一种拟南芥的水培方法.pdf

本发明公开了一种拟南芥的水培方法，包括以下步骤：1)、种子的萌发：将经春化处理后的拟南芥所得的种子在培养室内培养成幼苗；2)、制作培养工具；3)、移苗：在培养室内，将步骤1)所得的幼苗放入步骤2)所得的培养管内，使幼苗的根部接触湿润的蛭石；培育8～9天后，得小苗；4)、育苗：先去除培养管内的蛭石，在作为水培装置的水槽内放置1/4浓度的霍格兰营养液；再将培养管竖直放入位于培养室内的水槽中，使小苗的根系浸没在霍格兰营养液中。采用本发明的方法培育拟南芥，能有效提高其存活率，且操作简便。

权利要求书
1.  一种拟南芥的水培方法，其特征是包括以下步骤：
1)、种子的萌发：
将经春化处理后的拟南芥所得的种子在培养室内培养成幼苗，直至根部长至0.9～1.1cm；
2)、制作培养工具：
选用顶部和底部均设有开口的管子作为培养管，将培养管固定在盛有1/4浓度的霍格兰营养液的容器内；然后将灭菌处理后的蛭石放入培养管内，蛭石的放置高度占培养管高度的80％～100％，蛭石吸收营养液后成湿润的蛭石，培养管的高度为2.6～3.0cm，培养管的内径为9～11mm；
3)、移苗：
在培养室内，将步骤1)所得的幼苗放入步骤2)所得的培养管内，使幼苗的根部接触湿润的蛭石；培育8～9天后，得小苗；所述培养室内温度为20～28℃、湿度为60％～80％，光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，光源的开启时间为10-12h；
4)、育苗：
先去除培养管内的蛭石，在作为水培装置的水槽内放置1/4浓度的霍格兰营养液；再将上述培养管竖直放入位于培养室内的水槽中，使小苗的根系浸没在霍格兰营养液中；培养室内温度为20～28℃、湿度为60％～80％，光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，光源的开启时间为10-12h。

2.  根据权利要求1所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤4)中每周更换1次霍格兰营养液。

3.  根据权利要求2所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤4)中向霍格兰营养液内灌输氧气。

4.  根据权利要求3所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤2)中培养管的底部开口与容器的底部相距0.8～1.2cm；

5.  根据权利要求4所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤2)中的容器为96孔离心管盒。

6.  根据权利要求5所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤2)中的培养管由eppendorf管改装而成。

