使用自我保护寡核苷酸调节基因表达的组合物和方法 【发明背景】
【发明领域】
本发明一般地涉及自我保护多核苷酸，和使用它们调节基因表达和治疗疾病的方法。
相关技术的描述
基因沉默或抑制基因表达的现象蕴含着治疗和诊断目的，以及研究基因功能本身的重大希望。这种现象的实例包括反义技术和转录后基因沉默(PTGS)。
近年来用于基因沉默的反义策略引起了极大关注。其基础概念很简单，原则上也很有效：含靶RNA的反义核酸(NA)碱基对导致失活。反义RNA或DNA对靶RNA的识别可以认为是一种杂交反应。因为通过序列互补性结合该靶，这暗示反义NA地适当选择应确保高度特异性。靶RNA的失活可以通过不同的途径发生，这取决于反义NA(修饰或未修饰的DNA或RNA)的性质，和其中将要发生抑制的生物系统的性质。
然而，许多问题继续存在于有效反义和PTGS技术的发展中。例如，DNA反义寡核苷酸仅显示出短期有效性，并且所需剂量通常有毒性；类似地，由于稳定性问题，反义RNA的应用也已证明是无效的。已经利用各种方法尝试了通过降低核酸酶灵敏性来提高反义稳定性。这些方法包括修饰正常的磷酸二酯主链，例如使用硫代磷酸酯或甲基膦酸酯；掺入2′-OMe-核苷酸，使用肽核酸(PNA)和使用3′-末端帽，如3′-氨丙基修饰或3′-3′-末端键。然而，这些方法昂贵而且需要额外的步骤。此外，非天然存在的核苷酸和修饰的使用妨碍了体内表达反义序列的能力，由此需要合成它们和之后给予。
因此，仍需要在体外和体内靶向、定向抑制基因功能的有效和持久的方法和组合物，尤其是在高等脊椎动物细胞中，包括稳定性增加的改善的反义RNA。
发明概述
本发明提供了新的组合物和方法，其包括对调节基因表达有用的自我保护寡核苷酸。
在一个实施方案中，本发明包括分离的自我保护多核苷酸，包含具有与靶mRNA序列互补的序列的区域和一个或多个自身互补区。在特定实施方案中，该寡核苷酸包含两个或多个自身互补区。该自身互补区可以位于多核苷酸的5′末端、3′末端或两个末端。
在某些实施方案中，本发明的自我保护多核苷酸包括RNA、DNA或肽核酸。
在另外的实施方案中，自我保护多核苷酸进一步包含第二序列，其与靶mRNA序列非互补或部分互补，和与自身互补区非互补，并且所述第二序列位于自身互补区和与靶mRNA序列互补的序列之间。
在特定实施方案中，自身互补区包含茎-环结构。
在相关实施方案中，自身互补区不与和靶mRNA序列互补的序列互补。
在另一个相关实施方案中，其中多核苷酸包含两个自身互补区，这两个自身互补区彼此不互补。
在特定实施方案中，与靶mRNA序列互补的序列包含至少1 7个核苷酸，或17至30个核苷酸。
在其他实施方案中，自身互补区包含至少5个核苷酸、至少12个核苷酸、至少24个核苷酸或12至48个核苷酸。
在另一个实施方案中，茎-环结构的环区包含至少1个核苷酸。在其他实施方案中，该环区包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明包括包含多重本发明的自我保护多核苷酸的阵列。
在另一个实施方案中，本发明包括能够表达本发明的自我保护多核苷酸的表达载体。在不同的实施方案中，该表达载体是组成型或诱导型载体。
本发明进一步包括组合物，其包含生理学可接受的载体和本发明的自我保护多核苷酸。
在其他实施方案中，本发明提供了一种降低基因表达的方法，包括将本发明的自我保护寡核苷酸导入细胞。在不同的实施方案中，该细胞是植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌的细胞。在一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，该多核苷酸被直接导入细胞，而在其他实施方案中，该多核苷酸通过足以将分离的多核苷酸递送入细胞的手段细胞外导入细胞。
在另一个实施方案中，本发明包括一种治疗疾病的方法，包括将本发明的自我保护多核苷酸导入细胞，其中靶基因的过量表达与该疾病相关。在一个实施方案中，该疾病是癌症。
本发明进一步提供了一种治疗患者的感染的方法，包括将本发明的自我保护多核苷酸导入患者，其中分离的多核苷酸介导感染物的进入、复制、整合、传染或维持。
在又一个相关实施方案中，本发明提供了一种鉴定基因功能的方法，包括将本发明的自我保护多核苷酸导入细胞，其中该多核苷酸抑制该基因表达，和测定该多核苷酸的导入对细胞特征的影响，由此确定靶基因的功能。在一个实施方案中，使用高流通量筛选实施该方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种设计多核苷酸序列的方法，所述序列包括一个或多个用于调节靶基因表达的自身互补区，所述方法包括：(a)选择长度为17至30个核苷酸并且与靶基因互补的第一序列；(b)选择一个或多个长度为12至48个核苷酸的附加序列，其包含自身互补区且其与第一序列非互补；和(c)选择一个或多个长度为2至12个核苷酸的另外的附加序列，其与靶基因非互补或自身互补，且其与步骤(b)中选择的附加序列非互补。
在另一个实施方案中，本发明的自我保护多核苷酸与缺乏所述一个或多个自身互补区的相同多核苷酸相比，表现出体内半衰期增加。
在另一相关实施方案中，本发明提供了一种治疗疾病的方法(例如与突变mRNA或基因相关的疾病)，包括将自我保护多核苷酸导入细胞，其中靶mRNA与对应的野生型mRNA相比包含一个或多个突变。在一个具体实施方案中，该疾病是囊性纤维化。
类似地，在一个相关实施方案中，本发明包括一种调节突变mRNA在细胞中的表达的方法，包括将自我保护多核苷酸导入细胞，其中所述靶RNA序列包含所述突变mRNA的区域。在一个具体实施方案中，该突变mRNA与囊性纤维化相关。在一个具体实施方案中，该突变mRNA是由编码突变型囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)多肽的基因表达的mRNA。在另一个实施方案中，该突变mRNA与肿瘤相关。在另一个实施方案中，该突变mRNA是由编码突变型p53多肽的基因表达的mRNA。
附图简述
图1提供了本发明示例性多核苷酸的图。(A)表示包含与靶mRNA互补序列的区域；(B)表示自身互补区；(C)表示由自身互补区形成的茎-环结构的环区；和(D)表示包含与靶mRNA互补序列的区域和自身互补区之间的缺口区。
发明详述
本发明提供了抑制靶基因在原核生物和真核生物体内和体外表达的新组合物和方法。
本发明部分地基于令人惊奇的发现-进一步包含一个或多个能够形成茎-环结构的自身互补区的反义寡核苷酸在抑制靶基因表达中更稳定和明显更有效。在具体实施方案中，本发明提供了有效抑制靶基因体外或体内表达的组合物。已知它们的有效性增加，本发明的组合物可以以较低浓度递送至细胞或受试者，伴随着毒性降低。
A.自我保护多核苷酸
