土贝母苷甲用于制备抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物 【发明背景】
肿瘤的生长、侵袭和转移是恶性肿瘤最重要的恶性行为和治疗的主要障碍，控制恶性肿瘤的生长、侵袭和转移成为恶性肿瘤患者预后的关键措施。然而，迄今为止还没有一种理想的抗恶性肿瘤侵袭和转移的药物可资临床应用。
土贝母苷甲是从中药土贝母中分离出来的一种单体有效成分，分子式为C63H98O29，分子量为1318，化学结构如图1。土贝母苷甲水溶性好、稳定性强，它的制备工艺较简单易行，得率也高(约1.8％)。
土贝母苷甲的提取方法参见文献(王永清、于立坚等：陕西新医药，10：55，1981；Kong F，et al.Structural study of tubeimoside 1，a constituent of tu-bei-mu.TetrahedronLett，1986；27：5765-9)。
发明概要
本发明涉及土贝母苷甲用于制备抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物的用途。
本发明涉及土贝母苷甲作为抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物，该药物包括土贝母苷甲及可药用的载体。
本发明涉及如权利要求1所定义的药物的制备方法，该药物包括土贝母苷甲和/或可药用的载体。
土贝母苷甲可与任何可药用的载体混合或溶解，如经皮肤、粘膜、胃肠内和胃肠外给药的可药用载体。该药物以常规药用制剂的形式使用，如固体形式的片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂、扁囊剂、拴剂等，或半固体形式的油膏、软膏等，或液体形式的针剂、悬浮剂、糖浆剂、乳剂、搽剂等。该药物中使用可药用的赋形剂和添加剂，这些可药用的赋形剂和添加剂包括无毒的可相容的填料、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、润滑剂、矫味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂、稳定剂等。如乳糖、柠檬酸、硬脂酸、硬脂酸镁石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、可可脂、乙二醇、葡萄糖、盐酸普鲁卡因、盐酸利多卡因、抗坏血酸等。该药物可按各种制剂的常规工艺制备。
本发明涉及土贝母苷甲作为预防恶性肿瘤生长、侵袭和转移的药物，可作为食品添加剂、化妆品添加剂加入到食品或化妆品中。
本发明涉及土贝母苷甲作为治疗恶性肿瘤生长、侵袭和转移的药物，可用于各种实体形肿瘤，如食道癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、鼻烟癌、口腔癌、唇癌、皮肤癌、膀胱癌、绒毛膜上皮癌、腮腺瘤、淋巴瘤、骨瘤、黑色素瘤和各种颅内肿瘤等。所制成的各种口服药物中土贝母苷甲的含量为每日每kg体重大约0.001-100mg，优选约0.01-50mg，更优约0.05-30mg，最佳约0.1-10mg。每日分2-4次服用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。所制成的注射用药物，可供肌肉注射或静脉点滴，其中土贝母苷甲的含量为每日每kg体重0.001-50mg，优选约0.01-25mg/kg，更优约0.05-15mg，最佳约0.1-3mg。每日分1-3次使用，10-30天为一疗程，一般用药3-6个疗程，每个疗程间隔10-30天。然而，精确的剂量应由医生确定，主要取决于病人的年龄、体重、病情、反应等。
下面列举实验研究的结果，作为土贝母苷甲可用于制备抗肿瘤生长、侵袭和转移的药物的证据。
1、土贝母苷甲对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞侵袭行为的影响
材料和方法
药物和试剂：土贝母苷甲自土贝母块茎分离纯化。定量称取土贝母苷甲，无菌蒸馏水溶解，过滤除菌，-20℃冰箱保存备用。超级无支原体新生牛血清、RPMI-1640培养基、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、MTT[3-(4，5-dimethylthiazol-z-yl)-2，5-diphenyl-tetrazoliumbromide]、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸胺、Triton-100、苏木精、伊红、优凯特、十二烷基磺酸钠、胰酶、Transwell室(直径6.5cm、孔径8μm)、聚碳酸酯膜(直径13cm、孔径8μm)、胶原，等。
