20(S)-人参皂苷Rh2在制备降低阿霉素所致心脏毒性的药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及20(S)-人参皂苷Rh2和含有20(S)-人参皂苷Rh2的提取物在制备降低阿霉素所致心脏毒性的药物中的应用。
背景技术
阿霉素(adriamycin，ADR)属于蒽环类抗生素，是一种高效的广谱抗肿瘤抗生素，临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤，心脏毒性是阿霉素临床应用的主要不良反应之一，因出现剂量依赖的不可逆转的心肌病，充血性心力衰竭(CHF)，而使其应用受到限制。人参本为调节机体免疫能力增补元气的传统中药，从人参当中提取的20(S)-人参皂苷Rh2长期以来被认为具有增强癌症患者免疫能力，同时抑制肿瘤生长的作用。日本专利昭58-57399公开了人参皂苷Rh2具有治疗肿瘤活性。小田岛肃夫进行了人参皂苷Rh2体外抗癌活性研究，证明其对肝癌、黑色素瘤B16、宫颈癌及肉瘤S180等癌细胞的增殖有显著的特异性的抑制作用，并提出抗癌作用机理，认为癌细胞在其增殖过程中，经人参皂苷Rh2作用，使癌细胞停止在一定地增殖期，并促使其逆转为正常细胞，称此为再分化(Reverse transformation)的诱导作用。
本发明人经过大量的试验研究，发现20(S)-人参皂苷Rh2和含有20(S)-人参皂苷Rh2的提取物具有显著的对阿霉素所致的心脏损伤的保护作用，是一个非常理想的降低阿霉素化疗毒性的药物。
【发明内容】
本发明提供了20(S)-人参皂苷Rh2在降低阿霉素所致心脏毒性的药物中的应用。
本发明提供了含有20(S)-人参皂苷Rh2的提取物在降低阿霉素所致心脏毒性的药物中的应用。
【具体实施方式】
制备例1：含20(S)-人参皂苷Rh2的提取物的制备。
以人参皂苷、西洋参皂苷、三七皂苷或上述3种植物药的茎叶总皂苷为原料，优选以西洋参皂苷原料，在反应釜中加入多元醇，多元醇可以是甘油或1，2-丙二醇，加热，加入上述皂苷，在搅拌条件下加入强碱。油浴电加热，当温度升至195～205℃时，停止加热，保持20～30分钟，然后反应物加入到5～30倍量水中，边加边搅拌，皂苷水解产物形成灰白色沉淀析出，静置，离心或过滤，干燥得碱降解产物。将碱降解产物用无水乙醇甲醇或含水乙醇，也可用甲醇或含水甲醇加热搅拌溶解，加入硅胶、氧化铝、硅藻土、活性炭中的任何一种或其混合物拌样，将拌好的样干燥，供层析分离用。将硅胶、氧化铝、硅藻土、活性炭任何一种固定项加到层析柱中，其用量为碱降解产物的10～40倍。拌好的样装在层析柱的上部，用含C1～C5的酯类、醇类、卤素类有机溶剂或其混和溶剂洗脱，如用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脱剂洗脱，收集富含20(S)-人参皂苷Rh2部分，回收溶剂，再经过醇类溶剂结晶，即得，含20(S)-人参皂苷Rh2部分85.6％。。
制备例2：含20(S)-人参皂苷Rh2提取物的制备
称取甘油50kg，加到反应釜中，开搅拌，称取西洋参茎叶总皂苷5kg，氢氧化钠5.5kg，依次加入反应釜中，升温速度控制约10～15℃/10min，当温度升至195～205℃时，停止加热，保持20～30分钟，然后反应物加入到15倍量水中，边加边搅拌，皂苷水解产物形成灰白色沉淀析出，静置，离心，用去离子水洗至滤液不显碱性，测提取物pH值在6.5，取出，干燥，得碱降解产物3.35kg。取碱降解产物0.50kg，用无水乙醇加热溶解，加入硅胶粉，混合拌样，将拌好的样干燥，粉碎，过筛，供层析分离用。称取200～300目层析硅胶12kg，加到层析柱中，拌好的样装在层析柱的上部，用氯仿∶甲醇(9∶1)洗脱剂洗脱，收集富含20(S)-人参皂苷Rh2部分，回收溶剂，获得物质A。高效液相色谱测定物质A中20(S)-人参皂苷Rh2含量为51.2％。
制备例3：含20(S)-人参皂苷Rh2提取物的制备
将制备例2中的物质A用乙醇结晶，获得物质B。高效液相色谱测定物质B中20(S)-人参皂苷Rh2含量81.3％。
制备例4：20(S)-人参皂苷Rh2单体的制备
将制备例3中的物质B用乙醇重结晶，获得物质C。高效液相色谱测定物质C中20(S)-人参皂苷Rh2含量97.5％。
试验例一、20(S)-人参皂苷Rh2拮抗盐酸多柔比星所致荷瘤小鼠心脏毒性的实验
1.药物及试剂：20(S)-人参皂苷Rh2原料粉末，按制备例4制备。临用前以0.5％的羧甲基纤维素钠配成相应浓度的混悬液。
注射用盐酸多柔比星，浙江海正药业股份有限公司产品，规格：10mg/支，批号：050905。
天冬氨酸氨基转移酶试剂盒 批号：020241