7.  根据权利要求6所述的拟南芥的水培方法，其特征是：所述步骤3)中，用尖头镊子将步骤1)所得的幼苗放入步骤2)所得的培养管内。

说明书一种拟南芥的水培方法
技术领域
本发明涉及一种培育拟南芥的方法，特别是拟南芥的水培方法。
背景技术
拟南芥是国际上第一个完成全部基因组序列测定的高等植物，利用其作为模式植物进行植物功能基因组学的研究在世界各国开展得如火如荼。利用拟南芥开展植物学研究，能为挖掘植物体内多种代谢途径的信息、发现并克隆重要基因提供基础试验材料。目前，拟南芥的培养方式主要有泥炭和蛭石的混合营养介质与营养液培养两种方式。其中，水培是实验室常见的一种栽培方式；但国内外报道的水培方法存在着一定的不足，其最大缺点是易染菌或出现干枯现象。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能有效提高拟南芥的存活率、且操作简便的拟南芥的水培方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种拟南芥的水培方法，包括以下步骤：
1)、种子的萌发：
将经春化处理后的拟南芥所得的种子在培养室内培养成幼苗，直至根部长至0.9～1.1cm；
2)、制作培养工具：
选用顶部和底部均设有开口的管子作为培养管，将培养管固定在盛有1/4浓度的霍格兰营养液的容器内；然后将灭菌处理后的蛭石放入培养管内，蛭石的放置高度占培养管高度的80％～100％，蛭石吸收营养液后成湿润的蛭石，培养管的高度为2.6～3.0cm，培养管的内径为9～11mm；
3)、移苗：
在培养室内，将步骤1)所得的幼苗放入步骤2)所得的培养管内，使幼苗的根部接触湿润的蛭石；培育8～9天后，得小苗；所述培养室内温度为20～28℃、湿度为60％～80％；光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，光源的开启时间为10-12h；
4)、育苗：
先去除培养管内的蛭石，在作为水培装置的水槽内放置1/4浓度的霍格兰营养液；再将上述培养管竖直放入位于培养室内的水槽中，使小苗的根系浸没在霍格兰营养液中；培养室内温度为20～28℃、湿度为60％～80％，光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，光源的开启时间为10-12h。
作为本发明的拟南芥的水培方法的改进：步骤4)中，每周更换1次霍格兰营养液，并向霍格兰营养液内灌输氧气；步骤2)中，培养管的底部开口与容器的底部相距0.8～1.2cm，容器选用96孔离心管盒，培养管由eppendorf管改装而成；步骤3)中，用尖头镊子将步骤1)所得的幼苗放入步骤2)所得的培养管内。
在本发明中，1/4浓度的霍格兰营养液指的是：将常规的霍格兰营养液与水以1∶3的体积比混合后所形成的。步骤4)的育苗时间视实际的具体要求而定；即当拟南芥的根系达到实际所需的长度时，就可结束育苗。
本发明拟南芥的水培方法，在步骤2)中，将培养管放置于96孔离心管盒中，适用于大批量育苗试验，且有利于保持适宜拟南芥幼苗成活的湿度。采用eppendorf管改装成培养管能反复使用，因此可降低生产成本；且eppendorf管为实验室常见耗材，价格低廉。在步骤3)中，将拟南芥幼苗放在装有蛭石的培养管中培养，可以降低该过程的染菌率；在本发明中，染菌率几乎为零。移苗全过程未直接接触手，因而也不会产生人为操作不当(如有些方法采用海绵包裹移栽)引起的幼苗死亡。只要能在培养皿里面正常发芽的幼苗，按本发明的方法栽培均能存活，因而大大提高存活率。
本发明的拟南芥的水培方法，具有操作简便、成本低廉、不易染菌、成活率极高的优点。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是本发明的步骤3)移苗状态剖视示意图；
图2是本发明的步骤4)育苗状态剖视示意图。
具体实施方式
一种拟南芥的水培方法，依次进行以下步骤：
1)、种子的萌发：
用75％的酒精消毒经春化处理后的拟南芥所得种子10min，后用无菌水洗涤3次，随后播种于位于培养皿中的灭菌MS培养基上(去蔗糖的MS培养基，见表1)，调节pH至5.7，琼脂糖浓度为0.55％。播种完毕后，用Parafilm封口膜将培养皿包裹一圈，以免水分蒸发并避免染菌。随后于培养室内放置4～5天，根长约1cm时即成幼苗4，可用于移苗。培养条件为温度20～28℃，用室内加湿器加湿至湿度为60％～80％；光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，光源的开启时间(即所设置的白天时间)为8h，种子距离光源25～30cm(也可用市售的拟南芥专用培养架)。
表1去蔗糖MS培养基配方
    成分    含量(mg/L)    成分    含量(mg/L)    NH4    1650    KI    0.83    K NO3    1900    H3BO3    6.2    CaCl2    440    MnSO4·7H2O    22.3    MgSO4·7H2O    370    ZnSO4·2H2O    8.6    KH2PO4    170    Na2MoO4·2H2O    0.25    FeSO4·7H2O    27.8    CuSO4·5H2O    0.025    Na2EDTA·2H2O    37.3    CoCl2·6H2O    0.025