按照本发明，使用自我保护多核苷酸调节基因表达，其包含与由靶基因表达的mRNA具有互补性的核苷酸序列，以及一个或多个自身互补区。本文使用的自我保护多核苷酸是指分离的多核苷酸，其包含与靶mRNA或基因序列区域互补的单链区，和一个或多个位于该多核苷酸的5′或3′末端之一或两个末端的自身互补区，该自身互补区能够形成双链区，如茎-环结构。自我保护多核苷酸本文也称为自我保护寡核苷酸。本发明的自我保护多核苷酸提供了令人惊奇的优于现有技术中的多核苷酸抑制剂，包括反义RNA和RNA干扰分子的优点，包括稳定性增加和有效性增加。
在某些实施方案中，自我保护多核苷酸包含与靶基因互补的两个或多个序列区域。在特定实施方案中，这些区域与同一靶基因或mRNA互补，而在其他实施方案中，它们与两个或多个不同的靶基因或mRNA互补。因此，本发明包括自身互补多核苷酸，其包含与一个或多个靶mRNA或基因互补的一系列序列。在特定实施方案中，这些序列被与靶mRNA序列非互补或部分互补和与自身互补区非互补的序列区域隔开。在包含多重与靶基因或mRNA互补的序列的自我保护多核苷酸的其他实施方案中，该自我保护多核苷酸在与靶基因互补的一个或多个序列区域的5′、3′或两个末端包含自身互补区。在一个特定实施方案中，自我保护多核苷酸包含两个或多个与一个或多个与靶基因互补的序列区域，自身互补区位于与靶基因互补的每个区域的5′和3′末端。
本文使用的术语“自身互补”是指核苷酸序列，其中该核苷酸序列的第一区域与它的第二区域结合形成A-T(U)和G-C杂交对。彼此结合的核苷酸序列的这两个区域可以相邻或可以被其他核苷酸分隔开。术语“非互补”表示在核苷酸的特定一段中，其内部没有核苷酸与靶结合形成A-T(U)或G-C杂交。术语“部分互补”表示在一段核苷酸中，有至少一个核苷酸对与靶结合形成A-T(U)或G-C杂交，但是没有足够数量的互补核苷酸对在生理条件下维持这一段核苷酸内的结合。
术语分离的是指一种物质，其至少部分不含在该物质的天然状态下正常伴随该物质的成分。分离意味着从原始来源或周围环境中分离的程度。本文使用的分离的，例如与DNA相关的，是指基本上远离其他编码序列的多核苷酸，并且该DNA分子不含大的无关编码DNA部分，如大的染色体片段或其他功能基因或多肽编码区。当然，这是指最初分离的DNA分子，并且不排除随后人工添加至该区段的基因或编码区。
在各种不同的实施方案中，本发明的自我保护多核苷酸包含RNA、DNA或肽核酸，或这些类型分子的任何或全部的组合。此外，自我保护多核苷酸可以包含修饰的核酸，或核酸的衍生物或类似物。
核酸修饰的实例包括但不限于生物素标记、荧光标记、将伯胺引入多核苷酸的氨基修饰物、磷酸基、脱氧尿苷、卤化核苷、硫代磷酸酯、2′-OMe RNA类似物、嵌合RNA类似物、摆动基团和脱氧肌苷。
本文使用的术语“类似物”是指保留与本文多核苷酸相同的结构和/或功能(例如与靶结合)的分子、化合物或组合物。类似物的实例包括肽模拟物、肽核酸以及小的和大的有机或无机化合物。
本文使用的术语“衍生物”或“变体”是指通过一个或多个核酸缺失、添加、置换或侧链修饰而不同于天然存在的多核苷酸(例如靶基因序列)的多核苷酸。在某些实施方案中，变体与靶基因序列的区域具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性。因此，例如，在某些实施方案中，本发明的自我保护寡核苷酸包含与靶基因序列的变体互补的区域。
在所有情况下，本发明的自我保护多核苷酸包含与靶基因或多核苷酸序列(或其变体)的一个或多个区域互补，并更优选完全互补的序列区域。在某些实施方案中，与靶基因(或mRNA)互补的序列区域的选择基于对所选靶序列的分析和二级结构的确定、Tm、结合能和相对稳定性。可以基于它们相对不能形成二聚体、发夹或其他二级结构来选择这种序列，所述的二级结构会降低或阻止与宿主细胞中靶mRNA的特异性结合。非常优选的mRNA靶区域包括在AUG翻译起始密码子处或其附近的那些区域和基本上与该mRNA的5′区互补的那些序列。这些二级结构分析和靶位点选择的考虑可以例如使用OLIGO引物分析软件v.4和/或BLASTN 2.0.5算法软件进行(Altschul et al.，NucleicAcids Res.1997，25(17)：3389-402)。
在另一个实施方案中，通过搜索靶mRNA转录序列中AA二核苷酸序列的出现来选择靶位点。每个AA二核苷酸序列与3′相邻的大约19个核苷酸相结合是潜在的siRNA靶位点。在一个实施方案中，靶位点优先不位于5′和3′非翻译区(UTR)内或接近起始密码子的区域内(大约75个碱基内)，因为结合调节区的蛋白可能干扰多核苷酸的结合。此外，潜在的靶位点可以与适当的基因组数据库比较，如BLASTN2.0.5，可从www.ncbi.nlm的NCBI服务器上获得，和消除与其他编码序列具有显著同源性的潜在靶序列。
靶基因或mRNA可以是任何物种的，例如，包括植物、动物(例如哺乳动物)、原生动物、病毒、细菌或真菌的。
如上指出，靶基因序列和自我保护多核苷酸的互补区可以彼此完全互补，或它们可以未达完全互补，只要这些链可以在生理条件下彼此杂交。
本发明的自我保护多核苷酸包含与靶mRNA或基因互补的区域，以及一个或多个自身互补区。此外，它们可以任选包含一个或多个位于与靶mRNA或基因互补的区域和自身互补区之间的缺口区。
典型地，与靶mRNA或基因互补的区域的长度为17至30个核苷酸，包括这些范围内的整数值。这个区域的长度可以为至少16个核苷酸、长度为至少17个核苷酸、长度为至少20个核苷酸、长度为至少24个核苷酸、长度为16至24个核苷酸，或长度为17至24个核苷酸，包括这些范围内的任何整数值。
典型地，自身互补区的长度为14至30个核苷酸、长度为至少14个核苷酸、长度为至少16个核苷酸或长度为至少20个核苷酸，包括这些范围内的任何整数值。在某些实施方案中，自身互补区位于该多核苷酸的5′或3′末端。在某些实施方案中，当多核苷酸包含两个自身互补区时，一个位于5′末端，一个位于3′末端。
在优选实施方案中，自身互补区的长度足以形成双链结构。在一个实施方案中，自身互补区形成茎-环结构，该结构包含自身互补序列的双链区和单链序列的环。因此，在一个实施方案中，自身互补区的一级序列包含被非互补或部分互补的附加序列分隔开的彼此互补的两个序列段。尽管不太理想，但在某些实施方案中附加序列可以互补。附加序列形成茎-环结构的环，并因此，必须足够长以促进允许两个互补段彼此结合所需的折叠。在特定实施方案中，环序列包含至少3个、至少4个、至少5个或至少6个碱基。在一个实施方案中，环序列包含4个碱基。彼此互补的两个序列段(在自身互补区内；即茎区)具有足以在生理条件下彼此特异性杂交的长度。在某些实施方案中，每一段包含4至12个核苷酸；在其他实施方案中，每一段包含至少4个、至少5个、至少6个、至少8个或至少10个核苷酸，或这些范围内的任何整数值。在特定实施方案中，自身互补区包含至少4个互补核苷酸的两段，这两段被至少4个核苷酸的环序列分隔开。此外，在优选实施方案中，当自我保护多核苷酸包含两个或多个自身互补区时，这两个区域彼此不互补。另外，在优选实施方案中，自身互补区不和与靶mRNA或基因互补的自我保护多核苷酸区域互补。
