利用重组酶/转座酶的改进的DNA免疫法 【技术领域】
本发明涉及DNA疫苗和佐剂领域。特别地，本发明涉及改进的利用包含表达盒的载体免疫/接种包括人类在内的动物或刺激其免疫系统的方法，所述表达盒编码一种或多种蛋白质/多肽抗原和/或佐剂以及介导DNA整合到动物的基因组里的重组酶。本发明还涉及包含新多肽—兔GMCSF的佐剂组合物，用于提高兔体内的抗体产量。
背景技术
利用疫苗免疫动物需要蛋白抗原的可重复生产，这是比较困难和昂贵的。免疫使用生物体、毒素或抗原的全部或者通常其部分来进行。为了在宿主体内维持一定水平的免疫性，需要施用高剂量地抗原，或者大多数情况下，需要施用重复剂量的抗原。另外，疫苗的开发严重受限于可在动物体内引发可用反应的有用抗原的可得性。利用佐剂来增强动物体内的免疫反应在本领域内是公知的。已有多种类型的佐剂得以应用，例如，矿物油或含油佐剂，如完全弗氏佐剂(FCA)、不完全弗氏佐剂、Ribi佐剂、Titermax等；来源于细菌的佐剂，如MDP(胞壁酰二肽)、脂质A、脂多糖(LPS)等；无机化合物，如磷酸铝、氢氧化铝和磷酸钙等；脂质体，与膜蛋白抗原复合的皂苷(免疫刺激性复合物)等等。多数佐剂有毒或引起轻度至重度的副作用，但也有一些只在宿主体内引起很弱的免疫反应。因此，开发安全和有效的佐剂是一项持续的挑战。佐剂开发中的一种较新的方法是利用生物免疫刺激性佐剂例如细胞因子作为佐剂。
基因免疫或称DNA免疫在本领域中是已知的，它利用编码目的抗原蛋白的基因或者DNA，而不是以多肽本身作为免疫原的来源。它基于制造容易、成本便宜的原料，还可以重复性地生产。宿主细胞摄取引入的DNA，并且通过正常的细胞机制表达编码的抗原。然后抗原与I类和II类MHC分子一起呈递在细胞表面上，在那里与免疫活性细胞接触，引起免疫反应。这样，无需增加最初的疫苗中抗原的量，也不需要反复地施用疫苗，免疫性的持续时间就可以延长。Manickan等，J Clin Invest 100：2371-2375(1997)报道了用编码一种单纯疱疹病毒(HSV)蛋白的裸露DNA免疫小鼠。Boyle等，Proc Natl Acad Sci USA 94：14626-14631(1997)报道了DNA免疫可诱发快速CTL反应，并且可产生比传统的蛋白免疫亲和力更高的抗体。
HIV/AIDS的DNA疫苗已经制成，并已在各种动物模型中，包括非人类灵长类中，以及人类临床试验中得到了检验。参见，例如，Robinson等，Ann NY Acad Sci Acad Sci 772：209-211(1995)；Yasutomi等，J Virol 70：678-681(1996)；MacGregor等，J Infect Dis 178：92-100(1998)。除了传染性疾病之外，人们还认为DNA免疫有可能作为癌症免疫疗法的手段(参见，例如，Srinivasan和Wolchok，J Transl Med 2：12(2004))。DNA疫苗还被推荐用于变态反应的治疗(参见，例如，Hartl等，Methods 32：328-39(2004))。
有若干因素影响DNA疫苗接种的结果，包括：免疫的方法和部位、免疫原的形式、免疫接种的给药方案、有无佐剂或生物佐剂如细胞因子的共同施用、其它共刺激分子的共同施用，DNA内有无免疫刺激序列(ISS)，等等。例如，人们观察到来自细菌而不是脊椎动物的DNA可以引起非特异性的免疫反应，这似乎是由于这两种基因组中非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)出现的频率存在差异。另外，人们发现，使用包含CpG和ISS序列的质粒DNA进行DNA接种，可以比使用不含ISS序列的相同疫苗诱导出更强的抗体和CTL反应。影响针对DNA接种的免疫反应其它重要因素有：所编码的抗原的形式，特别是抗原是否表达为细胞质蛋白或分泌蛋白；以及所编码的抗原和/或佐剂的表达水平。通常，表达的水平越高、越持久，免疫反应就越强。
通过许多不同的途径—包括静脉内、肌肉内、脾内和肝内途径—的DNA接种均已显示了成功。就抗体反应的产生而言，已经有很多研究报道说基因枪免疫接种比针注射的效率高得多，只需用少100至5000倍的DNA就可引起类似水平的抗体反应。施用DNA疫苗的最佳的给药方案(例如剂量、次数、和/或免疫接种频率)还远未确定，而且需要针对每种个别的抗原进行最优化。大多数的研究表明，为使免疫反应最大化，多次注射是必需的。
