以颜色为基础的生化和免疫分析中的光谱测量.pdf

本发明提供一种在一些分析物的生化或免疫试验中对生物材料样品的分析方法，所述的方法包括处理样品使其显示与样品中分析物的量相关的颜色。在本发明中测量至少一种选自所显颜色的色彩角、色度、饱和度和光亮度的规定颜色特性，如此测定的结果能确定分析物在样品中存在与否或者其浓度。特别适用于通过对肺粘液、喉粘液、子宫颈粘液或精液的分析来检测癌或癌症前期的异常。

权利要求书
1.  一种测定患者皮肤胆固醇含量的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
在患者的皮肤表面上施加与皮肤胆固醇选择性结合的试剂；
让已与皮肤胆固醇结合的试剂进行显色化学反应，形成有色复合物；和
对所生成的有色复合物进行分光光度计分析，从而读取表征皮肤胆固醇含量的色彩角或色度的值。

2.  如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的选择性结合于皮肤胆固醇的试剂选自：
(i)甾类糖苷，含有作为糖苷配基的呋甾醇或螺旋甾醇系列的环戊烷菲烷片段，和在线性或支链结构上含有3-10个单糖残基的寡糖片段作为糖苷配基，
(ii)三萜烯糖苷，含有作为糖苷配基的α或β-香树醇基、羽扇烷、荷烷、杜马烷、林诺斯特烷或厚洛斯特烷系列，和在支链或线性结构中含有糖残基的低聚肽，和
(iii)能分辨地与胆固醇形成复合化合物的疏水蛋白质，
(iv)蛋白质毒素，能分辨地与胆固醇形成复合化合物，和
(v)多烯抗生素，能分辨地与胆固醇形成复合化合物，和
(vi)其底物是胆固醇且对胆固醇有高亲和力的酶，
其中，先用目测剂然后再用指示剂处理皮肤表面上所述的结合剂，形成所述的有色复合物。

3.  如权利要求2所述的方法，其特征在于，顺序用桥接剂、目测剂和指示剂处理皮肤表面上所述的胆固醇结合剂，从而形成所述的有色复合物。

4.  如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的胆固醇结合剂是毛地黄皂苷。

5.  如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，所述的目测剂是过氧化物酶，所述的指示剂含有过氧化氢、N，N-二乙基-对-亚环己二烯基硫酸酯及适当的稳定剂。

6.  一种测定人类患者皮肤胆固醇含量的整套器物，其特征在于，所述的整套器物包括：
检测剂源，能结合患者皮肤胆固醇与其在皮肤上形成复合物；
目测剂源，能与检测剂结合的复合物结合而形成光学改变的复合物；
显色源和将显色剂加到光学改变复合物上的装置使其显色；和
容纳并将所述的光学改变的复合物提供到便携式反射分光光度计上，从而测定表征所显示颜色的色彩角或色度。

7.  如权利要求6所述的整套器物，其特征在于，所述的容纳并将所述的光学改变复合物提供给分光光度计的装置包括：呈皮肤粘性带形式的容器，带有至少一个孔，让所述孔中所含的试剂穿透从而与患者的皮肤接触。

说明书以颜色为基础的生化和免疫分析中的光谱测量
本发明专利申请是国际申请号为PCT/CA 00/00918、国际申请日为2000年8月4日、进入中国国家阶段的申请号为00813497.9、名称为“以颜色为基础的生化和免疫分析中的光谱测量”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及颜色为基础的生化和免疫分析及试验，其中将分析或试验样品进行颜色特性具体是色彩角和/或色度的光谱测量。已经证明使用这种测量的分析可用于广范围的药物试验和筛选流程和诊断方法中产生定量或半定量的结果。
背景技术
如下详细所述，许多诊断试验依赖于目检和对颜色的评估，该颜色是用产生颜色(与分析物即试验的具体化合物(如胆固醇)或样品中存在的指示疾病(如癌症)的特异性分子标记物的量正相关)的试剂处理生物材料样品而产生的。
需要目测及对颜色变化评估的试验很方便且通常适宜用来初步主观评估靶化合物或疾病标记物的存在，但它们基本上不是定量的。
我惊讶地发现，用反射分光光度法测定色彩角和/或色度以及相关的特性，能得到至少半定量测定的分析结果。从一种或多种分析样品颜色的规定特性的这种测量可以得到许多关于是否存在进行性疾病(如癌症)以及这些疾病发展阶段的有价值信息。