2)、制作培养工具：
选用1.5ml的eppendorf管(市售)进行改造，从而制成所需的培养管1，具体如下：
用剪刀将1.5ml的eppendorf管盖剪下去除；并在距离底部7mm处进行剪切，去除下段部分；从而形成一个高为2.8cm、管径(内径)为10mm，外径为12mm，底部开口直径约为8mm的培养管1(如图1所示)。
选用96孔离心管盒2(市售)作为容器，96孔离心管盒2长17cm、宽9.5cm、每个孔径均为12mm。
将每个改造好的eppendorf管(即培养管1)依次放入96孔离心管盒2的每孔内，此时eppendorf管的底部开口与96孔离心管盒2的底部相距1.0cm左右。往96孔离心管盒2加入1/4浓度的霍格兰营养液(pH 5.8-6.0)，液面高度为2cm，即保证eppendorf管的底部被霍格兰营养液浸没。
随后，在每个eppendorf管中加入事先灭菌处理的蛭石(市售)，蛭石可选用颗粒大小约为1mm3/粒，蛭石的放置高度与eppendorf管面持平。蛭石吸水能力非常快速，一旦位于eppendorf管底部的蛭石接触96孔离心管盒2中的营养液，整管蛭石便即保持湿润状态，从而形成湿润的蛭石。依靠蛭石相互之间的摩擦力和蛭石吸水后快速膨胀的特性，蛭石不会从eppendorf管底部开口处漏出。
3)、移苗：
在培养室内，用尖头镊子将步骤1)所得的培养皿中的幼苗4轻轻夹出，放入步骤2)所得的eppendorf管(即培养管1)内，使幼苗4的根部接触湿润的蛭石即可(不需要把幼苗4的根埋到蛭石里)。每个eppendorf管中，移苗一株。
移苗完毕后，轻轻罩上96孔离心管盒2的盖子，以防止盒内的营养液过度蒸发；当然，此时培养室中的空气仍然可以自由进入盒内。1～2天后，逐渐移开盖子，使苗能慢慢适应培养室的环境；再培育7天左右得小苗5。培养室内温度为20～28 ℃、湿度为60％～80％，光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，设置白天时间为10-12h，植株距离光源25～30cm。
观察所得的小苗5，可发现其根系向下发展，已经超出eppendorf管的长度；并且其叶片的覆盖面已经超过eppendorf管的管口(即eppendorf管的顶部开口)。此时96孔离心管盒2的空间，相对于拟南芥的进一步生长显得狭小，因此需要将拟南芥转入栽培系统，以利于其进一步生长来满足不同的科研需求。
4)、育苗：
A、去除蛭石：
由于许多科研过程的对象是拟南芥的根系，因此需要把蛭石洗脱得到单一根系。此时，将eppendorf管从96孔离心管盒2中取出，先用牙签(头尖容易插入，且木质不会伤根)从eppendorf管的底部靠边顶进，再拔出牙签，使蛭石有所松动；接着用镊子夹住eppendorf管放入装有蒸馏水的烧杯中，然后使eppendorf管在水中上下摇晃，蛭石即从eppendorf管底部的开口处滑出。
上述去除蛭石的步骤应尽量在干净的室内进行。上述去除蛭石的方法，能保证植株根的完整性，因而植株不会因移苗而出现生长停滞；且此方法操作简单。
此时，由于拟南芥小苗5的叶面已经部分伸展，小苗5的地上部分会匍匐在eppendorf管上。此时若将eppendorf管竖直放至水中，小苗5的根就会自由竖立于eppendorf管中央，起到了对小苗5的支撑作用。由于拟南芥的根系较小，eppendorf管内空间足够其生长，因而不会对植株产生负面影响。
B、制作水培装置：
可用PVC板加工成深度大于10cm的水槽3(有底无盖)作为水培装置，水槽3的长与宽可根据培育苗的数量多少而定。在水槽3的上面加盖一片略大于水槽3边框的塑料泡沫板6(厚度1-1.5cm)，在塑料泡沫板6上打孔径为12mm(正好是eppendorf管的外经)的圆孔，孔间距离为5-8cm。
C、正式育苗：
用水平尺调校水槽3的水平度，将上述去除蛭石后的带有拟南芥小苗5的eppendorf管(即培养管1)插入塑料泡沫板6圆孔中，刚好使eppendorf管口边缘凸出部分触到塑料泡沫板6的板面为宜。将1/4浓度的霍格兰营养液加入水槽3中，保持液面与水槽口持平，再将塑料泡沫板6盖在水槽3上，可使小苗5的根系都浸没在营养液中。
为了增加根系的供氧，可用金鱼缸通气泵供气。将气分成若干路，用长针头在相对于水槽3的不同位置处直接插入塑料泡沫板6即可将氧气通入营养液中。此种通气方式简便且供气均匀。营养液每周更换1次。
上述正式育苗过程在培养室内进行，培养室内温度为20～28℃、湿度为60％～80％。光源采用由白光和红光灯间隔组成的生物效应灯，设置白天时间为10-12h。植株距离光源25～30cm。
培养时间可根据实际对根系长度的要求而定，通常情况下培养2周后根系长度可达6-10cm(拟南芥品种间有些差异)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。