在通过DNA接种调节免疫反应的不同方法中，最有前途的方法可能是与生物佐剂例如细胞因子共同施用。GM-CSF基因是研究得最多的基因佐剂之一，它被证明是一种DNA接种后有效的免疫刺激物。当GM-CSF与其它的佐剂如FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)基因或IL-4基因组合使用时，观察到了额外的增强作用。最近，GM-CSF和Flt3L的组合被证实可使130种试验抗原的绝大多数(84％)在小鼠体内产生很高的抗体滴度；参见Chamber等，Nat.Biotechnol.21(9)：1088-92(2003)。
即使如此，DNA免疫接种还需要能够使所编码抗原蛋白和/或佐剂更高、更持久表达的更有效的方法。
发明概述
本发明涉及一种DNA免疫或接种动物或刺激其免疫系统的方法，它利用重组酶/转座酶介导的整合，将编码一个或若干抗原和/或佐剂的表达盒整合到受接种动物体内经转染细胞的基因组中；本发明还提供提高DNA免疫动物的抗体产量的佐剂组合物。
一方面，本发明提供一种新的佐剂序列，即如SEQ ID NO：1所示的兔GMCSF多肽。此外，本发明提供一种嵌合分子，其包含与异源氨基酸序列融合的SEQ NO：1的兔GMCSF多肽。在一个实施方式中，该异源氨基酸序列是表位序列。在另一个实施方式中，该异源氨基酸序列是免疫球蛋白序列。在该实施方式的另一方面，该免疫球蛋白序列是免疫球蛋白的Fc区域。
本发明还提供编码如SEQ ID NO：1所示的兔GMCSF多肽的核苷酸序列。此外，本发明提供载体或表达盒，其包含编码如SEQ ID NO：1所示的兔GMCSF多肽的核苷酸序列。
本发明还提供一种分离的宿主细胞，其由编码如SEQ ID NO：l所示的兔GMCSF多肽的核酸序列所转化。
另一方面，本发明涉及一种免疫或接种动物的方法，所述方法包括：(i)施用至少一种DNA构建体，其包含至少一种编码抗原的表达盒和第一重组位点；(ii)通过对所述动物施用至少一种佐剂刺激所述动物的免疫系统；以及，(iii)施用重组酶，该重组酶介导所述表达盒整合到包含第二重组位点的所述动物的基因组中，所述抗原在其中表达。
对于本发明的所有方面来说，佐剂可以是传统上使用的佐剂，也可以作为多肽或作为编码该佐剂的核酸而导入。当佐剂作为DNA导入时，本方法包括(i)将作为DNA构建体的佐剂施用到动物中，所述构建体包含编码佐剂的表达盒和第一重组位点；和(ii)介导所述表达盒整合到包括第二重组位点的动物基因组内的重组酶，所述佐剂在所述动物中表达。
在所有的情况下，优选的抗原包括但不限于：病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物抗原，以及与疾病如感染、炎症、癌症、哮喘/变态反应、自身免疫疾病、多发性硬化、脓毒症/中毒性休克(sepsis/toxic shock)、类风湿关节炎、同种异体移植物排斥、银屑病等等有关的抗原。在一个优选的实施例中，抗原是CD20。
在所有的情况下，优选的佐剂包括、但不限于：GMCSF，Flt3L，白细胞介素如IL-1α和β、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10，TNF-α，TNF-β，IFN-γ等，以及共刺激分子如TCA3、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD40配体(CD154)、MCP-1、MIP-1α、β、RANTES、等等。在一个优选的实施方式中，佐剂是如SEQ ID NO：1所示的兔GMCSF。
在一个实施方式中，编码抗原的表达盒和编码佐剂的表达盒是一个DNA构建体的部分。在另一个实施方式中，编码抗原的表达盒和编码佐剂的表达盒在不同的DNA构建体上。
在本发明的各种情况下，重组酶可以作为多肽施用，或者作为编码重组酶的RNA分子施用，或者作为包含编码重组酶的表达盒的DNA构建体施用。
在一个实施方式中，重组酶可以是由噬菌体表达的位点特异性重组酶。在该实施方式的另一个方面中，噬菌体重组酶可以从由φC31、噬菌体R4和TP901-1所组成的组中选择。
在另一个实施方式中，重组酶可以是选自Cre重组酶、Cre样(Cre-like)重组酶、Flp重组酶和R重组酶的位点特异性重组酶。
在另一个实施方式中，重组酶可以是转座酶或逆转录转座酶(retrorecombinase)。在另一个方面中，转座酶选自AC7、Tn5、Tn916、Tn951、Tn1721、Tn2410、Tn1681、Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn903、Tn501、Tn1000、Tn1681、tn2901、AC转座子、Mp转座子、Spm转座子、En转座子、Dotted转座子、Mu转座子、Ds转座子、En转座子和I转座子。在另一个方面中，所述转座酶是真核转座酶。