以颜色为基础的癌症试验
自美国专利5,162,202知道，检查人类患者的直肠粘液，可用来检测直肠癌和大肠癌。在滤膜上收集粘液。用半乳糖氧化酶在磷酸盐缓冲剂中的溶液浸泡来预处理纤维质滤膜，然后冷冻干燥。使用时润湿此纤维质滤膜，然后将此纤维质滤膜与载有粘液样品的滤膜接触1-2小时。然后清洗此载有粘液的滤膜，与碱性品红反应15分钟，清洗并干燥。品红的脱色表明粘液中有癌性前癌性条件的碳水化合物标记物的存在。这种试验费时而繁重，而且灵敏度不高，因此可能会得到错误的阴性结果。
Shamsuddin的美国专利5,348,860(1994年9月20日)公开了一种改进的直肠粘液试验。在该方法中，收集粘液样品，将其固定于一滤膜上，并用半乳糖氧化酶处理，使样品中的任何邻位半乳糖部分氧化成邻位醛部分。这种氧化转变可以用Schiff试剂来目测。这是一种更快速的方法。用这种方法试验为阴性的样品可以用过碘酸进一步氧化，然后再用Schiff试剂目测，以降低得到错误阴性结果的可能性。
已知的粘液试验一直存在的问题是需要对着色结果进行目测和评估。虽然这种检验足以作为初步主观评估癌症标记物的存在与否，它依旧仅是定性的。这种检验无法给出关于标记物(所发现的，而且如果存在，本可以指示出癌症的发展状况)的量和浓度的可靠定量信息。另外，培养样品的培养基通常是纤维质膜(如滤纸)，其本身可能含有参与显色反应的化合物。这就产生了会使试验结果的解释复杂化的“背景”，从而降低了试验的灵敏度。这就需要对试验结果解释非常有经验的技术人员。
以颜色为基础的对胆固醇含量的分析
已经稳固地认识到了患者高血清胆固醇含量与发生动脉粥样硬化的倾向和以后冠心病发作、中风和PVD发作的增加有关系，因此需要经常监测患者的胆固醇含量。通常，用提取的血液样品来确定胆固醇含量。还用提取的血液样品进行许多其它的临床试验，但这些试验中的大部分需要进行试验的时间间隔比胆固醇分析长。由于用于胆固醇分析的血液收集流程的侵入性，使许多患者不愿接受按需进行的频繁的胆固醇监测。因此需要一种非侵入性的胆固醇试验。
估计皮肤中含有约11％体总胆固醇，主要是来自表皮类固醇和由血管扩散出来的胆固醇。已经假设皮肤胆固醇的含量可能比血清胆固醇的量更能准确反映动脉粥样硬化的程度。
Nikitin，YP，Gordenko，I.A.，Dolgov，A.V.和Filimonova，T.A.，“皮肤中的胆固醇含量及其与健康人和缺血性心脏病患者血清中脂质系数的相关性”，Cardiology 1987 II，NO.10，第48-51页，及其它文献显示了患者动脉壁中的胆固醇含量和皮肤中的胆固醇含量间有密切的相关性。这表明有可能研究出皮肤试验来测定患者的胆固醇含量。Nikitin等人描述的方法包括体外切除和分析皮肤样品，这种方法对临床应用而言是不切实际的。
Lopukhin等人的美国专利5,489,510和5,587,295描述了一种非侵入性诊断方法，该方法是在患者的皮肤上进行的，能指示皮肤胆固醇含量。这些专利所述的方法中，以亲和-酶促化合物的形式提供试剂(它们在本性上是双功能的)。这些双功能化合物A-B包含结合剂A，它能与皮肤上的胆固醇分辨性地形成稳定的复合物，从而可以使整个双功能化合物具有对胆固醇的亲和力(如毛地黄皂苷)；还包含目测剂B，例如酶如过氧化物酶，它可以检测与皮肤胆固醇结合的双功能化合物。在进行该试验时，结合剂A和目测剂B的复合物，可能还加上用来提高试验灵敏度的桥接剂C，即双功能共轭物A-C-B，可以置于患者手掌的皮肤上。桥接剂C是合适的高分子量的多功能化合物如多糖或蛋白质，其作用是将目测剂和结合剂隔开从而将胆固醇-结合剂反应的立体位阻最小化。在确保复合物结合于皮肤的胆固醇的适当培养时间过后，用清水充分清洗该手掌部位除去未结合的试剂。然后用指示剂D处理该结合的部位，与目测剂B反应来显色。胆固醇的含量越高，双功能化合物与皮肤结合的程度也越大，从而显色的程度也越高。
基于上述Lopukhin等人专利的胆固醇试验已经在商业上研究成功并已进入商业实践。它包括提供含有试剂和比色卡或读数计的整套器物。小瓶含有大部分试剂，除去保护性盖子后，使用者将其置于手掌上的试验部位。培养后，使用者涂上指示剂并在比色卡旁或用读数计目测所发生的颜色变化。