在某些实施方案中，任选的缺口区包含长度至少为1个、至少为2个、至少为3个或至少为4个的核苷酸，或长度为1至6个的核苷酸，包括落在这些范围内的任何整数值。在各种不同的实施方案中，缺口区不与靶mRNA或基因互补，或它与靶mRNA或基因部分互补。在一个实施方案中，缺口区不与自身互补区的茎区互补。
在特定实施方案中，自身互补区具有适于自身互补区结合，例如形成茎-环结构的热力学参数。
在一个实施方案中，经由RNA的自由能分析来动态计算自身互补区，然后与剩余“非自身互补区”或环区内所含的能量相比，以确保该能量组成足够形成期望结构，例如茎-环结构。通常，在确定茎-环结构的组成中，考虑mRNA靶向区的不同核苷酸序列，以确保形成该结构。可以再次改变自由能解析式，以解释核苷酸的类型或使用它的环境的pH。本领域可以获得许多不同的二级结构预测程序，根据本发明每一种都可以使用。RNA和DNA碱基的热力学参数也可以公开获得，与靶序列选择算法相结合，其中几个是本领域可获得的。
在一个实施方案中，自我保护多核苷酸包含以下或由以下组成：(a)包含长度为17至30个核苷酸(包括中间的任何整数值)的序列，其与mRNA分子的至少一部分互补且在生理条件下能够与其杂交；侧翼是(b)包含长度为1至4个核苷酸的两个缺口区，和(c)包含长度为16至24个核苷酸(包括中间的任何整数值)的两个自身互补序列。在一个实施方案中，每个自身互补序列能够形成茎-环结构，其中一个位于自我保护多核苷酸的5′末端，一个位于其3′末端。
在某些实施方案中，自身互补区发挥作用抑制或降低自我保护寡核苷酸在生理条件，如细胞内的条件下降解。不希望受特定学说的束缚，据信自身互补区采用的结构使得多核苷酸比缺乏自身互补区的多核苷酸更耐核酸酶的降解。此外，自身互补区采用的结构的存在被认为促进细胞摄取和降低不良的副作用。因此，在各种不同的实施方案中，如本文所述，自我保护多核苷酸与缺乏自身互补区的相同多核苷酸相比，体内半衰期增加。在各种不同的实施方案中，半衰期可以增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在优选实施方案中，本发明的自我保护多核苷酸与靶mRNA结合并降低其表达。靶基因可以是已知的基因靶，或作为选择，靶基因可以是未知的，即，可以使用随机序列。在某些实施方案中，靶mRNA水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％。
在本发明的一个实施方案中，靶基因表达(即mRNA表达)的抑制水平是至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或几乎100％，由此细胞或生物实际上将具有相当于所谓的基因“敲除”的表型。然而，在一些实施方案中，可能优选仅达到部分抑制，使得表型相当于所谓的基因“敲减”。这种敲减基因表达的方法可以用于治疗或用于研究(例如产生疾病状态模型、检验基因功能、估计一种物质是否作用于基因、证实用于发现药物的靶)。
本发明进一步提供了本发明的自我保护多核苷酸的阵列，包括微阵列。微阵列是用测微计测定其大小典型地在毫米范围的微型装置，用于实施化学和生物化学反应，并且尤其适用于本发明的实施方案。阵列可以通过微电子学和/或微组装来构建，使用半导体工业和/或生物化学工业中基本上任何已知的和可利用的技术，只要这类技术适合于多核苷酸序列的淀积和/或筛选且与之不矛盾。
本发明的微阵列尤其合乎高流通量分析多重自我保护多核苷酸的需要。微阵列典型地被构建具有包含本发明的自我保护多核苷酸的离散区域或斑点，每个斑点包含一个或多个自我保护多核苷酸，优选在阵列表面上可定位地点。本发明的阵列可以用本领域可利用的任何方法来制备。例如，可以使用Affymetrix开发的光定向化学合成方法(参见美国专利5,445,934和5,856,174)，通过将固相光化学合成与光刻制造技术相结合在芯片表面上合成生物分子。lncytePharmaceutical开发的化学淀积方法使用了用于定向淀积在芯片表面上的预先合成的cDNA探针(参见例如美国专利5,874,554)。
在某些实施方案中，使用本领域广泛利用的技术合成本发明的自我保护多核苷酸。在其他实施方案中，使用适当的和普遍已知的技术在体外或体内表达它。因此，在某些实施方案中，本发明包括包含本发明的自我保护多核苷酸序列的体外和体内表达载体。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建含有编码自我保护多核苷酸的序列，以及适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外DNA重组技术、合成技术和体内基因重组。已经描述了这类技术，例如Sambrook，J.et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Press，Plainview，N.Y.，and Ausubel，F.M.et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y中。
表达载体典型地包括调节序列，其调节自我保护多核苷酸的表达。表达载体中存在的调节序列包括载体的那些非翻译区，例如，增强子、启动子、5′和3′非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用进行转录和翻译。这类元件在它们的强度和特异性方面可以有变化。根据使用的载体系统和细胞，可以使用许多适当的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。此外，也可以使用组织特异性或细胞特异性启动子。
对于在哺乳动物细胞中表达，通常优选来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。此外，通常可利用许多基于病毒的表达系统。例如，在使用腺病毒作为表达载体的情况下，编码感兴趣多肽的序列可以连接入由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物。插入病毒基因组的非必需E1或E3区中可以用于获得能够在感染宿主细胞中表达多肽的活病毒(Logan，J.and Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。此外，转录增强子，如鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)增强子，可以用来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
在某些实施方案中，本发明提供了自我保护多核苷酸的条件性表达。本领域已知和可利用用于细胞和动物的各种条件性表达系统，并且本发明包括任何这类条件性表达系统调节自我保护多核苷酸的表达或活性的用途。在本发明的一个实施方案中，例如，使用REV-TET系统实现诱导型表达。这个系统的成分和使用该系统控制基因表达的方法已经在文献中详细记载，并且表达四环素控制的反式激活蛋白(tTA)或反向tTA(rtTA)的载体是市场上可买到的(例如pTet-Off、pTet-On和ptTA-2/3/4载体，Clontech，Palo Alto，CA)。已经描述了这类系统，例如美国专利5650298、6271348、5922927和相关专利，将它们的全部内容引入作为参考。