在一个实施方式中，第一和第二重组位点至少共有90％的序列同一性。在另一个实施方式中，第一和第二重组位点具有小于90％的序列同一性。在另一个实施方式中，第一个重组位点包含细菌基因组重组位点，且第二重组位点包含噬菌体重组位点。在另一个实施方式中，细菌基因组重组位点是attB，且噬菌体重组位点是attP。在另一个实施方式中，第一重组位点包含attB位点，且第二重组位点包含拟attP(pseudo-attP)位点。在另一个实施方式中，第一重组位点包含拟attB(pseudo-attB)位点，且第二重组位点包含attP位点。
在一个特定的实施方式中，重组酶介导的重组产生不再是重组酶底物的位点。
在本发明的一个实施方式中，DNA构建体可以是环状的。在另一个实施方式中，DNA构建体可以是线性的。
在一个特定的方面，本发明提供一种在动物中生成抗体的方法，包括：(i)施用至少一种编码抗原的DNA表达盒、重组位点、以及介导该DNA表达盒整合入动物基因组内的重组酶(administering at least one DNA expressioncassette encoding an antigen，a recombination site，and a recombinase thatmediates the integration of the DNA expression cassette into the genome of theanimal)；(ii)可选地施用至少一种佐剂；(iii)数天后从动物体内收集血清样品；(iv)从血清中鉴定并可选地纯化针对所施用抗原的抗体。
像前面所指出的那样，佐剂可以是传统上使用的佐剂，也可以作为多肽或作为编码佐剂的核酸导入。
在所有方面中，优选的动物包括人类和非人类动物，如兔、鸟类(例如鸡、火鸡、鸭、鹅，等等)、啮齿动物、牛、猪、绵羊、山羊和马。在一个优选的实施方式中，非人类动物是兔。
一组优选的非人类动物包括携带外源免疫球蛋白转座位(translocus)的非人类转基因动物。在一个实施方式中，非人类转基因动物是基因转化(geneconverting)动物。在一个优选的实施方式中，外源免疫球蛋白转座位是人源或人源化的免疫球蛋白重链和/或轻链序列。
附图简述
图1显示兔GMCSF的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2显示编码兔GMCSF多肽的核酸序列(SEQ ID NO：2)。编码序列突出显示。
图3显示兔GMCSF(SEQ ID NO：1)与来源于多种动物的其它GMCSF分子(SEQ ID NO：7-19)的序列比对。
图4显示一种表达质粒，它有三个表达盒，编码兔GM-CSF、兔FLT3-L和人CD20。该质粒还包含重组酶识别序列(RRS)，用于在重组酶介导下将表达盒整合入受转染细胞的基因组内。
发明详述
A.定义
除非另有定义，本发明所使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所通常理解的含义。Singleton等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology，2nd ed.，J.Wiley&Sons(New York，NY1994)；Lowrie和Whalen，DNA Vaccines：Methods and Protocols，Humana Press(1999)；Constantin A.Bona和Adrian Bot，Genetic Immunization，KluwerAcademic/Plenum Publishers(New York，NY 2000)；Koprowski和Weiner，DNA Vaccination/Genetic Vaccination，Springer(Berlin，New York，1998)；“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，2nd edition(Sambrook等，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；“Gene Transfer Vectors forMammalian Cells”(J.M.Miller&M.P. Calos编，1987)；和“Current Protocolsin Molecular Biology”(F.M.Ausubel等编，1987)为本领域技术人员提供了本申请中所用到的许多术语、方法和规程的一般指导。
