《一种新型肿瘤显像剂SUP99M/SUPTCHYNIC/EDDATMTP1的制备与应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种新型肿瘤显像剂SUP99M/SUPTCHYNIC/EDDATMTP1的制备与应用.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、10申请公布号CN104208727A43申请公布日20141217CN104208727A21申请号201310354068522申请日20130810A61K51/08200601A61K103/1020060171申请人深圳市奥尼克斯基因技术有限公司地址518057广东省深圳市高新区中区高新中一道生物孵化器大楼2201B72发明人马丁王世宣朱小华奚玲李飞54发明名称一种新型肿瘤显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1的制备与应用57摘要本发明公开了基于肿瘤靶向肽TMTP1与放射性核素99MTC的可靶向于高转移肿瘤原发灶及转移灶新型核医学肿瘤显像剂99MTCHYNIC/EDDATMT。
2、P1，它有TMTP1、谷氨酸、双功能螯合剂HYNIC、99MTC及共配体EDDA组成。99MTCHYNIC/EDDATMTP1标记方法为通过双功能螯合剂HYNIC连接多肽与放射性核素99MTC，使用C18反相柱纯化产物，纯化后多肽的标记效率达到99以上。99MTCHYNIC/EDDATMTP1能够对高转移肿瘤细胞高亲和，并能够被TMTP1竞争性阻断，而且其与细胞的亲和与浓度、时间相关。本发明显像剂在体内体外稳定性好。应用核医学SPECT其能够对小鼠皮下瘤模型及转移模型都能够显像。可作为高转移肿瘤原发灶及转移灶新型诊断剂。51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表1页附图4页19中华人民共和国。
3、国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表1页附图4页10申请公布号CN104208727ACN104208727A1/1页21一种新型靶向高转移肿瘤显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1的制备及应用，其特征是它是有TMTP1GCGNVVRQGC二硫键成环环肽、增加水溶性的谷氨酸LYS、双功能螯合剂HYNIC及共配体EDDA组成。2根据权利要求1所述的一种新型靶向高转移诊断剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1，其特征是TMTP1的N端连接谷氨酸的C端，谷氨酸的N端连接双功能螯合剂HYNIC苯环上的羧基，HYNIC的肼基螯合99MTC，EDDA作为共配体螯合99M。
4、TC，其标记方法为10UGHYNICTMTP120MG三羟甲基甲基甘氨酸TRICINE、10MG乙二胺二乙酸EDDA溶解在1ML02MPBSPH74、55MCINA99MTCO4溶解在1ML生理盐水中，20UL氯化亚锡1MG/ML混匀后95加热反应15分钟，自然冷却后用C18反相柱纯化，纯化方案如下5ML无水乙醇、5ML生理盐水、5ML空气、反应混合液、5ML生理盐水依次过柱，200UL70无水乙醇洗脱产物。3权利要求1所述的99MTCHYNIC/EDDATMTP1体外亲和性试验应用。4权利要求1所述的利用SPECT仪器显像99MTCHYNIC/EDDATMTP1对高转移肿瘤原发灶及转移灶的诊。
5、断应用。权利要求书CN104208727A1/5页3一种新型肿瘤显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1的制备与应用一、技术领域0001本发明涉及一种新型肿瘤靶向诊断分子显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1的标记制备及应用，其技术特征包括99MTCHYNIC/EDDATMTP1的标记制备、产物纯化及质量控制，TMTP1能够靶向识别高转移肿瘤原发灶及转移灶，将其标记放射性核素99MTC后应用单光子发射计算机断层成像术SPECT仪器能够对高转移肿瘤原发灶及转移灶进行分子显像。而且99MTCHYNIC/EDDATMTP1在体内能够很快的经过肾脏清除，安全性高。二、背景技术0002恶性。