细胞株：人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞，该细胞株由北京医科大学病理系建立的高转移肺巨细胞癌系中进一步单克隆化所得。
细胞培养：PGCL3细胞培养于含10％小牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。
土贝母苷甲对PGCL3细胞生长的影响：采用MTT法检测土贝母苷甲对PGCL3细胞生长的影响。取培养细胞制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种90μl(含1.0×104细胞)。培养过夜后，分别加入不同浓度的土贝母苷甲溶液10μl，使终浓度分别为5.0、10.0、15.0、20.0μmol·L-1。对照组则加入相同体积的培养液，每一浓度设3个平行孔。充分混匀后，继续培养24、48、72h。每孔加入MTT(5g/L)20μl，继续培养4～6h。每孔加入三联液(10％SDS、5％异丁醇、0.012mol/L HCL，W/V/V))100μl。放置过夜后，用DG-5031型酶标仪在570nm波长处测量OD值，调零孔则用培养液代替细胞悬液。以Bliss法计算半数抑制浓度。
细胞侵袭实验：Transwell室为无聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯滤膜分隔开的两个小室，朝上室方向的上膜面已铺好Matrigel，朝下室方向的下膜面涂纤维粘连蛋白10μl(约2μg)，置超净台上风干后放入已加入600μl含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液的下小室，37℃孵育1h，取出备用。将经1.25、2.50、5.00μmol/L土贝母苷甲处理24h的PGCL3细胞用胰酶消化，重悬于含0.1％BSA的RPMI-1640培养液中，调整细胞浓度至1.0×109/L，加100μl细胞悬液于Transwell室的上小室。对照组为未经土贝母苷甲处理的PGCL3细胞，每组设3个平行试验。37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3min，苏木精染色3min，水洗。伊红染色10s，水洗。用棉签擦掉上膜面的Matrigel及未穿过膜的细胞，优凯特胶封片。在400倍光学显微镜下随机选择5个视野，计数每个视野穿过膜的细胞数。计算平均值，以穿过膜的细胞数的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。土贝母苷甲对PGCL3细胞侵袭的抑制率按下式计算。侵袭抑制率＝(1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)×100％。
细胞运动实验：除滤膜上不涂纤维粘连蛋白外，其余方法步骤同细胞侵袭实验。
细胞与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的粘附实验：分别将5.0μg纤维粘连蛋白、层粘连蛋白铺于96孔板，置超净台上过夜风干。用50μl含2％BSA的RPMI-1640培养液封闭1h后，PBS洗两次，待用。将经1.25、2.50、5.00μmol·L-1土贝母苷甲处理24h的PGCL3细胞用胰酶消化，重悬于含0.1％BSA的无血清RPMI-1640培养液中，调整细胞浓度至8×108·L-1，每孔加100μl细胞悬液，对照组为未经土贝母苷甲处理过的PGCL3细胞，每一浓度设3个平行孔。37℃孵育1h，吸去培养液，每孔加入200μl 37℃预热的PBS轻轻吹打10次，重复3次，洗去未粘附细胞。每孔加入100μl无血清RPMI-1640溶解的MTT(0.1mg)，调零孔则无细胞，于培养箱中继续培养4h后，每孔加入100μl三联液，放置过夜。用DG-5031型酶标仪在570nm波长处测量OD值，细胞粘附率按下式计算。细胞粘附率＝实验组OD值/对照组OD值×100％。