本领域技术人员会认识到许多类似或等同于本发明所描述的方法和材料，其也可应用于本发明的实践中。当然，本发明决不仅限于所描述的方法和材料。对本发明来说，下列术语定义如下。
术语“免疫”(immunization)使用其最广泛的意义，指的是向体内导入抗原以刺激免疫性的产生。“DNA免疫”(DNA immunization)或“基因免疫”(genetic immunization)用编码一种或多种抗原和/或佐剂的DNA，而不是这些蛋白/多肽本身来产生和/或提高免疫性。
术语“接种”(vaccination)通常指的是向体内导入灭活的或减毒的病原体以促进保护性免疫。
在“DNA接种”(DNA vaccination)(也称作基因接种(genetic vaccination))中，向体内导入一种或多种不同病原体的一个或多个基因，而不是导入灭活或减毒的病原体。结果，可以同时针对同一病原体的多种变体，或者针对数种不同的病原体进行接种。
本发明中使用的术语“DNA构建体”指的是一种多核苷酸分子，它包含一个或数个目的结构基因、重组序列及其它对于保持、复制和选择该DNA构建体而言必需的DNA序列。DNA构建体可包含一个或多个下面所述的“表达盒”。DNA构建体可以是任何载体如质粒，任何病毒载体，包括但不限于：逆转录病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体，黏端质粒，等等。术语“逆转录载体”也指逆转录病毒或逆转录病毒粒子，其能够进入细胞并且将逆转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组内。DNA构建体可以是线性的，或者优选为环状的。
术语“表达盒”指一种多核苷酸分子，它包含一个或几个目的结构基因，这些结构基因可操作地连接于各自的调控序列，这些调控序列促进目的编码基因的表达；它还可选地含有其它DNA序列，这些序列编码多种功能所必需的区域，这些功能有例如适时表达、促进蛋白的适当折叠、抗原递呈细胞摄取、B细胞活化、T辅助细胞识别等等。在本发明的范围中，表达盒包括一个或多个抗原表达盒、佐剂表达盒、重组酶表达盒等等。
本发明中所使用的术语“重组酶”指的是这样的一组酶，它们可以促进两个确定位点—称作“重组位点”—之间发生重组，优选位点特异性重组，其中两个重组位点位于单个核酸分子内部且物理上分离，或者位于不同的核酸分子上。所述两个确定的重组位点并不一定完全相同。本重组酶的组中有几个亚家族，包括整合酶(例如，Cre、Cre样、FLP和λ整合酶)、解离酶/转化酶(例如、φ31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶)。术语“重组酶”还包括但不限于：原核或真核转座酶、病毒或果蝇copia样逆转座子，或非病毒逆转座子，包括哺乳动物逆转座子。典型的原核生物的转座酶包括可转座元件Tn1，Tn2，Tn3，Tn4，Tn5，Tn6，Tn9，Tn10，Tn30，Tn101，Tn501，Tn903，Tn1000，Tn1681，Tn2901等中编码的转座酶。真核转座酶包括果蝇mariner可转座元件、睡美人(sleeping beauty)转座酶、果蝇P元件、玉米Ac和Ds元件等中编码的转座酶。逆转录转座酶包括L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)、Minos等中编码的转座酶。转座酶也可以选自Mp、Spm、En、dotted、Mu、和I转座元件。
本文中使用的术语“野生型重组位点”指的是重组酶例如整合酶通常使用的重组位点。
“拟重组位点”(pseudo-recombination site)指的是这样的位点，重组酶可以在该位点促进重组，即使该位点可能不具有与野生型重组位点序列完全一致的序列。
在本发明的范围内，术语“第一重组位点”或“第二重组位点”可以是任何野生型或拟重组位点，例如，attB、attP、拟attB、或拟attP位点。
术语“重组酶介导的表达盒的整合”用于指在编码和表达的重组酶介导下进行的整合，该重组酶促进表达盒特异性地整合入细胞的基因组，而不是随机地整合。