6、肿瘤已成为威胁人类健康的首要疾病，2000年我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症，预计到2020年每年将有2000万起新的癌症病例，而癌症患者死亡人数将突破1000万人。现在实体肿瘤患者治疗方式仍以手术切除为主，辅以化疗、放疗和分子靶向治疗。而癌症患者的治疗关键是早发现、早干预。影像学检查CT/MR/PET/B超和实验室检查已经成为临床医生诊断早期肿瘤的依据，但是现有的诊断方法特异度及敏感度仍有不足之处，寻找一种特异的诊断方法依然是每一位科研工作者不懈追求的方向。0003TMTP1是利用细菌鞭毛肽库展示技术高转移前列腺癌细胞系PC3M1E8和不转移前列腺癌细胞系PC3M2B4进行四轮正负筛选。
7、，免疫荧光法体外验证特异地与PC3M1E8细胞亲和的细菌克隆获得重复性序列NVVRQ，我们对多肽序列进行改造增加其在体内的稳定性TMTP1GCGNVVRQGC二硫键成环。体内实验验证TMTP1对高转移肿瘤细胞有高亲和性而对低转移肿瘤细胞低亲和性。体内实验验证TMTP1能够靶向于高转移肿瘤的原发灶及微转移灶。我们实验室利用TMTP1的肿瘤的靶向性将其连接白喉毒素DT390TRITMTP1及NBDTMTP1TATNBD发现其能够携带DT390及NBT靶向地到达肿瘤部位，抑制肿瘤的生长及转移。0004分子诊断已成为许多恶性肿瘤靶向治疗及预后判断的主要指标，如乳腺癌HER2，ER和PGR2阳性的病人可。
8、以选择赫塞丁TRASTUZUMAB及雌激素受体拮抗剂等。肿瘤血管VEGFRECEPTOR如果表达阳性，可以选择贝伐单抗抑制血管生成。奥曲肽和RGD多肽是目前临床应用最经典的分子诊断及治疗的多肽。99MTCEDDA/HYNICTOC那能够很好的诊断神经分泌型肿瘤如胰腺癌、脑胶质瘤等，18FGALACTORGD能够对新生血管能力强的肿瘤进行诊断。000599MTC是核医学应用最广泛的放射性核素，达到80，而且半衰期只有6小时，射程短安全性高。所以我们选择将TMTP1标记放射性核素99MTC，期望寻找一种对高转移肿瘤原发灶及转移灶诊断的分子显像剂。三、发明内容0006基于以上高转移肿瘤原发灶及转移灶。
9、的诊断需求及技术背景，本发明将公开一种基于TMTP1标记放射性核素的化学结构式、标记方法和纯化方案，通过该标记方法及方案说明书CN104208727A2/5页4能够获得一种新型的核医学肿瘤靶向分子诊断显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1，利用此显像剂可以对高转移肿瘤原发灶及转移灶进行显像诊断。并可以指导临床应用TMTP1衍生的分子靶向治疗药物。0007本发明的技术方案是核医学肿瘤靶向显像剂99MTCHYNIC/EDDATMTP1该化合物有高转移肿瘤靶向肽TMTP1GCGNVVRQGC，双功能螯合剂HYNIC6肼基烟酸和共配体EDDA乙二胺N，N二乙酸组成。所述000899MTCHYN。
10、IC/EDDATMTP1标记方法为混合溶液10UGHYNICTMTP1、10MGEDDA、20MGTRICINE三羟甲基甲基甘氨酸1ML02MPBSPH70、55MCINA99MTCO4在1ML生理盐水中、20UL01NSNCL2在反应条件95中反应15MIN，自然冷却至室温。0009反相C18柱子常规脱盐纯化5ML无水乙醇激活C18柱子，5ML生理盐水，5ML空气依次匀速过柱子，反应混合液以2秒一滴的速度过柱子，5ML生理盐水，200UL70乙醇洗脱产物。0010其标记效率达99。0011本发明达到以下效果00121、将99MTC通过双功能螯合剂HYNIC稳定的标记TMTP1，99MTCHY。
11、NIC/EDDATMTP1标记效率达99。00132、在TMTP1N端连接谷氨酸增加其肿瘤显像的肿瘤与背景的比值，使显像更清晰。00143、选择EDDA作为共配体，使99MTCHYNIC/EDDATMTP1经过肾脏代谢，安全性高。00154、体内实验验证其能够对高转移肿瘤原发灶及转移灶能够清晰的显像。四附图说明0016图1、99MTCHYNIC/EDDATMTP1的结构式0017图2、放射性化学纯度ITLCSG检测0018图3、细胞亲和试验及竞争性结合试验0019图4、细胞亲和性时间曲线0020图5、皮下瘤SPECT显像及竞争性显像0021图6、卵巢癌肺转移模型SPECT显像及小动物活体实验0。
12、022图7、肿瘤模型体内分布试验五、具体实施方案00231、99MTCHYNIC/EDDATMTP1的制备0024HYINCEGCGNVVRQGC二硫键成环有公司常规合成。合成纯度980025标记方法10ULHYNICTMTP11UG/UL溶于水中002610MGEDDA002720MGTRICINE00281ML02MPBSPH749515MIN00291MLNA99MTCO455MCI003020ULSNCL21MG/ML溶于01NHCL0031自然冷却到室温说明书CN104208727A3/5页50032脱盐纯化方案纯化柱子反相C18柱，为了检验此纯化方案的可行性，设置对照组标记混合液中。