在一个特殊实施方案中，使用包含pSUPER载体主链和相当于待表达的自我保护多核苷酸的附加序列的载体系统表达自我保护多核苷酸。已经表明pSUPER载体系统对表达siRNA反应物和下调基因表达有用(Brummelkamp，TT.et al.，Science 296：550(2002)andBrummelkamp，T.R.et al.，Cancer Cell，2002年8月22日在线公开发表)。PSUPER载体可从OligoEngine，Seattle，WA买到。
B.调节基因表达的方法
本发明的自我保护多核苷酸可以用于各种目的，通常都与它们抑制或降低靶基因表达的能力相关。因此，本发明提供了降低一个或多个靶基因表达的方法，包括将本发明的自我保护多核苷酸导入含有靶基因或其同源物、变体或其直向同源物的细胞。此外，自我保护多核苷酸可以用于间接降低表达。例如，自我保护多核苷酸可以用于降低驱动第二个基因表达的反式激活物的表达，由此降低第二个基因的表达。类似地，自我保护多核苷酸可以用于间接增加表达。例如，自我保护多核苷酸可以用于降低抑制第二个基因表达的转录阻遏物的表达，由此增加第二个基因的表达。
在各种不同的实施方案中，靶基因是来源于自我保护多核苷酸将被导入的细胞的基因、内源基因、外源基因、转基因或病原体基因，其存在于转染后的细胞中。根据特定靶基因和递送入细胞的自我保护多核苷酸的量，本发明的方法可以引起靶基因表达的部分或完全抑制。含有靶基因的细胞可以来源于或包含在任何生物(例如植物、动物、原生动物、病毒、细菌或真菌)中。
靶基因表达的抑制可以通过以下手段来证实，包括但不限于使用本发明领域的技术人员已知的技术观察或检测靶基因所编码的蛋白质，和/或来自靶基因的mRNA产物，和/或与基因表达有关的表型的水平缺乏或可观察到的降低。
可被检验以确定导入本发明的自我保护多核苷酸所引起的作用的细胞特征的实例包括细胞生长、凋亡、细胞周期特征、细胞分化和形态。
自我保护多核苷酸可以直接导入细胞(即细胞内导入)，或细胞外导入空腔、胞间隙、导入生物的循环系统、经口导入，通过在含有自我保护多核苷酸的溶液中浸浴生物，或通过足以将自我保护多核苷酸递送入细胞的一些其他手段。
此外，经改造以表达自我保护多核苷酸的载体可以被导入细胞，其中该载体表达自我保护多核苷酸，由此将它导入细胞。将表达载体转移至细胞的方法是本领域熟知的和可以利用的，包括例如转染、脂质转染、划痕荷载(scrape-loading)、电穿孔、显微注射、感染、基因枪和逆转录转座。通常，本领域技术人员基于载体类型和细胞类型，和本领域可广泛利用的教导容易确定将载体导入细胞的适宜方法。可以通过本领域容易利用的各种方法，包括例如鼻吸入导入感染物质。
使用本发明的自我保护寡核苷酸抑制基因表达的方法可以与其他敲减和敲除方法组合，例如基因寻靶、反义RNA、核酶、双链RNA(例如shRNA和siRNA)，以进一步降低靶基因表达。
在不同的实施方案中，本发明的靶细胞是初级细胞、细胞系、无限增殖细胞或转化细胞。靶细胞可以是体细胞或生殖细胞。靶细胞可以是非分裂细胞，如神经元，或它可能能够在体外在合适的细胞培养条件下增殖。靶细胞可以是正常细胞，或它们可以是病变细胞，包括含有已知基因突变的细胞。本发明的真核靶细胞包括哺乳动物细胞，例如人细胞、鼠细胞、啮齿动物细胞和灵长类动物细胞。在一个实施方案中，本发明的靶细胞是干细胞，其包括例如胚胎干细胞，如鼠胚胎干细胞。
本发明的自我保护多核苷酸和方法可以用于治疗各种疾病或病症的任一种，包括但不限于炎症性疾病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤、脱髓鞘病变、消化系统疾病、内分泌系统疾病、生殖系统疾病、血液和淋巴疾病、免疫性疾病、精神疾病、肌肉骨骼疾病、神经病学疾病、神经与肌肉疾病、代谢性疾病、性传播疾病、皮肤和结缔组织疾病、泌尿系疾病和感染。
在某些实施方案中，该方法在动物上实施，在特定实施方案中，在哺乳动物上实施，并且在某些实施方案中，在人体上实施。
因此，在一个实施方案中，本发明包括使用自我保护寡核苷酸治疗或预防与基因失调、过量表达或突变相关的疾病的方法。例如，可以将自我保护多核苷酸导入癌细胞或肿瘤，并由此抑制维持致癌/致肿瘤表型所需的或与其相关的基因表达。为预防疾病或其他病变，可以选择例如疾病/病变开始或维持所需的靶基因。治疗可以包括与该疾病相关的任何症状或与该病变相关的临床适应症的改善。
此外，本发明的自我保护多核苷酸用于治疗与基因突变相关的疾病或病症。在一个实施方案中，自我保护多核苷酸用于调节突变基因或等位基因表达。在这类实施方案中，突变基因是自我保护多核苷酸的靶，其可包含与突变基因区互补的区域。这个区域可以包括突变，但是它不是必要的，因为也可以靶向该基因的另一个区域，导致突变基因或mRNA的表达降低。在某些实施方案中，这个区域包含突变，而在相关实施方案中，所产生的自我保护寡核苷酸特异性抑制突变mRNA或基因的表达，但不抑制野生型mRNA或基因的表达。这种自我保护多核苷酸对例如一个等位基因突变而另一个没有突变的情形尤其有效。然而，在其他实施方案中，这个序列不一定包含突变，并因此可以只包含野生型序列。这种自我保护多核苷酸对全部等位基因都突变的情形尤其有效。本领域已知与基因突变相关的或由其引起的各种疾病和病症，本发明包括用自我保护多核苷酸治疗任何这种疾病或病症。例如，在一个实施方案中，使用靶向囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因的自我保护多核苷酸治疗囊性纤维化。在另一个实施方案中，使用靶向p53基因或等位基因的自我保护多核苷酸治疗癌症。在某些实施方案中，p53基因或等位基因是突变p53基因或等位基因。
在某些实施方案中，靶向病原体基因进行抑制。例如，该基因可以直接引起宿主的免疫抑制或对病原体复制、病原体传染或感染的维持必不可少。此外，靶基因可以是病原体基因或负责病原体进入其宿主、被病原体或宿主药物代谢、病原体基因组的复制或整合、宿主中感染的建立或传播或病原体下一代的装配的宿主基因。预防(即预防或降低感染危险)，以及降低与感染相关症状的出现率或严重性的方法包括在本发明中。例如，处于被病原体感染的危险之中的细胞或已经受感染的细胞，尤其是人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染，可以通过导入根据本发明的自我保护多核苷酸而被靶向进行治疗。