“佐剂”是任何化合物或组合物，其目的是增强针对特定目的抗原的免疫反应。任何佐剂，不管它通过什么机制来增强免疫反应，都可用于本发明。
“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出与特定抗原的结合特异性，而免疫球蛋白既包括抗体，也包括其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后者的多肽被例如淋巴系统以低水平产生，被骨髓瘤以较高水平产生。
本文中使用的术语“非人动物”包括、但不限于：哺乳动物，例如，非人类灵长类、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、和非啮齿类动物，如兔、猪、绵羊、山羊、牛、犬、马和驴。还包括鸟(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅等等)。本发明使用的术语“非灵长类动物”指除了灵长类之外的哺乳动物，包括但不限于上面特别提到的哺乳动物。
术语“多核苷酸和”“核酸”可互换使用，并且，当用于单数或复数时，泛指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA，或经修饰的RNA或DNA。DNA可以来自基因组DNA、cDNA或通过基因合成来源。因此，举例来说，如本文定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA，包括单链和双链区域的DNA、单链和双链RNA、包括单链和双链区域的RNA、以及包含DNA和RNA的杂合分子，这些DNA和RNA可以是单链的，或者更典型地是双链的，或者包括单链和双链区域。另外，本文使用的术语“多核苷酸”是指包含RNA或DNA，或包含RNA和DNA二者的三链区域。这样的区域中的链可以来自相同分子或来自不同分子。该区域可以包括这些分子中一个或多个的全部区域，但更典型地只包括这些分子中的一些的区域。三螺旋区域中的一个分子通常是寡核苷酸。术语“多核苷酸”具体包括cDNA。该术语包括含有一个或多个修饰碱基的DNA(包括cDNA)和RNA。因此，为了稳定性或其它原因而进行了骨架修饰的DNA或RNA是“多核苷酸”，如该术语在本文中所意指的那样。另外，包含稀有碱基例如次黄嘌呤核苷，或包含修饰碱基例如氚化碱基的DNA或RNA，均包括在本文所定义的术语“多核苷酸”的范围内。一般地，术语“多核苷酸”包括所有未修饰多核苷酸的经过化学修饰、酶修饰和/或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括简单细胞和复杂细胞)的特征性DNA和RNA的化学形式。
B.发明详述
本发明涉及一种改进的对动物(例如哺乳动物，包括人类)进行DNA免疫或接种的方法。该方法使用编码抗原(例如源自病原体或其部分的蛋白，肿瘤抗原等)的DNA表达盒，而不是抗原本身，以产生持久的免疫性。还可以使用该改进的方法，利用基因佐剂，即由DNA表达盒编码的佐剂，来在动物中增强或刺激免疫性，以实现更持久的免疫性增强。本方法中，将编码抗原或佐剂的DNA导入，然后该DNA借助重组酶，优选位点特异性重组酶整合到动物的基因组中，其中所述重组酶促进所述DNA整合到基因组中。本发明进一步提供兔GMCSF佐剂的新的核酸和多肽序列。因此，举例来说，利用这种佐剂，可以在动物例如兔中产生抗体，包括人源化抗体。
更具体地说，抗原和/或佐剂表达盒的位点特异性整合包括施用(i)一种或数种环状DNA构建体，该构建体包含一种或数种编码抗原和/或佐剂的表达盒，以及为位点特异性重组酶所识别的第一重组位点；和(ii)位点特异性重组酶。利用下述的任何方法将DNA构建体施用给动物，从而转染细胞。经转染细胞的基因组包括该基因组固有的第二重组位点，第一和第二重组位点在重组酶的促进下发生位点特异性重组，使得DNA表达盒以更高的频率稳定地整合到动物的细胞基因组中。这样，重组酶介导的DNA接种方法使得所编码的抗原和/或佐剂蛋白表达水平更高，更持久。
在本发明的另一方面，该方法包括编码抗原的DNA。抗原DNA的来源包括但不限于：基因组DNA、cDNA或通过基因合成获得的序列。抗原的鉴定可以通过利用本领域公知的策略在全基因组范围搜索新的有用序列，或通过生物信息学筛选。
抗原DNA(antigenic DNA)是指来自感染性病原体，包括但不限于细菌、病毒、原生动物、衣原体、利什曼原虫(Leishmania)、弓形体(Toxoplasma)、疟原虫(Plasmodium)、真菌(包括酵母)等等，或者其抗原的一部分的DNA序列。