这种试验的一个缺陷是需要目测颜色的变化。虽然这种试验很方便，可以由无经验的人如患者进行，但对得到的颜色变化的目测是主观的且基本不能定量。这种试验可以给出胆固醇含量和潜在疾病问题的有价值的指示，但不是医生通常所需的定量测定类型的方法。这种方法易受背景(即皮肤)的特性和颜色的影响。
发明内容
本发明的一般目的是提供一种测定和测量以颜色为基础的生化或免疫分析结果的新方法，其不依赖于主观目测。本发明另一个更具体的目的是提供一种可定量测量生物样品中靶化合物量的方法，而该样品已经历过生化或免疫分析产生了与所述靶化合物正相关的颜色。
本发明的另一目的是提供用于癌症诊断中的对体分泌物、液体、和半固体的新型试验方法及其使用的整套器物。
本发明的另一目的是提供一种试验直肠粘液和其它分泌物、液体和半固体(包括粪便)和它们混合物的新方法及其使用的整套器物，这种方法能克服或至少明显减少一个或多个上述缺陷。在以下的说明书中，术语“结肠所含的半固体”指粘液、粪便和从患者直肠或结肠得到的其它液体或半固体和它们的混合物，可用作本发明方法中的可分析材料。
本发明的另一目的是提供用于胆固醇的非侵入性新型诊断方法。
本发明的另一且更具体的目的是提供能得到至少半定量结果的胆固醇试验方法。
为了克服基于对颜色变化目测要求的已有技术的论断试验的缺点，本发明在其很广的方面使用分光光度计可测定的某些具体参数，但这些参数不是本发明先前使用的。检测并分析这些比色参数，可以提供灵敏度和特异性都很高的分析和诊断。在各种波长测量分析或试验中所显的颜色，并测量色彩角和/或色度提供是否存在靶化合物、疾病状况或其它状况的有价值信息，这就是以颜色为基础的分析或试验的目标。在有些情况下，有关的颜色特性如明亮度或饱和度的测量可以进一步提高试验或分析的灵敏度。
在本发明的另一方面，提供一种诊断患者身体分泌的液体或半固体样品的方法，以便找出分泌这些物质的组织或器官异常的证据，所述的方法包括自患者采集液态或半固态分泌物样品，将至少一部分样品置于通常为白色的底质上，在底质上染色该样品，让其显色，用分光光度计测定显色样品的规定颜色特性，并按所得到的具体颜色特性的值将样品鉴别成正常或异常。
在本发明的另一方面，提供一种分析患者液态或半固态分泌物样品的系统，测量样品中显现的具体颜色特性来诊断患者是否存在异常，这些颜色特征选自色彩角、色度或饱和度以及光亮度，所述的系统包括：
白色的非纤维质底质，带有多孔“绉纹”的表面，用来放置显色过程中的样品；
半乳糖氧化酶源，用于将半乳糖氧化酶置于底质表面上对其上的样品进行选择性酶促氧化；
Schiff试剂源，用于将Schiff试剂加到底质上氧化的样品，进行可分析物的显色；
将已显色的样品置于便携式反射分光光度计的装置中，所述的反射分光光度计能够测量和记录选自所述底质上染色样品的色彩角、色度或饱和度以及明亮度这些具体的颜色特性。
在本发明的又一方面，提供一种诊断接触于直肠结肠的半固态样品的方法，以提供患者异常的证据，所述的方法包括自患者采集接触于结肠的半固态样品，将至少一部分样品置于白色底质上，用半乳糖氧化酶将底质上的样品染色，再用Schiff试剂让染色的样品显色，用分光光度计测量显色样品的颜色特性，并按所得到的具体颜色特性的值将样品鉴定为正常和异常。
在本发明的另一方面，提供分析患者液态或半固态分泌物样品的整套器物，来诊断患者是否存在直肠异常，所述的整套器物包括：
通常为白色的非纤维素底质，用来接受样品；
半乳糖氧化酶源；
Schiff试剂源；
便携式反射分光光度计，它能够测量和记录选自所述底质上染色样品的色彩角、色度或饱和度以及光亮度的具体颜色特性。
本发明的另一方面提供一种试验方法，将液态或半固态试剂置于患者的皮肤上，来使其与皮肤胆固醇结合，然后令该试剂显色，显示颜色的程度与皮肤中的胆固醇的量直接相关。用比色方法而不是目测来分析显色的液态或半固态试剂来测量显色的程度，从而至少可以半定量地获得胆固醇含量。所选的比色参数如色彩角或色泽，它们是独立于色彩密度、光强度或光亮度(L)的，只是衡量色泽的。这就基本消除了皮肤背景颜色所引入的不确定性，因此可以在患者皮肤表面进行这种试验。仪器比色(分光光度)分析能得到至少半定量的客观数据，显示患者的胆固醇含量。