13、不加HYNICTMTP10033依次过柱溶液5ML无水乙醇、5ML生理盐水、5ML空气、反应混合液、5ML生理盐水。200UL70无水乙醇洗脱产物，洗脱溶液每一滴分别放于15ML的EP管，检测每一滴的放射性活度及放射性化学纯度。0034实验结果反应混合液实验组和对照组按照上述纯化方案纯化，实验组放射性活性检测84在70乙醇洗脱液中第一滴放射性活性低约占53，7428在第二滴第三滴，20在剩余的洗脱液中。对照组的放射性活性90以上在反应缓冲液及生理盐水滤液中，很少量的在70无水乙醇洗脱产物。此结果说明此纯化方案效果理想。00352、放射性化学纯度检测ITLCSG应用三种展开剂检测合成产物的放射性。
14、化学纯度0036，丙酮决定没有结合多肽游离99MTC的量RF100037，01M柠檬酸PH50决定99MTCCOLIGAND和游离99MTC的量RF100038，甲醇乙酸铵11V/V决定99MTCCOLLOIDRF0003999MTCHYNIC/EDDATMTP1在三种展开剂中的迁移率分别是00，00，0710，0040实验结果HYNICTMTP1标记效率99以上99MTCHYNIC/EDDATMTP1，游离99MTC、99MTCCOLIGAND、99MTCCOLLOID几乎为零。00413、体外体内稳定性试验0042PBS合成产物1MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1在1ML02M。
15、PBSPH74中放置6H，12H后检测其放射性化学纯度未见其放射性化学纯度改变。0043半胱氨酸1MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1加入1ML02M半胱氨酸PH7437孵育12H后放射性化学纯度检测0044血清将1MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1加入1ML小鼠血清中，37中孵育30MIN、60MIN、120MIN、240MIN后，取200UL加入3KD的柱子中12000RPM离心30MIN，将离心下来的液体进行放射性化学纯度分析，利用三种展开剂决定其在血清中的稳定性。0045体内稳定性试验给每只昆明白鼠注射1MCI的99MTCHYNIC/EDDATMTP1后分别在1H。
16、、2H、4H的尿液，加入3KD滤膜过滤柱12000RPM离心30MIN后检测其放射性化学纯度。0046实验结果99MTCHYNIC/EDDATMTP1在02MPBSPH74中放置6H，12H后仍然稳定。004799MTCHYNIC/EDDATMTP1在极性极大的半胱氨酸溶液中依然稳定004899MTCHYNIC/EDDATMTP100494、LOGP值0050取2ML25MMPBSPH74和2ML正辛醇室温100RPM震荡过夜，第二天停止震荡PBS和辛醇会分为上下层，取上层500UL和下层500UL混合后加入15UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1，设置两个副孔，剧烈震荡30MIN后。
17、，去上层100UL，下层100UL，用RCOUNTS检测上层和下层的R计数。0051实验结果上层即辛醇层分别为686、640、750，下层即25MMPBSPH74层分别为290528、279392、356978LOGPLOG上层/下层，LOGP264800260052此结果说明理论上99MTCHYNIC/EDDATMTP1主要经过肾脏代谢。说明书CN104208727A4/5页600535、细胞实验0054亲和实验细胞系选择宫颈癌细胞系C33A、卵巢癌细胞系L102、胃癌细胞系MNK45SCI等，分别用DMEM/1640培养基加10胎牛血清培养，待其状态良好时胰酶消化后用细胞计数板计数，将其传。
18、代至24孔板中，每空接种3105细胞，贴壁培养过夜。第二天将按上述标记纯化方法的1UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1混合150UL无血清培养基加入每孔中，设置两个副孔，37，5CO2孵育4H。0055孵育4H后取每孔上清至巴氏管中，并用冰冷的细胞用PBS洗两遍。然后加入500UL01MNAOH将细胞消化下来转移至一新巴氏管，用RCOUNTS计数。0056竞争性结合试验C33A细胞系接种于24孔板中3105/孔，贴壁培养过夜，第二天每孔加入1UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1混合150UL无血清培养基，每孔加入竞争性结合多肽GC10TMTPL，浓度设置如下，100UG、5。