示例性的细菌抗原—在本发明中由它们的DNA所编码—包括：源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原、毒力因子例如α毒素的重组形式、黏附素结合蛋白(adhesin binding proteins)、胶原结合蛋白和纤连蛋白结合蛋白。示例性的细菌抗原还包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌(enterococccus)、肠杆菌(enterobacter)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、博德特氏菌属(Bordetella)(cya C和cyaA基因)的其它蛋白，等等。更多的示例性的细菌抗原包括但不限于：荚膜抗原的编码序列、外膜蛋白的重组形式、纤连蛋白结合蛋白、来自铜绿假单胞菌、肠球菌、肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌等等的抗原和毒素。
用于产生针对真菌的抗体的示例性抗原包括真菌的外膜蛋白，例如，白色假丝酵母(Candida albicans)、近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和Candida neoformans等的外膜蛋白。
编码序列可用于产生针对病毒的抗体的示例性抗原包括但不限于：病毒的包膜蛋白和病毒的减毒型，所述病毒包括但不限于流行性感冒病毒、HIV-1/2(特别是gag，pol，rev，nef和包膜蛋白如gp120、env等等)、狂犬病毒(rabies)、呼吸道合胞病毒(RSV)(特别是F蛋白)、丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)、巨细胞病毒(CMV)、EBV、轮状病毒、埃博拉病毒和HSV-1和2(单纯疱疹病毒)，等等。
在本发明的另一个方面，抗原还可以指这样的抗原，其引起抗体反应，其中所述抗体可用于治疗疾病如癌症。可用于制备治疗性抗体的示例性癌症相关抗原包括但不限于：用于结肠癌的癌胚抗原(CEA)和17-1A；用于皮肤T细胞淋巴瘤的T细胞受体Vb；用于乳癌的Her-2-neu抗原；用于B细胞淋巴瘤的CD19、CD20、CD22和CD53抗原；用于前列腺癌的前列腺特异性膜抗原(PMSA)；VEGF(通用)；用于卵巢癌的CA125；用于结肠直肠癌的EpCAM，等等。
抗原还可以指这样的抗原，其引起抗体反应，其中所述抗体可用于治疗癌症之外的其它疾病，这些疾病包括但不限于：哮喘/变态反应，示例性抗原如CD23、IgE、IL-5、IL-4，等等；自身免疫疾病，示例性抗原如糖基CD3(对于I型糖尿病)、CD3、CD4、CD40L(对于全身性红斑狼疮或狼疮)，等等；多发性硬化，示例性抗原如VLA-4、CD40L、CD11/18，等等；炎症和/或脓毒症/中毒性休克(inflammation/sepsis/toxic shock)，示例性抗原如TNFα和β、CD14，等等；类风湿性关节炎，示例性抗原如补体C5、TNFα和β、CD4等等；同种异体移植物排斥，示例性抗原如CD147、CD18、CD40L、β2整联蛋白、CD3、CD4、CD25、等等；银屑病，示例性抗原如IL-8、CD11a、E-选择蛋白、ICAM-3、CDS0、CD2、CD3；其中，如此导致的免疫反应可用于制备抵抗这些疾病的免疫疫苗。
抗原还可以指这样的抗原，其引起抗体反应，其中该抗体是对抗性(agonistic)或模拟性(mimetic)抗体，可用于治疗疾病，例如血小板减少。这里，模拟性抗体-anti-c-MPL设计为模拟负责血小板产生的TPO(促血小板生成素(thrombopoietin))的活性，因此可以作为治疗抗体。
在本发明的另一个方面，DNA接种方法使用佐剂。本发明的佐剂包括但不限于：传统上使用的佐剂，例如矿物油或含油佐剂，如完全弗氏佐剂(FCA)、不完全弗氏佐剂、Ribi佐剂、Titermax，等等；来源于细菌的佐剂，如MDP(胞壁酰二肽)、脂质A、脂多糖(LPS)等等；无机化合物如磷酸铝、氢氧化铝和磷酸钙等等；脂质体、与膜蛋白复合的皂苷(免疫刺激复合物)、细胞因子、共刺激分子、细菌DNA、CpG等等。