本发明的另一方面，提供一种测量患者皮肤胆固醇含量的方法，所述的方法包括：
在患者皮肤上施加能选择性结合皮肤胆固醇的试剂；
让所形成的结合皮肤胆固醇的试剂进行显色化学反应，形成有色复合物；
将如此形成的有色复合物进行分光光度分析，读取有色复合物颜色的预定特性。
本发明的另一方面提供一种用于测量患者皮肤胆固醇含量的整套器物，所述的整套器物包含：
能与患者皮肤胆固醇结合，在皮肤上形成结合物的检测剂的源；
能与检测剂-结合剂的结合物反应形成光学改变的复合物的目试验剂的源；
显色剂的源和将显色剂加到光学改变的复合物上使其显色的装置；
容纳并提供所述光学改变的复合物到便携式反射分光光度计上的装置，用以测定选自色彩角、色度或饱和度的颜色特性。
附图说明
在以下本发明的优选实施例的叙述中，其涉及上述关于测量患者皮肤胆固醇含量的方法和整套器物的部分，将参考附图。附图中：
图1是本发明用于测量患者皮肤胆固醇含量的试验带的示意图；
图2是本发明用于测量皮肤胆固醇含量的分光光度读数计在打开状态的示意图；
图3是与图2类似的图，但分光光度计处于关闭状态；
图4是图2和图3所示分光光度计底座的详图。
具体实施方式
如上所述，申请人基本的发明即是使用比色测量具体是以颜色为基础的分析的色度和/或色彩角的测量，可以以许多方式和实例获得应用。以下将详细描述本发明的这两个方面和一些优选实施例，以各个标题分开。
适用于本发明所有方面的分光光度计是便携式，以反射为基础的，当分光光度计的入射光从染色样品反射回到仪器的接受器时，可以进行颜色特性(如色彩角、光亮度和色度或饱和度)精确的测量。这种仪器是可以购得的。合适仪器的一个优选例子是X-Rite，Grand Falls，Michigan，U.S.A.的“CA22型分光光度计”。其所附的合适软件可以与计算机相连，给出测试的染色样品色彩角的精确读数。该分光光度计接受大约400-700nm波长范围，即大部分可见光光谱的反射，适宜的间隔约为20nm。
已知可以以色彩角来定义和表示颜色。“色彩角”概念的定义和讨论可参见标准教科书，如Fred W.Billmeyer和Max Saltzman的“彩色技术原理”，John Wileyand Sons出版(具体参见其第1和第2章)，本文参考结合于此。“色彩”是样品与其光亮度或光强度无关的颜色或色泽，一种颜色或色泽的“色彩角”定义为其在可见光完整光谱的标准三维椭圆连续谱的用角坐标表示的反射波长。可见光(颜色)的连续谱表示在从0到360°角度范围的标度上。将在反射分光光度计上读取的角度值转化成线性形式，得到用于本发明方法中的转化的“色彩角”。
(i)癌症试验
在本发明中惊讶地发现，通过测量从适当人体组织或器官的液态或半固态分泌物显色的色彩角或上述其它规定的颜色特性，可以确定广泛范围的病症的存在与否包括肠的病症、肺的病症、子宫病症等。可用直肠粘液反应和光谱光度分析来诊断结肠癌。因此，患直肠癌的人给出的直肠粘液样品在所述的染色和显色后，其色彩角数值比正常肠所得到的高。因此可用染色样品的色彩角或其它规定的颜色特性来区分有肠的癌症病变和没有该病变的情况。具体说，已发现癌症病变样品的色彩角通常在375-425°范围，这是临床样品测定的顶点四分位数。另外，由于试验结果是用便携式分光光度计分析的，因此无需技术人员来读取试验结果。
用类似的方法，可以诊断肺癌和肺癌前症状，是将肺粘液或痰液进行类似的显色和分光光度分析。对宫颈粘液进行这种试验可以诊断子宫颈的癌和癌前症状。也可类似地分析精囊分泌物如精液，以分析生殖器官如睾丸的癌症。还可类似地分析喉道粘液，以检测和诊断喉癌。可以用已知的方法获得喉道和肺部的粘液，如支气管窥镜或细支气管肺泡冲洗的办法。乳头吸出物是可以用于以本发明方法类似地试验乳腺癌的体液。
本发明优选实施例的另一显著方面是使用多孔玻璃纤维膜，可在其上将样品氧化并将其显色。这种玻璃纤维材料基本没有产生染色的残余物，因此进行酶促氧化时它没有会参与随后显色反应的残余物。因此，有效地消除了可能混淆或干扰诊断试验的背景显色。另外，这种膜的颜色是基本纯白的，从而进一步降低了读取结果时的背景“干扰”。
用于本发明的玻璃纤维膜的另一特性是其表面空隙度，因此其上的粘液样品可更好地铺展，从而能露出样品中附加的碳水化合标记物来参与氧化和显色反应，从而改善试验方法的灵敏度。