胶原酶分泌量测定：将对数生长期PGCL3细胞悬液400μl(含8×104细胞)接种于24孔板，37℃、5％CO2饱和湿度培养过夜。弃去培养液上清，PBS洗2次，换无血清培养液培养1h。弃去培养液，PBS洗2次，加无血清培养液400μl，同时加不同浓度的土贝母苷甲40μl，使其终浓度分别为1.25、2.50、5.00μmol·L-1，对照组仅加入400μl的无血清RPMI-1640，继续培养24h。收集上清，200r·min-1低速离心去除细胞碎片，用胰酶消化细胞并计活细胞数。按照活细胞数取相应体积的上清与等体积的上样缓冲液混合。分离胶中加入终浓度为1g·L-1的明胶，常规SDS-PAGE电泳，约3～4h后电泳完毕，剥胶。用蒸馏水漂洗数次后，移入100ml 2.5％Triton-100溶液中，在摇床上低速摇动洗脱SDS。半小时后换新的100ml Triton-100溶液，继续洗脱1小时。蒸馏水漂洗后加100ml明胶酶缓冲液(50mol·L-1 Tris·HCl，10mmol·L-1 CaCl2，200mmol·L-1 NaCl，1μmol·L-1 ZnCl2，pH7.5)，在37℃恒温摇床中温育12～16h。取出凝胶，蒸馏水漂洗后放入染色液中(0.1％考马斯亮蓝R-250)染色4h。漂洗后在脱色液中(甲醇∶水∶冰醋酸＝45∶45∶10)脱色1～2h，至对照出现清晰的负染酶带。
胶原酶活性测定：将4ml的PGCL3细胞悬液接种于50ml培养瓶内(含8×105细胞)，37℃、5％CO2恒温培养24h。无血清RPMI-1640洗3遍，加入4ml无血清培养液继续培养24h。收集培养液上清，200r·min-1低速离心去除细胞碎片。取50μl上清与10μl的上样缓冲液相混合，按上文相同条件电泳。剥离胶前先把胶切成一定宽度的条状，同上法洗脱后放入已加入明胶酶缓冲液的杂交袋中。同时分别加入不同浓度的土贝母苷甲200μl，使其终浓度分别为1.25、2.50、5.00μmol·L-1。密封杂交袋，做好标记，在37℃恒温摇床中温育96h。其余步骤同上。
统计分析：数据采用均数±标准误()表示，结果用Student′s t test进行统计分析。
当P＜0.05时，视为差异显著；有统计意义；当P＜0.01时，视为差异非常显著。
结果
土贝母苷甲对人高转移巨细胞肺癌PGCL3生长的抑制作用：土贝母苷甲明显抑制PGCL3细胞的生长，且与剂量相关。土贝母苷甲作用PGCL3细胞24、48、72h的IC50值分别为15.70、14.20、13.32μmol/L(图2)。
土贝母苷甲对PGCL3细胞侵袭基底膜能力的影响：Matrigel经重建后能在聚碳酸酯膜表面形成类似天然基底膜的结构，细胞侵袭穿过重组基底膜的能力反应该细胞的侵袭能力。土贝母苷甲1.25、2.50、5.00μmol/L作用24h，PGCL3细胞侵袭重组基底膜的能力明显受到抑制，抑制率分别为28.7％、41.0％、57.5％(表1)。
表1土贝母苷甲对PGCL3细胞侵袭能力的影响
组别 用药量 (终浓度μmol/L) 侵袭细胞数 抑制率 (％)P 对照 土贝母苷甲 土贝母苷甲 土贝母苷甲 - 1.25 2.5 5.0 108.8±6.0 77.6±4.7 64.2±5.1 46.2±5.7 - 28.7 41.0 57.5-＜0.01＜0.01＜0.01
土贝母苷甲对PGCL3细胞运动能力的影响：土贝母苷甲1.25、2.50、5.00μmol/L作用PGCL3细胞24h，PGCL3细胞的运动能力受到抑制，且呈剂量依赖性，抑制率分别为21.6％、35.2％、53.7％(表2)。
表2土贝母苷甲对PGCL3细胞运动能力的影响
组别 用药量 (终浓度μmol/L) 运动细胞数 抑制率 (％) P 对照 土贝母苷甲 土贝母苷甲 土贝母苷甲 - 1.25 2.5 5.0 99.0±6.3 77.6±6.9a 64.2±5.1a 45.8±5.7a - 21.6 35.2 53.7 - ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01
土贝母苷甲对PGCL3细胞与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白粘附能力的影响：1.25、2.50、5.00μmol/L的土贝母苷甲作用PGCL3细胞24h，降低PGCL3细胞对基质成分纤维粘连蛋白、层粘连蛋白的粘附能力(图3)。
土贝母苷甲对PGCL3细胞IV型胶原酶的分泌量及酶活性的影响：IV型胶原酶中，MMP-2(72000IV型胶原酶/明胶酶A)、MMP-9(92000IV型胶原酶/明胶酶B)与转移的关系成为基质金属蛋白酶研究的热点。PGCL3细胞主要分泌MMP-2，而MMP-9的分泌量很少。土贝母苷甲1.25、2.50、5.00μmol/L作用PGCL3细胞24h，能够抑制细胞分泌IV型胶原酶(MMP-2)，并呈一定的剂量依赖关系(图4)。土贝母苷甲1.25、2.50、5.00μmol/L作用IV型胶原酶(MMP-2)96h，能够降低IV型胶原酶的活性，并呈一定的剂量依赖关系(图5)。2、土贝母苷甲对裸BALB/c小鼠B16黑色素瘤(B16)实验转移和Lewis肺癌(LLC)自发转移的影响