在一个实施方式中，本发明的佐剂是任何细胞因子，如GMCSF，IL-1α和β，IL-2，IL-12，IL-15，IL-18，IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，TNF-α，TNF-β，IFN-γ等等。在另一个实施方式中，佐剂是共刺激分子，如TCA3，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD40配体(CD154)，MCP-1，MIP-1α、β，RANTES，等等。
在本发明的另一个实施方式中，细胞因子或共刺激佐剂可以作为多肽、mRNA、或作为编码该佐剂或共刺激分子的DNA而施用。此外，也可以使用佐剂的组合或共同给予(co-delivery)多于一种佐剂。理想地，对于组合使用的佐剂，评价它们之间的协同作用以及它们引起体液免疫反应和细胞介导的免疫反应的联合能力，即使它们通过不同的途径给药。
在本发明的一个重要方面，该方法利用重组酶促进抗原和/或佐剂表达盒，乃至重组酶表达盒整合到动物的基因组中。位点特异的或随机的重组均可促成表达盒的基因组整合。在一个优选的实施方式中，该方法需要位点特异性重组酶来促进所述表达盒中的任一个在特异性位点整合进入动物基因组中。
位点特异性重组酶是具有酶活性的蛋白质，其催化两个DNA片断之间发生双链DNA的相互交换。这样的重组酶可识别发生交换的双方DNA中的特异性序列，并且可以单独作为蛋白起作用，也可以需要辅助因子的存在而起作用。尽管对于不同类型的位点特异性重组酶来说催化的机制可以是不同的，但不管其背后的机制如何，它们都包括在本发明中，并且适合于本发明的实践。
位点特异性重组酶典型地，但不是排他地，是原核生物的重组酶。位点特异性重组酶的两个最大的家族是λ整合酶样酶和解离酶/转化酶。这两个家族的成员在它们的氨基酸序列以及催化机制上有显著的差别。通过λ整合酶家族的成员进行的重组包括Holliday交叉中间体的形成和解离，在此期间DNA通过磷酸酪氨酸键短暂地连接到酶上。解离酶/转化酶家族的酶通过协同的、四链交错的断开和再接合(break and rejoining)机制而发挥活性，在此期间在酶和DNA之间形成磷酸丝氨酸键。
因此，举例来说，已经知道，宽宿主范围的链霉菌属(Streptomyces)温和噬菌体——ФC31的基因组可以在解离酶/转化酶位点特异性重组酶家族的一个成员酶的帮助下整合入宿主的染色体中。详情可参见以下文献，如，Thorpe和Smith，Proc.Natl.Acad Sci.USA，95(10)：5505-5510(1998)。噬菌体C31整合酶已经被证实可有效介导人细胞环境中染色体外载体的attB和attP噬菌体附着位点的整合。φC31和R4属于位点特异性重组酶的整合酶家族，而TP901-1属于扩展的(extended)解离酶家族。R4整合酶是来源于微小链霉菌(Streptomyces parvulus)R4噬菌体基因组的位点特异性单向(unidirectional)重组酶。位点特异性整合酶TP901-1是乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)噬菌体TP901-1所编码的。λ是一种感染大肠杆菌(E.coli)的温和噬菌体。该噬菌体具有一个供重组的附着位点(attP)，并且大肠杆菌细菌基因组也有一个供重组的附着位点(attB)。在本发明的范围中，野生型重组位点可以从同源系统中得来并可与异源序列相联系。因此，可以将attB位点置于其它系统中充当整合酶的底物。在一个实施方式中，重组酶可以催化细菌基因组重组位点(attB)和噬菌体基因组重组位点(attP)之间的重组，或者，第一位点可包含拟attB位点且/或第二位点可包含拟attP位点，反之亦然。在另一个实施方式中，重组酶介导产生不再是重组酶底物的重组位点(Groth等，Proc.Nat.Acad Sci.，2000，97：5995-6000；Olivares等，Nature Biotechnol.2002，20(11)：1124-8)；(Thyagarajan等，Mol.and Cell.Biol.，2001，21：3926-3934)；Hollis等，Repro.Biol.andEndocrinol.，2003，1：79。因此，在本发明中，重组酶可以是噬菌体编码的位点特异性重组酶，选自λ整合酶、φC31、TP901-1和R4。其它已知和常用的位点特异性重组酶包括Cre和FLP等等(参见，如Bouhassira等，Blood 88(Suppl.1)，190a(1996)；Bouhassira等，Blood90：3332-3344(1997)；Seibler&Bode，Biochemistry 36：1740-1747(1 997)；Seibler等，Biochemistry37：6229-6234(1998)；Bethke&Sauer，Nucl.Acids Res.25：2828-2834(1997))。