用于本发明的玻璃纤维多孔膜的另一优选例子是可以从Whatman Inc.Larboratroy Division购得的商品名为“Whatman 934-AH玻璃纤维膜”的硼硅玻璃膜介质，在高的流量下它具有高的负载能力和高的持留效率。推荐将其用于细胞收获和液体闪烁计数方法。然而这仅是一个例子，还可用其它基本纯白的玻璃纤维、无碳水化合物、表面空隙率适合于接触结肠的半固态样品进行表面铺展的底质。
在用本发明一个优选方面的具体步骤中，用于结肠癌症检测和用酶促氧化反应进行显色时，先从患者采取要试验的样品。在操作者带手套的手指上涂敷润滑剂。将手指插入患者的直肠，旋转360°从而得到接触结肠的代表性半固体(如直肠粘液)样品。从直肠取出手指后，将样品涂在白色滤膜的表面上，用适当的覆盖物、保护物和鉴定物安置在直肠粘液试验卡上，分析该卡。
为了分析，从直肠粘液试验卡上除去背衬，在试验卡上加入50μl标准半乳糖氧化酶溶液。用标准方法培养10分钟。然后将此卡浸泡在两次蒸馏的水中30秒，然后加上1ml Schiff试剂3分钟。随后将此卡转移到水中漂洗，共4次每次10分钟，进行显色。然后干燥此卡，用上述类型的便携式分光光度计读取色彩角确定得分。低于预定值(对直肠粘液样品而言为350)的色彩角分数表明是正常健康的组织源。超过预定值(对直肠粘液而言为370)的分数表明为癌组织源。
而给出中间值的样品可以还进行全面的氧化来辅助最终的诊断。基于已知在任何样品中碳水化合标记物上仅有一部分邻位羟基能被酶促氧化以显色，因此可以再用一种强氧化剂(如高碘酸盐)氧化所有残留下的基团，然后再次显色并试验。如果与最初结果的差异很大，则表明样品应被分为它具有较高的初值。如果差异极小或没有明显差异，则可安全地将样品分为具有较低分数。
由这种方法从分光光度计简单读取出的色彩角的值，操作者无需主观上的判断分析就可以确定从其采集样品的人的结肠是否健康正常或患有癌，与已有的诊断方法相比，大大降低了错误阳性和错误阴性的几率。采取相同的标准采样、染色、培养和显色步骤，且使用相同的标准试剂，在诊断实验室中在最小干扰和经济花费的条件下可以采用本发明的这种新方法。
人体器官和组织的其它粘液样品也可采取基本上类似的试验方法。按照本发明，半乳糖氧化酶的酶促氧化及随后用Schiff试剂的反应是优选的显色反应步骤。但本发明并非仅限于此。可以采用任何能给出癌症显色特征的选择性反应的步骤。例如，将样品与Schiff试剂直接反应(不用酶促反应步骤)也可以用于显色。在所有情况下，用分光光度分析所显示的颜色来测量颜色的色泽或色彩的客观参数例色彩角就构成了本发明的用途。已经发现上述的这些颜色参数是与各种癌的存在和发展状况相关联的。
(ii)非侵入性胆固醇试验
在本发明这个方面的优选过程中使用液态或半固态生化试剂，显示决定于患者皮肤胆固醇含量的颜色，并对所显示的颜色进行分光光度分析。在本发明中，所显示颜色的精确本性和特征(如色彩角所表征的)与形成的结合的复合物的量相关，从而与皮肤的胆固醇含量相关。这种颜色特性的测量是客观的且至少是半定量的。因此，其读数与背景皮肤的颜色无关，即背景皮肤颜色对其没有明显程度的影响。
通常以恰当的顺序在患者皮肤表面上加上所有试剂，在皮肤表面上显色，然后趁显色复合物留在皮肤上时，用光谱光度计对其检查，这是很不方便的。整个测试可以在5分钟内完成。所选用于试验的皮肤区域应是基本没有皮脂腺的区域，因为这种皮脂腺会提供含胆固醇的血清，而这将干扰试验结果。脚底和手掌是这种合适的皮肤区域，而对本发明的试验而言手掌最方便。
整套器物包括容纳和提供显色复合物用便携式分光光度计进行分析的装置。合适的是能与皮肤粘着的带子形式的容器，它带有一个或多个通孔，从而使孔中所含的试剂可以与患者的皮肤接触。容器的设计主要由分光光度计的物理特性决定。也可以不采用试剂用的容器，可以在试剂中加有触变剂，从而将试剂的铺展限制于皮肤表面上并防止试验试剂与对照试剂(施加在临近的皮肤部位)相混合。
本发明还适用于其它以颜色为基础的试验和分析，本发明的另一方面为非侵入性的胆固醇试验，结合于皮肤胆固醇的有色复合物的色彩角与皮肤胆固醇含量是相关联的。