超氧化物歧化酶试剂盒 批号：20060418
血清肌酸激酶试剂盒 批号：20060421
脂质过氧化物试剂盒 批号：20060419
考马斯亮兰蛋白测定试剂盒 批号：20050401
以上试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供。
2.动物：昆明种小鼠，雌性，体重18～22g，山东省天然药物工程技术研究中心动物中心提供，许可证号：SYXK(鲁)20030020。
3.瘤株：小鼠U14宫颈癌瘤株，由中国医学科学院北京药物研究所药理室引进。
4.仪器：酶标仪(Synergy HT，BIO-TEK，美国)。FX-2111单道心电图机(北京福田电子医疗仪器有限公司)。
试验方法
小鼠50只，接种U14宫颈癌细胞后次日随机分组给药，分别为模型组、盐酸多柔比星组、20(S)-人参皂苷Rh2高、中、低剂量与盐酸多柔比星合用组，每组10只。除模型组外，分组后各组腹腔注射给予盐酸多柔比星2mg/kg，每两日给予一次，共给药4次。20(S)-人参皂苷Rh2各组于荷瘤后次日始每日灌胃给予20(S)-人参皂苷Rh2混悬液，连续给药7天。末次给药24小时，于安静环境下描记各组小鼠心电图(II导联)，计算小鼠心率及QRS复合波和Q-T间期。随后各组小鼠摘眼球取血，所取血样离心分离血清，测定血清肌酸激酶(CK)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。脱颈椎处死小鼠，摘取心脏，用滤纸吸干，称其湿重并于冰浴的条件下，按1∶10(W∶V)加入预冷的注射用生理盐水，匀浆，10000g×30min离心，取上清液测定膜脂质过氧化损伤产物丙二醛(MDA)含量和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。
试验结果
本试验中盐酸多柔比星导致荷瘤小鼠QRS复合波变宽，Q-T间期延长，心率变缓；20(S)-人参皂苷Rh2可剂量依赖性改善多柔比星所致的心脏功能损伤表现(表1)。荷瘤小鼠给予盐酸多柔比星可致血清中肌酸激酶(CK)以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平明显升高，同时心肌氧化损伤产物丙二醛(MDA)水平也明显升高。20(S)-人参皂苷Rh2可以有效降低盐酸多柔比星所致的荷瘤小鼠血液中肌酸激酶(CK)以及天冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性，降低MDA的水平，更明显地增加心肌组织内T-SOD活性(表2)。
表1 20(S)-人参皂苷Rh2对盐酸多柔比星致荷瘤小鼠心电图变化的影响(n＝10)
组别 剂量(mg/kg) 心率 次.min-1 QRS复合波 (ms) Q-T间期 (ms) 模型 盐酸多柔比星 20(S)-人参皂 苷Rh2 - 2 20+2 10+2 5+2 672±62 534±106** 664±45## 642±37## 572±75 13.8±1.06 19.2±2.05** 14.3±1.81## 14.6±1.66## 17.2±1.34# 19.0±0.87 23.2±1.47** 19.2±0.87## 19.3±1.24## 21.7±1.70
与模型组比较：**P＜0.01。与盐酸多柔比星组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。
表2 20(S)-人参皂苷Rh2对盐酸多柔比星致荷瘤小鼠心脏氧化性损伤的影响(n＝10)
组别 剂量(mg/kg) CK (U/ml) AST (U/ml) MDA (nmol/mg蛋白) T-SOD (U/ml) 模型 盐酸多柔比星 20(S)-人参皂 苷Rh2+盐酸多 柔比星 - 2 20+2 10+2 5+2 0.205±0.08 0.532±0.11** 0.211±0.08## 0.293±0.10## 0.451±0.09 224.4±77.0 288.8±104.1 140.4±49.8## 172.4±59.4## 192.5±51.7# 0.69±0.26 1.12±0.36** 0.61±0.15## 0.64±0.22## 0.95±0.17 109.4±46.5 252.4±39.0** 356.3±126.0# 326.5±52.8## 232.8±72.3
与模型组比较：**P＜0.01。与盐酸多柔比星组比较：#P＜0.05，##P＜0.01。
结论，20(S)-人参皂苷Rh2在20mg/kg-5mg/kg给药量条件下，与盐酸多柔比星(阿霉素)联合用药时对于盐酸多柔比星造成的小鼠的心脏损伤具有一定的保护作用。