在其他具体实施方案中，本发明用于治疗任何类型的癌症或开发其治疗方法。可以使用本文所述方法治疗的肿瘤实例包括但不限于神经母细胞瘤、骨髓瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、结肠癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、脑肿瘤、乳腺癌、白血病、淋巴瘤等等。
自我保护多核苷酸和表达载体(包括病毒载体和病毒)可以导入体外或离体细胞，然后放入动物进行治疗，或可以通过体内给予将它们直接导入患者。因此，在某些实施方案中，本发明提供了基因治疗的方法。本发明的组合物可以以许多方式中的任何一种给予患者，包括肠胃外、静脉内、全身、局部、口服、肿瘤内、肌内、皮下、腹膜内、吸入或任何这样的递送方法。在一个实施方案中，该组合物肠胃外给予，即，关节内、静脉内、腹膜内、皮下或肌内给予。在一个具体实施方案中，脂质体组合物通过静脉内输注给予或通过快速浓注腹膜内给予。
本发明的组合物可以被配制为适于递送给受试者的药物组合物。本发明的药物组合物常常会进一步包含一种或多种缓冲液(例如中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、右旋糖或右旋糖酐)、甘露糖醇、蛋白质、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂如EDTA或谷胱甘肽、助剂(例如氢氧化铝)、使该制剂与受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。作为选择，本发明的组合物可以被配制成冻干剂。
医师基于各种因素，例如，包括疾病和由所用载体表达的自我保护寡核苷酸(在给予载体的情况下)水平，可以容易地确定给予患者的自我保护寡核苷酸的量。典型地选择每一剂给予的量高于最低治疗剂量但是低于中毒剂量。每剂的量的选择将取决于很多因素，如患者的病史、其他疗法的使用和疾病的性质。此外，给予的量在治疗的始终都可以进行调节，这取决于患者对治疗的反应和任何治疗相关副作用的存在或严重程度。
本发明进一步包括鉴定基因在生物中的功能的方法，包括使用自我保护多核苷酸抑制以前功能未知的靶基因的活性。代替通过传统的基因筛选耗时费力地分离突变体，功能基因组学预想通过利用本发明确定未表征基因的功能，以减少靶基因活性的量和/或改变其时限。本发明可以用于确定用于制药学的潜在靶、了解与发育相关的正常和病理事件、确定负责出生后发育/衰老的信号传导途径等等。从基因组和表达的基因来源获得核苷酸序列信息，包括酵母、黑腹果蝇和C.elegans基因组的总序列的不断增长的速度可以与本发明结合以确定基因在生物(例如线虫)中的功能。不同生物使用特定密码子的偏好、检索相关基因产物的序列数据库、将遗传性状的连锁图与核苷酸序列源自其的物理图谱联系起来和人工智能方法可以用于定义由按照这类测序方案获得的核苷酸推定的可读框。
在一个实施方案中，自我保护寡核苷酸用于抑制基因表达，基于可从表达序列标记(EST)获得的部分序列，例如为了确定该基因的功能或生物活性。生长、发育、代谢、抗病性或其他生物过程的功能改变将表明EST的基因产物的正常功能。
自我保护多核苷酸可以被导入含有靶基因的完整细胞/生物的容易性使得本发明能被用于高流通量筛选(HTS)。例如，含有能够抑制不同表达的基因的自我保护多核苷酸的溶液可以作为有序阵列放入位于微量滴定板上的各个孔中，可以测定每孔中完整细胞/生物由于靶基因活性的抑制而引起的性能或发育上的任何变化或改变。当基因活性被抑制时，可以从靶基因对细胞/生物所具有的影响来测定靶基因的功能。在一个实施方案中，本发明的自我保护多核苷酸用于化学基因组(chemocogenomic)筛选，即，使用本发明的自我保护多核苷酸测试化合物逆转通过降低基因表达建立模型的疾病的能力。
如果通过RFLP或QTL分析确定一种生物的特征与多态性在遗传上相关联，则本发明可用于了解该遗传多态性是否可能直接负责该特征。例如，可以扩增限定这种遗传多态性的片段或在该遗传多态性附近的序列以产生RNA，自我保护多核苷酸可以导入生物，并且可以确定该特征的改变是否与抑制相关。
本发明也可有效允许抑制必需基因。这类基因可能是仅在特定发育阶段或细胞区室中的细胞或生物生存力所需的。当靶基因不是生存力所需的时候或情况下，通过抑制靶基因的活性可以产生条件突变的功能等同物。本发明允许在生物的特定发育时期和位置添加自我保护多核苷酸，同时不将永久突变导入靶基因组。同样，本发明包括仅在需要时表达自我保护多核苷酸的诱导型或条件型载体的应用。
本发明还涉及证实基因产物是否是药物发现或研制的靶的方法。将靶向相当于用于降解的基因的mRNA的自我保护多核苷酸导入细胞或生物。将细胞或生物维持在发生mRNA降解的条件下，导致基因表达降低。确定基因表达降低是否对细胞或生物具有影响。如果基因表达降低具有影响，则该基因产物是药物发现或研制的靶。
C.设计和生产自我保护多核苷酸的方法
本发明的自我保护多核苷酸包含一组新的和独特的功能序列，该序列以使其采用含有一个或多个双链区的二级结构(典型地是茎-环结构)的方式排列，其赋予自我保护多核苷酸的优点。因此，在某些实施方案中，本发明包括设计本发明的自我保护多核苷酸的方法。这类方法典型地包括适当选择自我保护多核苷酸的不同序列成分。
在一个实施方案中，自我保护多核苷酸的基本设计如下：
设计基序：
(茎A)(环A)(茎B)(X)(靶)(X)(茎C)(环B)(茎D)
X＝任选的间隔区
因此，在一个相关实施方案中，自我保护多核苷酸设计如下：
a.从靶核苷酸序列开始。长度和组成规定所有茎和环区的长度和序列组成。
b.茎A&D可能需要对于酶相容性的特异性核苷酸。
c.建立具有(4-12)个核苷酸的候选茎A&B，其具有主导等长靶区域的解链温度。茎链彼此具有A-T、G-C互补性。
d.建立具有(4-12)个核苷酸的候选茎C&D，其具有主导等长靶区域的解链温度。茎链彼此具有A-T、G-C互补性，但是没有与茎A&B的互补性。
e.建立具有(4-8)个富含A-T核苷酸的环候选者成为环A&B。
f.形成每个基序候选者的邻接序列。
g.使用软件以期望参数折叠候选序列。
h.根据输出数据，定位具有单链靶区域的结构，其侧接于期望茎/环结构的任一个或两个末端。
在一个实施方案中，设计包含一个或多个调节靶基因表达的自身互补区的多核苷酸序列(即自我保护多核苷酸)的方法包括(a)选择长度为17至30个核苷酸并且与靶基因互补的第一序列；和(b)选择一个或多个长度为12至48个核苷酸的附加序列，其包含自身互补区并且与第一序列非互补。在另一个实施方案中，该方法进一步包括(c)选择一个或多个长度为2至12个核苷酸的另外的附加序列，其与靶基因非互补或部分互补并且其与步骤(b)中选择的附加序列非互补。
在某些实施方案中，这些方法包括确定或预测步骤(b)中所选序列采用的二级结构，例如为了确定它们能够采用茎-环结构。
同样，这些方法可以包括验证步骤，其包含测试设计的多核苷酸序列抑制靶基因表达的能力，例如在体内或体外测试系统中。
本发明进一步包括计算机程序基于本文描述的互补特征来选择自我保护多核苷酸序列的应用。因此本发明提供了欲用于选择自我保护多核苷酸序列的计算机软件程序，和包含所述软件程序的计算机可读介质，以及含有本发明的程序之一的计算机。