可用于本发明的合适化学试剂是在上述Lopukhin等人专利中所述的那些试剂，其内容全部参考结合于此。这些试剂精确的选择并非是本发明必需或限制性的特征，只要这些试剂互相联合使用时可以因与皮肤胆固醇的结合而显色。本文所用的术语“结合”指是会使一种化学物质与另一种化学物质连接的广泛含义的化学反应吸附以及特异性亲和类型“啮合“的相互作用(通常在生化系统中发生)。
因此，从能分辨地与皮肤上的游离胆固醇形成稳定复合物的物质来选择结合剂A，从而可以得到与胆固醇有亲和力的完整双功能化合物。当它直接或通过桥接剂C化学结合于目测剂B之前或之后，它可与胆固醇直接反应形成稳定的复合物。
适用于胆固醇结合剂A的化合物，其代表性种类包括：
甾类糖苷，它含有呋甾醇(furostanole)或螺旋甾醇(spirostanole)系列的环戊烷菲烷片段作为糖苷配基和包括具有线性或支链结构的3-10个单糖残基的寡糖片段(Hinta P.H.“螺旋甾烷和呋甾烷系列甾类糖苷的结构和生物活性”，HIshinev，Stinza，1987第142页)，其中特别优选的例子是funcoside C、D、E、F、G和I、薯蓣素、rocoside C、D和E、lanotigonine、毛地黄皂苷和番茄苷；
三萜烯糖苷，它含有α或β-(脂檀醇)香树醇基(amyryl)、羽扇烷、荷烷、杜马烷(dommarane)、林诺斯特烷(linostane)或厚洛斯特烷(holostane)系列的糖苷配基和含有支链或线性结构糖残基的低聚肽(Deknnosidze G.E.，ChirvaV.Y.，Sergienko T.V.，Uvarova N.L.“三萜烯糖苷的研究”，Tbilisi，Mesni ereba，1982)；
能分辨地与胆固醇形成复合化合物的疏水蛋白质(Himov A.N.，Titova G.V.，Kozhenikov H.A.，Biochemister，1982，第47卷，No.2，第226-232页)；Himov A.N.，Hozhevinkov H.A.，Klyueva N.N.等人，Voprosy Meal.，Hhimii，1984，第30卷，No.3，第86-90页；Titova G.V.，Hilyueva N.N.，Hozhevnikov H.A.等人，Biochemistry，1980，第45卷，No.1，第51-55页)；
蛋白质毒素，它能分辨地与胆固醇形成复合化合物。它们能从细菌、海洋微生物、昆虫和蛇提取(Dalin M.V.，Fi sh N.G.“微生物的蛋白质毒素”，Moscow，Medicine，1980)；或
多烯抗生素，它能分辨地与胆固醇形成复合化合物(I.J.Katzenstein，A.M.Spielvogel，A.W.Norman，J.Antibiot.，27，12，1974，第943-951页；Jong Shan Shyng，Wang His-Hua，Clin.J.Microbiol.，1976，9，(1-2)，第19-30页；Readio Josphine D.等人，Biochim.Biophys.Acta，1982，685(2)，第219-24页)；
高亲和力的酶，其底物是胆固醇且对胆固醇有高亲和力。本文将上述所有出版物开物都纳入作为参考结合之。
胆固醇结合剂A的最佳选择是毛地黄皂苷。
目测剂B通常是酶，因为酶/底物反应产生的颜色变化是特别有用的。这些酶的优选例子包括乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖氧化酶、葡糖淀粉酶、β-D-半乳糖苷酶、过氧化物酶、碱性或酸性磷酸酶、α-胰凝乳蛋白酶和焦磷酸酶。过氧化物酶是最佳选择，如辣根过氧化物酶(HRP)。