材料和方法
药物和试剂：土贝母苷甲，同上。环磷酰胺，超级无支原体新生牛血清，RPMI-1640培养基，Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培养基，兔多克隆抗CD44v6、抗ErbB-2、抗nm23-H1抗体，免疫组化超敏S-P试剂盒。
实验动物：成年BALB/c裸小鼠，雌雄各半，饲养于SPF级动物实验室。饲料、饮水、笼具和操作器材及其他用品均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。
细胞株：小鼠B16黑色素瘤细胞株，培养于含10％小牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度细胞培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。B16对淋巴细胞敏感，小鼠静脉内移植后主要形成肺转移灶。LLC细胞株培养于含5％小牛血清，10％胎牛血清，100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养液中，37℃、5％CO2饱和湿度细胞培养箱培养，取对数生长期细胞用于实验。LLC为自发性肺未分化上皮样癌，移植于动物皮下、肌肉、爪垫等特定部位，移植瘤增殖后开始侵袭周围正常组织和血管，继之癌细胞进入血液循环形成血行播散，粘附于靶器官并穿出血管，癌细胞增殖成为克隆，最终形成转移瘤。上述过程基本类似于人类肿瘤从生长到转移瘤形成所经历的一系列步骤。
B16实验转移模型：取对数生长期B16黑色素瘤细胞，调整浓度至1×106细胞/ml，按每只0.2ml(2×105细胞)接种于裸鼠尾静脉。随机分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，每组8只小鼠，雌雄各半。接种当日即开始给药。实验组每日每只裸鼠腹腔注射不同剂量土贝母苷甲(2，3mg/kg·d)，连续14天；阴性对照组同时腹腔注射同体积无菌生理盐水；阳性对照组每周每只裸鼠腹腔注射环磷酰胺50mg/kg·w，共注射2次。接种后第15天，称体重，摘除眼球放血、颈椎脱位法牺牲动物。取出肺，称重并计转移结节数。按下列公式分别计算肿瘤转移抑制率。
肿瘤转移抑制率(％)＝(阴性对照组平均转移结节数-给药组平均转移结节数)/阴性对照组平均转移结节数×100％
LLC自发转移模型：取对数生长期Lewis肺癌细胞，调整浓度至2×107细胞/ml，按每只0.2ml(4×106细胞)接种于裸鼠右侧背部皮下。分组方式同B16实验转移模型。接种后第7天开始给药。给药方式同B16实验转移模型。接种后第21天，称体重，摘除眼球放血、颈椎脱位法牺牲动物，剥离肿瘤衡重。10％中性福尔马林固定肿瘤组织用于病理和免疫组化检查。取出肝，称重并计转移结节数。按下列公式计算土贝母苷甲肿瘤生长抑制率，肿瘤转移抑制率。
肿瘤生长抑制率(％)＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％
免疫组化实验检测肿瘤转移基因表达水平：将分离出的LLC组织用10％中性福尔马林固定，常规脱水，制备成石蜡包埋组织块。将石蜡标本4μm连续切片。参考文献作免疫组化实验。CD44v6阳性标准：阳性显色为棕黄色，以胞膜着色为主，少量胞浆着色；ErbB-2阳性标准：阳性显色为棕黄色，以胞膜或胞浆着色为主；nm23-H1阳性标准：阳性显色为棕黄色，主要位于胞浆。以胞膜或胞浆淡黄至褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞，着淡黄色为弱阳性(+)，棕黄色为阳性(++)，棕褐色为强阳性(+++)，无着色为阴性(-)。
结果
土贝母苷甲对接种B16、LLC细胞裸小鼠生长的影响：实验组与对照组相比，裸鼠的体重无明显改变(表3)。
表3土贝母苷甲对接种B16、LLC裸小鼠生长的影响
土贝母苷甲对B16细胞实验性肺转移的影响：BALB/c裸小鼠尾静脉接种B16细胞发生肺转移。土贝母苷甲(2，3mg/kg·d×14)对B16细胞肺转移的抑制率分别为68.8％和82.8％(表4，图6)。
表4土贝母苷甲对B16细胞实验性肺转移的影响
土贝母苷甲对接种LLC裸小鼠原发瘤生长的影响：BALB/c裸小鼠接种LLC细胞7天后，可见皮下长出原发瘤。土贝母苷甲可明显抑制原发瘤的生长，并呈一定的剂量依赖关系(表5)。HE染色病理检查显示，对照组瘤组织边界不清，细胞密集排列，异型性明显，而苷甲组瘤组织中心及边缘见大片状或灶性坏死(图7)。