在某些实施方案中，用户提供具有关于靶基因的序列、位置或名称的信息的计算机。该计算机在本发明的程序中使用这个输入信息鉴定一个或多个适当的靶基因区域，和输出或提供用在本发明的自我保护多核苷酸中的互补序列。然后该计算机程序使用这个序列信息选择自我保护多核苷酸的一个或多个自身互补区的序列。典型地，该程序将选择不与基因组序列，包括靶基因，或和靶mRNA互补的自我保护多核苷酸的区域互补的序列。此外，该程序将选择彼此不互补的自身互补区序列。当需要时，该程序还提供缺口区的序列。在选择适当序列时，该计算机程序给用户输出或提供这个信息。
本发明的程序可以进一步使用关于含有靶基因的生物之基因组序列的输入信息，例如公共或专用数据库，以及预测特定序列的二级结构和/或杂交特征的另外的程序，以便确保自我保护多核苷酸采用正确的二级结构并且不与非靶基因杂交。
本发明部分地基于令人惊奇的发现-本文描述的自我保护多核苷酸在降低靶基因表达中极其有效。该自我保护多核苷酸提供优于以前描述的反义RNA的显著优点，包括稳定性增加或对核酶的抗性增加，和有效性增加。此外，本发明的自我保护多核苷酸提供优于用于siRNA的传统dsRNA分子的另外的优点，因为自我保护多核苷酸的使用基本上消除了与dsRNA分子相关的偏离靶的抑制。
本发明的实施将使用各种细胞生物学、分子生物学、微生物学和重组DNA的常规技术，它们在本领域技术人员的技能范围之内。文献中充分描述了这类技术。参见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch，and Maniatis(ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；和DNA Cloning，VolumesI and Il(D.N.Glover ed.1985)。
实施例1
靶向GL2自我保护多核苷酸的pSUPER表达载体的设计和制备
使用pSUPER载体主链根据下列设计参数制备命名为GL2-1289pSUPER、GL2-0209 pSUPER和GL2-1532pSUPER的表达载体，其表达靶向GL2mRNA的自我保护多核苷酸。“5′-3′non-coding”是指质粒中的非编码DNA链；“5′-3′RNA-trans”是指从质粒表达的RNA转录物；“5′-3′RNA-struct”是指从质粒表达的RNA转录物的折叠结构；而“3′-5′coding_as”是指质粒中的编码DNA链。
1.GL2-1289 pSUPER的spDNA设计逻辑：
5′-3′non-coding＝GATCCGCT CAAGA AGCGGATC GTCAACTATGAAGAAGTGT AAACCTCAAT AGGTTTTTA(SEQ ID NO：1)
5′-3′RNA-trans.＝GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC GUCAACUAUGAAGAAGUGU AAACCUCAAU AGGUUU(SEQ ID NO：2)
5′-3′RNA-struct＝((((((((......))))))))................((((((....))))))(-16.90)
3′-5′coding_as＝GGCGA GTTCT TCGCCTAG
CAGTTGATACTTCTTCACA TTTGGA GTTA TCCAAAAATTCGA (SEQ IDNO：3)
2.GL2-0209 pSUPER的spDNA设计逻辑：
5′-3′non-coding＝GATCCGCT CAAGA AGCGGATC TGGGCTCAATACAAATCAC AAACCT CAAT AGGTTTTTA(SEQ ID NO：4)
5′-3′RNA-trans.＝GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC UGGGCUCAAUACAAAUCAC AAACCU CAAU AGGUUU(SEQ ID NO：5)
5′-3′RNA-struct＝((((((((......))))))))...............((((((....))))))(-16.50)
3′-5′coding_as＝GGCGA GTTCT TCGCCTAG
ACCCGAGTTATGTTTAGTG TTTGGA GTTATCCAAAAATTCGA(SEQ ID NO：6)
3.GL2-1532 pSUPER的spDNA设计逻辑：
5′-3′non-coding＝GATCCGCT CAAGA AGCGGATC
CACAACTCCTCCGCGCAAC AAACCT CAAT AGGTTTTTA(SEQ ID NO：7)
5′-3′RNA-trans.＝GAUCCGCU CAAGA AGCGGAUC CACAACUCCUCCGCGCAAC AAACCU CAAU AGGUUU(SEQ ID NO：8)
5′-3′RNA-struct＝((((((((......))))))))...............((((((....))))))(-16.10)
3′-5′coding_as＝GGCGA GTTCT TCGCCTAG
G′TGTTGAGGAGGCGCGTTG TTTGGA GTTATCCAAAAATTCGA(SEQ ID NO：9)
使用下列寡核苷酸引物进行PCR扩增亚克隆入pSuper载体的GL2基因的区域：
spDNA19_GL2-1289：
GATCCGCTCAAGAAGCGGATCGTCAACTATGAAGAAGTGTAA
ACCTCAATAGGTTTTTA(SEQ ID NO：10)
spDNA19_GL2-1289_As：
AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTACACTTCTTCATAGTTGACGATCCGCTTCTTGAGCGG(SEQ ID NO：11)
spDNA19_GL2-0209：
GATCCGCTCAAGAAGCGGATCTGGGCTCAATACAAATCACAAACCTCAATAGGTTTTTA(SEQ ID NO：12)
spDNA19_GL2-0209_As：
AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTGTGATTTGTATTGAGCCCAGATCCGCTTCTTGAGCGG(SEQ ID NO：13)
spDNA19_GL2-1532：
GATCCGCTCAAGAAGCGGATCCACAACTCCTCCGCGCAACAAACCTCAATAGGTTTTTA(SEQ ID NO：14)
spDNA19_GL2-1532_As：
AGCTTAAAAACCTATTGAGGTTTGTTGCGCGGAGGAGTTGTG
GATCCGCTTCTTGAGCGG(SEQ ID NO：15).