用桥接剂C能增强本方法的效果，并有利于所需A-C-B复合物的产生，而颜色是由该复合物显色的，同时还保持着试剂A和B的官能团活性。最优选的A-C-B复合物是那些用甾类糖苷(含有呋甾醇或螺旋甾醇系列的环戊烷菲烷片段作为糖苷配基和包括具有线性或支链结构的2-10个单糖残基的寡糖片段如毛地黄皂苷)作为胆固醇亲和结合剂A的A-C-B复合物。当将毛地黄皂苷选作胆固醇结合剂A且将HRP选作目测剂时，理想的是用桥接剂C，因为HRP的分子量相对较大，当它直接结合于毛地黄皂苷时可能会在空间上阻碍毛地黄皂苷与皮肤胆固醇的反应。作为用于此目的的桥接剂C，较佳地是用高分子量的多功能化合物。它们的使用可以对最终复合物中试剂A和C的比例有很大范围的控制。这种高分子量多功能桥接剂C可以是各种多糖、蛋白质或合成的聚合物，即任何含有伯胺、羧基、羟基、醛、卤酸酐、混合的酸酐、亚氨醚、叠氮、羟基、顺丁烯二酰亚胺、异氰酸酯或环氧官能团的合适的高分子量化合物。丙烯酸或马来酸或马来酐和N-乙烯吡咯烷酮是最优选的高分子量多功能桥接剂C。也可以用不对称的低分子量双功能化合物，如溴化氰(bromocyan)、三氯三嗪或2-氨基-4，6-二氯-3-三嗪。
指示剂D通常含有所用酶的底物作为目测剂B，以及使酶和其底物的反应能看见所需的其它化合物。当用过氧化物酶作为目测剂B时，这些指示剂D的优选例子是含有过氧化氢、N，N-二乙基-对-亚环己二烯基硫酸酯的化合物连同适当稳定剂的试剂。指示剂D和目测剂B选自本领域已知的与所选酶在反应中能产生颜色的化合物。
为了进行本发明的试验提供一种整套器物。该整套器物包括在适当密封包装(如带有滴管的管形瓶或小瓶)中的所需的试剂，一个容器或其它容纳装置，在其中可进行在患者皮肤上的显色反应，同时防止试剂铺展的面积过大，并由其可将所显现的颜色给测定记录规定的颜色特性如色彩角的一个装置如便携式反射光谱光度计用于检验和测定。该容器合适地是个胶粘带，上面有一个或多个通孔，起初备有一保护背衬以保护胶粘剂。较佳地，该容器具有至少2个或3个孔，这样就可以在测试实验的同时进行对照实验。为了便于测试实验和对照实验的正确进行，这些孔制成眼睛看起来可以清楚地互相区别，例如形状上不同。
附图中的图1显示了用于本发明的一种容器，它是长方形试验带10的形状。此带包括一个泡沫材料垫10、有一层由可剥离片14暂时保护的与皮肤相容的胶粘剂层12。用于试验的圆形截面的第一个中心孔16，穿透泡沫材料垫交穿透胶粘剂层12。用于阳性对照目的的菱形截面的第二个孔18和用于阴性对照目的的方形截面的第三个孔，也类似地在带10的泡沫材料垫中提供，这两个孔分别在中心孔16的两边。这些孔不同的形状便于操作者进行试验，因为操作者可以正确选择用于其目的的孔。
较佳是在患者手掌的皮肤上进行试验。将以胶粘带形式的试剂用的容器暂时粘在皮肤上，让孔的开口底部与皮肤接触。将试剂加入孔中，在孔内显色，然后无需将带从皮肤上移开就可用分光光度计读取颜色。为此，使用构成本发明另一方面的特别设计的分光光度计。这种分光光度计将读数输入计算机进行分析。这种分光光度计设计成确保在试验孔上的正确对准。
因此，本发明的一方面提供了适用于将试验样品的颜色反射读数的信号输入计算机的分光光度计，这种分光光度计包括：壳体；所述壳体中的发光器；所述壳体的开孔的下部，发光器可通过该孔将投射过去；在所述下部的下表面的凹部，它适于装在施加于患者皮肤表面的带孔的试验带上，从而让分光光度计对准于所述带孔试验带的孔中的试验样品。较佳地，分光光度计的下部与壳体绞接，从而当该下部打开时它能方便地与试验带正确配合，然后将该下部关闭到光度计的壳体上进行测量。较佳地，在光度计的绞接的下部和壳体上都装有触点起开关作用。从而当下部与壳体闭合时分光光度计的灯打开。
图2、3和4示意地显示了这种分光光度计。它具有壳体22，并装有与适当编程的计算机连接的电接线(没有显示)，用于分析读数的结果。下部24在26处铰接于壳体22上。下部24在28处开有孔。有个槽子30在下部24的底表面宽度上延伸，并从最下表面朝上凸出。此槽子在下部的一边闭合。槽子30的宽度设计得很精确，能紧密配合于图4中的试验带10。当读数时，将试验带的一端与槽子的闭合端配合好，再加试验带10在槽子30宽度中的配合，可以使试验孔16精确地对准从读数器的壳体22通过孔28发出的光束。分光光度计带有合适的检测装置，用于从孔16中的样品接受反射信号，并将信号传送给计算机进行分析和读数。壳体22和下部24分别具有触点32、34，当下部24关闭在壳体22上时，这两个触点就用作开关，打开用于测定的光。
现在描述一个具体的试验步骤，用的是本发明诊断实际试验的一个说明性的(非限制性的)例子。
