对照也没有表现出任何修复的证据，除了在一只动物的损伤部位的周围的轻微的炎症反应持续了17个小时。所有用胚胎RNA和干细胞联合处理的试验动物在注射后6到9天之间都显示出损伤的完全闭合。在6只试验动物的5只中，有着损伤的完全重塑直到没有任何可见的疤痕或原始病变的证据的程度。动物3表现出病变的完全闭合，但仍有可见的皮肤覆盖的凹陷。
结果清楚地显示共注射胚胎来源的RNA部分与干细胞能显著地提高由干细胞介导的组织修复和再生。从这个实施例以及本发明人的其它相似的研究中可以清楚地看到，胚胎RNA改变了组织周围的宿主组织环境以引导所注射的干细胞进入到受损区域。此外，相似地改变了旧的损伤疤痕以提供干细胞浸润以及随后的病变修复的可行的环境。通过这样的共治疗，干细胞被补充到受损组织中，然后一旦进入位置则可以通过相关组织类型的再生逆转该损害。最为重要的事实是在本实施例中所用的损害模型是单独干细胞注射所不能修复的相当旧的损伤。本发明提供了一种提高任何潜在的干细胞治疗的疗效的新方法。利用从保持在组织培养物中的胎儿组织中提取的并早至干细胞注射之前48个小时将其注射的RNA也已经发现了相似的结果。还没有研究更长的间隔。相似地，RNA和干细胞的同步注射实现了相似的受损组织的大部修复。推定胚胎RNA重新生成了胎儿期间的可行的再生环境和信号传导环境。
实施例11：从成年大鼠骨髓间质干细胞中生成大鼠胚胎干细胞样细胞
虽然在许多研究实验室中都把更多的重点放在了成体干细胞的可塑性上，但是其它的实验室认为胚胎干细胞会给未来的再生医学提供最大的希望。胚胎干细胞具有一些实际的缺点例如生成胚胎干细胞的伦理问题、细胞系的污染或合适细胞的可得性。本实施例尝试用胚胎干细胞提取的RNA将成体骨髓干细胞转变成胚胎干细胞样细胞。
按照Fandrich等(2002)的方案实施对大鼠胚胎干细胞(RESC)的分离、生长和维持。简而言之，从来源于定时配对的Sprague Dawley大鼠的4到5日龄胚泡的解离的内细胞团中分离出RESC。将胚胎干细胞维持在丝裂霉素处理过的胚胎成纤维细胞的滋养层上。培养基由高葡萄糖的Dulbecco修饰的Eagle培养基、10％热灭活的胎牛血清、1％200mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素溶液(50IU/50μg)、胰岛素(0.09mg/ml)、1000U/ml LIF和5ml核苷溶液(如在Ruhnke等，2003中所报告的)构成。
这些细胞生长为有特征的光滑的圆形簇团，并且对于一种常用的ES标记物碱性磷酸酶染色呈阳性。
按照产品说明书，用RNAzol制剂从这些RESC中提取到RNA。如在实施例6中所述的将成体骨髓干细胞培养在6孔培养板中。将每个汇合孔分成试验(n＝12)或对照(n＝12)。试验孔在常规培养基更换时接受了3ml含有150μg RESC RNA的骨髓培养基(见实施例1)。对照动物接受了3ml骨髓培养基。在24个小时之后，在实验组的一些细胞的形态上已经出现了显著的变化。骨髓间质干细胞典型的集落形成单位出现了断裂，以及大量的聚集的光滑圆形簇团的细胞漂浮出现在培养基中。这种形态学是RESC培养物的提示。在对照孔中没有出现这些结构。抽吸出漂浮的聚集结构及培养基并将其放置到如上面所述的RESC培养基中的滋养层上，并长期培养维持。在60天内它们保持漂浮的圆形聚集形态学。在培养60天后，这些细胞的碱性磷酸酶(ES标记物)染色呈阳性。也抽吸出对照孔的培养基并将其放置在与进行RESC培养相同的孔内，没有出现聚集的漂浮结构。
这个试验说明了一种用于从成体干细胞生成胚胎干细胞样细胞的新方法，它所遇到的伦理问题较少。
实施例12：体内注射来自有运动耐力大鼠的肌肉RNA诱导了久坐(sedentary)大鼠的运动耐力
已知运动对于肌肉解剖学和生理学都是有益的。在反复运动过程中，骨骼肌的微损害诱导了干细胞活性和肌肉细胞生物学的改变。这些改变促进了运动耐力的增加。
将从运动大鼠的后肢肌肉中提取到的RNA注射到久坐动物内，以探讨这样的处理对受体动物在剧烈运动期间的能力的作用。运动任务包括在旋转圆筒内的奔跑。大鼠容易学会通过按圆筒的旋转速度所指示的合适的速度奔跑而停留在装置上。当动物累了并停止奔跑后，它就掉到了装满碎纸片的塑料柜中。一旦掌握了奔跑技巧，动物将在装置上快乐地奔跑直到精疲力竭。在装置上最初训练一段时间之后，将奔跑时间记录为对运动耐力的测定值。
每日按如下的合适的运动方案训练试验供体大鼠(n＝10)：
周1-每天给予动物5次试验(10分钟)，试验间的间隔为1个小时。旋转速度被设定为15mm/秒。一旦动物掉下，将其放置回到圆筒上直到完成试验的整个持续时间。在这个适应周中，所有动物都轻易地掌握了这项运动技能。
周2-每天给予动物5次试验，将速度增加到37mm/秒，以及1个小时的试验间的间隔。如果动物掉下，马上将其放回到装置上。每个试验的持续时间为15分钟。
周3-每天给予动物试验一次，速度与前相同，但一直奔跑直到第一次掉下。
周4-每天给予动物试验一次，奔跑速度为97mm/秒直到第一次掉下。
对照供体大鼠(n＝10)没有被暴露于运动装置，在整个4周的运动期内仍留在它们的笼子中。
在第4周结束时牺牲两组供体，并切下后肢肌肉。用在实施例1中所列的方法提取RNA。然后储存900μg剂量的RNA用于注射。
将受体动物(n＝20)分成两个匹配的组。所有的受体动物都接受了1周的装置上的定位训练，如在供体的第1周训练中所述的那样。它们没有接受其它的训练。
在最后的定位试验后1天，受体大鼠接受了注射到尾部静脉内的含有900μg RNA的0.3ml PBS。试验受体动物接受了运动肌肉RNA，对照动物接受了未运动的RNA。
在注射后1周，所有大鼠都接受了如下的奔跑试验：以15mm/秒的速度轻轻地奔跑5分钟。所有的大鼠在这个时期都是能平衡的并能安逸地奔跑。在5分钟的平衡试验之后，速度被增加到了97mm/秒，记录直到掉下/跳下的持续时间作为运动耐力的测定值。
在两组之间有着明显的差异。接受未运动的RNA的受体有着3.54分钟的平均运动时间。接受来自运动大鼠的肌肉RNA的受体有着6.19分钟的平均运动时间。
与对照比较，从运动锻炼的动物中提取的RNA增强了受体动物的运动耐力。这些初步的数据说明通过体内应用RNA可以将运动诱导的肌肉增强作用转移给未接受过实验的(naive)肌肉。这可以提供一种有价值的各种肌肉退行性疾病的治疗方法或一种提高疾病、衰老或年龄相关性病态中的肌肉量的新方法。此外，该技术在农业上也是有价值的。
应理解上面仅仅通过实施例的方式描述了本发明，在本发明的范围和精神之内可以进行修饰。
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