使用普通分子生物学和细胞生物学技术将扩增的序列亚克隆入pSuper载体(PCT公开号WO 01/36646中概况地描述；可从Oligoengine，Seattle，WA获得)。
实施例2
自我保护多核苷酸对基因表达的抑制
通过使用人胚胎肾细胞系293-Lux(其稳定产生萤光素酶(GL2形式))检验本发明的自我保护寡核苷酸对体内基因表达的影响，证明了它们的抑制作用。将细胞铺在含500微升含血清培养基的24孔平皿中。当细胞大约60％汇合时，用50皮摩尔包含与萤光素酶基因互补的RNA序列区的自我保护寡核苷酸(或包含颠倒(scrambled)萤光素酶序列的阴性对照)，使用1微升Mirus’Transl T-siQuest试剂转染它们。具体地说，使用的自我保护多核苷酸包括sp-19-1289、sp-19-209、sp-19-1532、sp-17-1289和sp-17-209。对于这些自我保护多核苷酸中的每一个，第一个数字(17或19)表示与靶萤光素酶mRNA互补的区域长度，而第二个数字(1289、209或1532)表示靶向互补区中的萤光素酶基因的第一个碱基。在24小时收获细胞，且在光度计上读取溶解产物。
在所测试的五个自我保护寡核苷酸当中，两个使萤光素酶表达降低至对照值的50％至60％，而另外两个使萤光素酶表达降低至对照值的大约75％或80％(表1)。
表1.自我保护多核苷酸对荧光素酶表达的抑制
样品 原RLU 表达％ 混杂对照 sp-19-1289 sp-19-209 sp-19-1532 sp-17-1289 sp-17-209 15336976 16165063 8039347 8900588 11506895 12553289 100.00％ 105.40％ 52.42％ 58.03％ 75.03％ 81.85％
这些数据证明本发明的自我保护多核苷酸序列可有效降低体内基因表达，确定了它们可以用于各种目的，包括治疗与基因过量表达相关的疾病和病症。
实施例3
使用TRANSIT-TKO siRNA转染试剂对p53基因在哺乳动物细胞中
表达的抑制
使用培养的细胞证明了本发明的自我保护寡核苷酸降低p53基因在哺乳动物细胞中表达的有效性。用2微升TranslT-TKO siRNA转染试剂(Mirus Bio Corporation，Madison，WI)和50纳摩尔表2中所列的spRNA寡核苷酸或p53siRNA寡核苷酸，在含300μl DMEM/10％BSA的24孔板中转染75％汇合的293-H细胞。
p53基因序列(Genbank登录号AB082923)在其转录的mRNA内含有以前公开的RNAi靶序列。该靶位点的mRNA序列是GACUCCAGUGGUAAUCUAC(SEQ ID NO：16)。制备靶向这条序列的命名为“siRNA p53_public”和“spRNA p53_public(9.0)”的siRNA和spRNA寡核苷酸。这些寡核苷酸含有下列序列，并且spRNA p53-public(9.0)具有所示的结构：
siRNA p53-public：
反义5-3′：GACUCCAGUGGUAAUCUACTT(SEQ ID NO：17)
as 5-3′：GUAGAUUACCACUGGAGUCTT(SEQ ID NO：18)
spRNA p53_public(9.0)5′-3′：
CCCUUAUAGAGGGGUAGAUUACCACUGGAGUCGCGUUAUAGACGC (SEQ IDNO：19)
结构：(((((...)))))...((((.((...))))))(((((...)))))
制备另外的spRNA寡核苷酸以靶向下列p53mRNA位点，其被确定为非折叠的(n..19)：
UGCCCUCAACAAGAUGUUU(SEQ ID NO：20)。
spRNA p53_83在n..19结合基序的两端含有短茎/环结构并包括下列5′-3′序列和结构：
UCCGAGUUAGACUCGGAAAACAUCUUGUUGAGGGCAGGAACCUUAUAUGGUUCC(SEQ ID NO：21)
结构：((((((......))))))...............((((((.....))))))
spRNA p53_83NO-5′在n..19结合基序3′端含有短茎/环结构并包括下列5′-3′序列和结构：AAACAUCUUGUUGAGGGCAGGAACCUUAUAUGGUUCC(SEQ ID NO：22)
结构：............((((((......))))))
spRNA p53_83_Long在n..19结合基序两端含有短茎/环结构并包括下列5′-3′序列和结构：UCCAGGAGUUAGACUCCUGGAAAACAUCUUGUUGAGGGCAGGAGCACCUUAUAUGGUGCUCC(SEQ ID NO：23)
结构：((((((((......))))))))............((((((((......))))))))
s pRNA p 53_83_Long_NO-5′在n..19结合基序3′端含有短茎/环结构并包括下列5′-3′序列和结构：
AAACAUCUUGUUGAGGGCAGGAGCACCUUAUAUGGUGCUCC(SEQ ID NO：24)
结构：..................((((((((......))))))))