表5土贝母苷甲对接种LLC裸小鼠原发瘤生长的影响
土贝母苷甲对LLC自发性肝转移的影响：BALB/c裸鼠背部皮下接种LLC细胞，自发性发生肝转移。在肝表面可见清晰的转移灶(图8)。土贝母苷甲可明显抑制LLC细胞的肝转移，抑制率分别为46.3％和52.0％(表6)。
表6土贝母苷甲对LLC细胞自发性转移的抑制作用
土贝母苷甲对转移基因表达的影响：免疫组化检测的结果显示，在Lewis肺癌细胞中，CD44v6和ErbB-2表达于细胞膜与细胞浆，nm23主要表达于细胞浆；给小鼠注射土贝母苷甲后，Lewis肺癌细胞中促转移基因CD44v6和ErbB-2的表达下调(图9，10)，抑转移基因nm23-H1的表达上调(图11)。
实施例下面的配方举例说明本发明的剂型。
实施例1：片剂
NO 组分 用量
mg/片 mg/片
1 土贝母苷甲 50 100
2 乳糖USP 122 123
3 玉米淀粉(呈10％的纯水浆状物)，食品级 30 40
4 玉米淀粉，食品级 95 130
5 硬脂酸镁 3 7
合计 300 400
制造方法
在适当的混合机中混合第1项和第2项组分15分钟，第3组分与混合物粒化。如果需要，通过一个初筛研磨潮湿的颗粒，并使之干燥。如果需要，将干燥的颗粒过筛，并与第4项混合10-15分钟。加入第5项混合1-3分钟。在适当的压片机中将混合物压成适当的尺寸和重量。
实施例2：胶囊剂
NO 组分 用量
mg/粒 mg/粒
1 土贝母苷甲 50 100
2 乳糖USP 106 120
3 玉米淀粉，食品级 40 73
4 硬脂酸镁NF 4 7
合计 200 300
制造方法
将第1、2和第3项在适当的混合机中混合10-15分钟，加入第4项混合1-3分钟。在适当的包囊机上将该混合物装入适当的胶囊中。
实施例3：注射液
土贝母苷甲 10g或50g
葡萄糖 490g或450g
注射用水 加至10000ml
实施例4：栓剂
以生产发明产品10000粒为例所用的原料及其配比为：
土贝母苷甲 300g或600g
吐温80 800g或800g
可可豆酯(或半合成脂肪酸苷油) 加至10000g
制造方法
混合：按本实施例的配比称取土贝母苷甲、吐温80和可可豆酯(或半合成脂肪酸苷油)，将可可豆酯(或半合成脂肪酸苷油)放入不锈钢锅水浴加热至大部分溶化，停止加热，然后分别加入吐温80和土贝母苷甲，用不锈钢搅拌机搅拌至混合均匀，便得到本发明的混合药物。
润滑剂的配制： 用软肥皂和苷油各一份与5倍的80％医用酒精充分混合搅拌均匀，制成润滑剂。
成型：在栓模上涂上已配制的润滑剂。将本发明的混合药物倒入栓模中至溢出模口，让其自然冷却。待完全凝固后，用刀切去溢出部分。然后开启模具，将栓剂从模具中取出。
无菌包装：将所制备的拴剂进行质量检查，每粒重量应为1g，含土贝母苷甲30mg或60mg。
检查合格后包装，钴60灭菌。
【附图说明】
图1：土贝母苷甲的化学结构式
图2：土贝母苷甲对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞生长的影响
图中横坐标代表土贝母苷甲的作用时间，纵坐标代表OD值。PGCL3细胞在不同浓度的土贝母苷甲作用不同时间(h)后，采用MTT实验检测细胞的增殖能力，图中的数据是三个平行实验的均值。
图3：土贝母苷甲对PGCL3细胞与纤维粘连蛋白、层粘连蛋白粘附能力的影响
图中横坐标代表纤维粘连蛋白、层粘连蛋白，纵坐标代表粘附率(％)。
图4：土贝母苷甲对PGCL3细胞分泌IV型胶原酶的能力的影响
A：对照；B：土贝母苷甲(1.25μmol/L，24h)。
C：土贝母苷甲(2.50μmol/L，24h)；D：土贝母苷甲(5.00μmol/L，24h)
图5：土贝母苷甲对IV型胶原酶活性的影响
A：对照；B：土贝母苷甲(1.25μmol/L，24h)。
C：土贝母苷甲(2.50μmol/L，24h)；D：土贝母苷甲(5.00μmol/L，24h)。
图6：土贝母苷甲对B16黑色素瘤细胞肺转移的抑制作用(图中灰白点为转移灶).
A：对照；B：土贝母苷甲。
图7：土贝母苷甲诱导的Lewis肺癌瘤组织的病理变化(HE染色，×200)
A：对照；B：土贝母苷甲。
图8：土贝母苷甲对Lewis肺癌细胞自发性肝转移的抑制作用
A：对照；B：土贝母苷甲(图中灰白点为转移灶)。
图9：土贝母苷甲对Lewis肺癌细胞CD44v6表达的影响
A：对照(+++)；B：土贝母苷甲(-)。
图10：土贝母苷甲对Lewis肺癌细胞ErbB-2表达的影响
A：对照(++)；B：土贝母苷甲(-)。
图11：土贝母苷甲对Lewis肺癌细胞nm23-H1表达的影响(SP，×200)
A：对照(-)；B：土贝母苷甲(++)。