19、0UG、25UG、125UG、625UG、3125UG/孔，设置三个副孔。0057亲和时间曲线1UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1加入MNK45SCI细胞，分别于30MIN、1H、2H、3H、4H、5H、6H终止结合。检测每个时间点的亲和百分比。0058亲和浓度依赖试验C33A细胞接种于24孔板中3105/孔，第二天每孔分别加入05UCI、LUCI、2UCI、4UCI、8UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1，检测其亲和百分比。0059实验结果99MTCHYNIC/EDDATMTP1能够特异的结合高转移肿瘤细胞系，并能被GC11竞争性结合。其与细胞的亲和性随着时间的增加而增。
20、加4H时达到最高亲和性。也于所加的99MTCHYNIC/EDDATMTP1浓度有关系，浓度越大，特异进入细胞的99MTCHYNIC/EDDATMTP1越多5UCI/孔00606、SPECT显像0061皮下瘤肿瘤模型的建立C33A、L102细胞用DMEM培养基加10FBS培养，MNK45SCI培养于1640培养基加10FBS中，胰酶消化约1MIN，10FBS培养基终止消化，吸管吹打下来将其转移至15MLEP管中，800RPM离心，弃上清，细胞用PBS洗一遍细胞沉淀，细胞计数板计数。BALB/CNUDE小鼠饲养于SPF动物房中，小鼠周龄约4周时右腋窝皮下接种1107/只C33A细胞、1106/只M。
21、NK45SCI细胞、5106/只L102细胞。约三周左右BALB/CNUDE小鼠右腋下长出约08CM的肿瘤。0062卵巢癌肺转移模型建立BALB/CSCID全免疫缺陷小鼠约4周左右，尾静脉注射5105/只L102慢病毒转染LUCIFERASE报告基因细胞，三周后腹腔注射50UL荧光素LUCIFERIN加50UL3戊巴比妥于BALB/CSCID小鼠中，20分钟后放入小动物活体成像仪中，生物素发光模式成像。确定有肺转移后转移模型建立成功。皮下瘤显像按照上述标记方法及纯化方法，将1MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1溶于200UL生理盐水中，通过尾静脉注射入BALB/CNUDE肿瘤模型。3。
22、戊巴比妥50UL腹腔麻醉，分别于30MIN、60MIN、120MIN、180MIN、240MIN及300MINSPECT显像0063竞争性结合实验200UGGC11混合1MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1溶于200UL生理盐水中，SPECT显像如上所述。0064卵巢癌肺转移显像将卵巢癌肺转移模型每只尾静脉注射05MCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1，腹腔注射50UL荧光素和50UL3戊巴比妥，20MIN后小动物活体成像，4H后SPECT显像。说明书CN104208727A5/5页70065实验结果显示99MTCHYNIC/EDDATMTP1能够特异的在动物模型的皮下瘤及转。
23、移灶显像，肾脏显影较明显，说明其经过肾脏代谢，肝脏显影不明显说明其经过肝脏代谢较少。00667、体内分布实验0067宫颈癌皮下瘤动物模型建立如上，待其肿瘤生长至约08CM时，进行体内分布实验。每只老鼠尾静脉注射20UCI99MTCHYNIC/EDDATMTP1，分别于30MIN、1H、2H、4H眼球取血，然后颈椎离断处死小鼠，解剖老鼠将其心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、肌肉和肿瘤取出，称量其重量，然后R计数仪测量其RCOUNTS。并计算各个组织ID/G0068实验结果2H时99MTCHYNIC/EDDATMTP1肿瘤的摄取ID/G值较其它组织摄取高。说明书CN104208727A1/1页80001序列表CN104208727A1/4页9图1说明书附图CN104208727A2/4页10图2图3说明书附图CN104208727A103/4页11图4图5说明书附图CN104208727A114/4页12图6图7说明书附图CN104208727A12。