在48小时将细胞收获于100微升被动裂解缓冲液中。使用AssayDesigns p53 TiterZyme EIA试剂盒(Ann Arbor，MI)测试100微升的1∶40稀释液以确定p53存在的量。表2显示的结果以微微克p53提供，如从用于在测定时绘制标准曲线的对照标准估算的。p53敲减的百分比基于与模拟转染的孔相比p53的微微克数。
表2.自我保护多核苷酸对p53表达的抑制
样品 Pg p53 敲减％ 模拟转染 混杂对照 spRNA p53_public(-9.0) spRNA p53-83NO-5′ spRNA p53-83 235 230 130 150 160 0 2 45 36 32
spRNA p53_83_Long_NO-5′ spRNA p53_83_Long 150 80 36 66
相比之下，使用siRNA p53 public获得的结果是160pg的p53(内源性p53的32％敲减)。
这些结果证明本发明的自我保护寡核苷酸可有效降低靶基因在哺乳动物细胞中的表达，并支持它们在治疗由基因过量表达、失调、不当表达或基因突变引起的疾病，包括但不限于由p53突变引起的肿瘤中的应用。此外，它们表明本发明的自我保护多核苷酸提供了与siRNA寡核苷酸相比在降低靶基因表达方面提高的功效。
实施例4
使用siQUEST试剂对p53基因在哺乳动物细胞中表达的抑制
利用培养的细胞，使用不同的转染试剂证明了本发明的自我保护寡核苷酸降低p53基因在哺乳动物细胞中表达的有效性。用1微升TranslT-siQUESTTM试剂(Mirus Bio Corporation，Madison，WI)和50纳摩尔表3中所列的spRNA或p53 siRNA，在含300μl DMEM/10％BSA的24孔板中转染65％汇合的293-H细胞。
在48小时将细胞收获于100微升被动裂解缓冲液中。使用AssayDesigns p53 TiterZyme EIA试剂盒测试100微升的1∶40稀释液以确定p53存在的量。表3显示的结果以微微克p53提供，如从用于在测定时绘制标准曲线的对照标准估算的。p53敲减的百分比基于与模拟转染的孔相比p53的微微克数。
表3.自我保护多核苷酸对p53表达的抑制
样品 Pg p53 敲减％ 模拟转染 混杂对照 spRNA p53-83 NO-5′ 335 305 315 0 6 3
spRNA p53-83spRNA p53-83-Long-NO-5′spRNA p53-83-Long 345 255 235 -3 22 28
相比之下，使用siRNA p53 public获得的结果是215pg的p53(内源性p53的34％敲减)。
这些结果证明本发明的自我保护寡核苷酸可有效降低靶基因在哺乳动物细胞中的表达，并支持它们在治疗由基因过量表达、失调、不当表达或基因突变引起的疾病，包括但不限于由p53突变引起的肿瘤中的应用。此外，它们表明本发明的自我保护多核苷酸提供了与siRNA寡核苷酸相比在降低靶基因表达方面提高的功效。
本说明书中提及的和/或申请资料单中所列的以上所有美国专利、美国专利申请出版物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物的全部内容均被引入本文作为参考。
根据上文将知晓尽管为了说明，本文已经描述了本发明的具体实施方案，但是可以进行各种修改而不脱离本发明的精神和范围。
【序列表】
<110>Hauser，Todd
Loomis，Aaron
<120>使用自我保护寡核苷酸调节基因表达的组合物和方法
<130>430157.401PC
<140>PCT
<141>2005-12-29
<160>24
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-1289 pSUPER的序列
<400>1
gatccgctca agaagcggat cgtcaactat gaagaagtgt aaacctcaat aggttttta 59
<210>2
<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>从GL2-1289 pSUPER表达的RNA转录物
<400>2
gauccgcuca agaagcggau cgucaacuau gaagaagugu aaaccucaau agguuu 56
<210>3
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-1289 pSUPER的编码链
<400>3
ggcgagttct tcgcctagca gttgatactt cttcacattt ggagttatcc aaaaattcga 60
<210>4
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-0209 pSUPER的非编码链
<400>4
gatccgctca agaagcggat ctgggctcaa tacaaatcac aaacctcaat aggttttta 59
<210>5
<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>从GL2-0209 pSUPER表达的RNA转录物
<400>5
gauccgcuca agaagcggau cugggcucaa uacaaaucac aaaccucaau agguuu 56
<210>6
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-0209 pSUPER的编码序列
<400>6
ggcgagttct tcgcctagac ccgagttatg tttagtgttt ggagttatcc aaaaattcga 60
<210>7
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-1532 pSUPER的非编码序列
<400>7
gatccgctca agaagcggatccacaactcc tccgcgcaac aaacctcaat aggttttta 59
<210>8
<211>56
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>从GL2-1532 pSUPER表达的RNA转录物
<400>8
gauccgcuca agaagcggau ccacaacucc uccgcgcaac aaaccucaau agguuu 56
<210>9
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自GL2-1532 pSUPER的编码序列
<400>9
ggcgagttct tcgcctaggt gttgaggagg cgcgttgttt ggagttatcc aaaaattcga 60
<210>10
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>10
gatccgctca agaagcggat cgtcaactat gaagaagtgt aaacctcaat aggttttta 59
<210>11
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>11
agcttaaaaa cctattgagg tttacacttc ttcatagttg acgatccgct tcttgagcgg 60
<210>12
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>12
gatccgctca agaagcggat ctgggctcaa tacaaatcac aaacctcaat aggttttta 59
<210>13
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>13
agcttaaaaa cctattgagg tttgtgattt gtattgagcc cagatccgct tcttgagcgg 60
<210>14
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>14
gatccgctca agaagcggat ccacaactcc tccgcgcaac aaacctcaat aggttttta 59
<210>15
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PCR扩增GL2区的寡核苷酸引物
<400>15
agcttaaaaa cctattgagg tttgttgcgc ggaggagttg tggatccgct tcttgagcgg 60
<210>16
<211>19
<212>RNA
<213>智人
<400>16
gacuccagug guaaucuac 19
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)...(19)
<223>小干扰RNA序列
<400>17
gacuccagug guaaucuact t 21
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<220>
<221>misc_RNA
<222>(1)...(19)
<223>小干扰RNA序列
<400>18
guagauuacc acuggaguct t 21
<210>19
<211>45
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>19
cccuuauaga gggguagauu accacuggag ucgcguuaua gacgc 45
<210>20
<211>19
<212>RNA
<213>智人
<400>20
ugcccucaac aagauguuu 19
<210>21
<211>54
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>21
uccgaguuag acucggaaaa caucuuguug agggcaggaa ccuuauaugg uucc 54
<210>22
<211>37
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>22
aaacaucuug uugagggcag gaaccuuaua ugguucc 37
<210>23
<211>62
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>23
uccaggaguu agacuccugg aaaacaucuu guugagggca ggagcaccuu auauggugcu 60
cc 62
<210>24
<211>41
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>24
aaacaucuug uugagggcag gagcaccuua uauggugcuc c 41