整套器物包括：装有检测溶液(毛地黄皂苷辣根过氧化物酶轭合物的水性缓冲液，含有作为防腐剂的0.01％溴硝基二恶烷和甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolone)，1.5ml)的滴管瓶，带有用于区分的有色盖子(绿色)；装有作为阳性对照的含有更高浓度检试验剂、和防腐剂(小于0.01％溴硝基二恶烷和甲基异噻唑啉酮)的类似缓冲液的滴管瓶，带有便于区分的有色盖子(红色)；装有与与皮肤胆固醇结合的检测剂和PC试剂产生蓝绿色的试剂(4.0ml 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺、TMD、过氧化氢溶液，含5％N，N-二甲基甲酰胺作为防腐剂)溶液的指示剂滴管瓶，带有便于区分的盖子(蓝色)；如图1所示的泡沫材料垫，在其上可以加上试剂；酒精海绵和使用说明书。上述那些化学试剂可以在2-8℃的冰箱内稳定长限保存。整套器物也可包括与适当编程计算机相连的图2和3所示的分光光度计和与此分光光度计一起使用的校准板。该整套器物一般并不包括分光光度计，除非最初出售时带有，同一分光光度计可以与后来“再加料”的那些滴管瓶再次使用。
起初，将校准板插入分光光度计的夹紧装置中，将其闭上，此时校准板获得照明将校准读数送回到分光光度计和计算机中。最终接受到已成功完成校准的信号。
用肥皂和清水清洗并冲洗患者的手，然后充分干燥。再用酒精海绵彻底清洁患者手掌的外表部分，要用足力气确保彻底清洁。让手干燥后，揭去试验带10上的可剥离保护片14，然后将其粘附于患者手掌已清洗干净的皮肤区域。患者将手置于桌上放置的一片纸巾上，用力下压确保该试验带牢固地粘于手掌上。
然后，将各试剂加入试验带泡沫材料垫的各相应试剂孔中。一滴(42μl)检测液加入圆形截面的试验孔16，一滴阳性对照液加入菱形截面的孔18中，但此时在第三个方形孔20中不加液体。让所加入的两种溶液培养1分钟，此时让患者保持其接受试验的手不动。然后让患者反转手掌，将泡沫材料垫压向纸巾，从孔中除去液体。肉眼检查确保垫子和试验孔已完全干燥。然后患者将手搁在一平表面上休息，手掌朝上。
随后，将一滴指示剂加到所有三个孔包括前面未使用的方形截面孔中，让反应进行2分钟，同时让患者保持手不动。此后立即将读数器22在试验孔16上放置到位，闭合并读取试验孔中所显示的颜色的读数，传送到分光光度计并用计算机分析，得到色彩角的值。
对阳性对照孔18和阴性对照孔20进行肉眼观察。如果阴性对照孔中的液体是无色的，而阳性对照孔的液体是有色的，则试验有效。对阳性对照显示的颜色不进行定量测量。这个颜色是从高浓度试剂溶液显示的，皮肤上有极少量的胆固醇就显示的颜色，只是表明试剂的有效性等(用于对照目的)。
弃去试验带上残留的液体，从手掌上除去试验带，然后用酒精海绵清洗手掌。
用于本发明的分光光度计应能测量试验样品反射光的吸光度并将其合适计算转化为色彩角的值。当颜色是从上述辣根过氧化物酶-TMD反应显现时，在450nm的吸光度即A450nm是一种合适的测量值。已知实验获得的450nm时吸光度光学密度与色彩角的下列关系式：
h°(度)＝490.45×A450nm+57.124
上述关系式是如下确定的，测定一系列稀释的反应样品在450nm时的光学密度，并测量相同样品的色彩角，将结果绘制成回归曲线获得了此关系式。也可用相同的方法对所选定的其它显色试验(用不同的酶-底物对，显示出不同的颜色)计算出类似的关系，以便将记录的光学密度转化成色彩角的测量值。
虽然以上已描述了优选的诊断试验及其进行所用的整套器物，本领域技术人员可以理解利用这种基于本文所公开的色彩角或色度的测量可以进行许多以颜色为基础的试验和分析，例如：
(i)对固相免疫试验结果的定量，如斑点印迹、免疫色谱试验和流通试验(将样品加到膜上，该膜的背后有一芯吸装置，然后捕获住靶分析物，并加入标记检测剂如酶或金标记的抗体)给以标记；
(ii)对用有色小珠进行的以微细颗粒为基础的分析的定量
(iii)染色凝胶分析中替代密度测定法；
(iv)对Western印迹分析的定量。
本发明的方法提供了一种简单的方法来定量这些结果，并从分析采集到补充信息，从而可对试验结果使用统计分析的更加完善方法。
对本发明的各种变化不能视为在本发明的精神和范围之外，且所有对本领域技术人员而言是显然的改进都在本发明的权利要求范围之内。