Cre重组酶的靶标是一个34bp序列的loxP位点，它由两个颠倒的13bp Cre结合位点组成，这两个位点中间由8个碱基的间隔序列分隔，重组发生在该间隔序列内部(Hoess&Abremski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1026-1029(1984))。基于Cre/loxP的克隆系统是可商购的，例如，可购自BDBiosciences-Clontech、Palo Alto、California(CreatorTM)、或Invitrogen、Carlsbad、California (EchoTM)。Flp以frt位点为靶标。美国专利No.4,959,317中描述了利用Cre重组酶在真核细胞中进行DNA的位点特异性重组。美国专利No.6,632,672.中描述了利用位点特异性重组酶来转染真核细胞。美国专利No.4,673,640中描述了通用的位点特异性重组。
在另一个实施方式中，重组酶可以是转座酶或逆转录转座酶。转座酶(transposons)或逆转录转座酶是通过剪贴(cut and paste)机制催化其转座的酶，因此可用于转移或插入任何表达盒。它们提供非病毒的和非同源的方法，来将任何DNA序列插入或转移到多种物种的基因组中，包括脊椎动物如人类、鸟、啮齿动物等等。举例来说，果蝇元件mariner就被证实可将其自身转座到鸡种系中，Sherman等，Nature Biotechnol.，16：1050-1053(1998)。Yant等，Nature Genetics，25：35-41(2000)；Dupuy等，Proc.Nat.Acad.Sci.，99：4495-4499(2002)和Geurts等，Mol.Therapy，8：108-117(2003)已经证实，利用睡美人转座酶系统，转座子DNA在哺乳动物系统例如小鼠和人类基因组中实现了长期转基因表达或高效插入。其它转座酶如L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)、Minos已经被证实在脊椎动物物种中具有活性，因此可用于基因转移或作为插入诱变载体，Largaespada，David A.，Repro.Biol.and Endocrinol.，1：80(2003)。示例性的转座酶包括但不限于：原核或真核转座酶，病毒、果蝇copia样或非病毒逆转录转座酶，包括哺乳动物逆转录转座酶，等等。原核转座酶包括可转位元件Tn1，Tn2，Tn3，Tn4，Tn5，Tn6，Tn9，Tn10，Tn30，Tn101，Tn501，Tn903，Tn1000，Tn1681，Tn2901等中编码的转座酶。真核转座酶包括果蝇mariner、睡美人转座酶、果蝇P元件、玉米Ac和Ds元件等中编码的转座酶。逆转录转座酶包括因子L1、Tol2 Tc1、Tc3、Mariner(Himar 1)、Mariner(mos 1)、Minos等元件中编码的。转座酶也可以选自Mp、Spm、En、dotted、Mu和I转座元件。
在一个特定实施方式中，转座酶可以是选自AC7、Tn5、Tn916、Tn951、Tn1721、Tn2410、Tn1681、Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn9、Tn10、Tn30、Tn101、Tn903、Tn501、Tn1000、Tn1681、tn2901、AC转座子、Mp转座子、Spm转座子、En转座子、Dotted转座子、Mu转座子、Ds转座子、En转座子、I转座子等的转座酶。或者，也可以使用目标位点改变的转座酶或真核转座酶，如：果蝇P元件、果蝇mariner元件，或睡美人转座酶等等。
在另一个实施方式中，可以通过一种“滚动复制”(rolling replication)转座将编码抗原和/或佐剂的表达盒的多个拷贝插入到真核细胞基因组中。Tn1，Tn2，Tn3，Tn4，Tn5，Tn9，Tn21，Tn501，Tn551，Tn951，Tn1721，Tn2410和Tn2603是滚动复制类型的转座子的例子。
重组酶可以作为具有酶活性的蛋白质，或者以编码重组酶的重组表达质粒的形式施用。或者，重组酶的表达可以通过导入编码重组酶的信使RNA而实现。
因此，本发明涉及DNA接种方法，包括在转座酶介导下将编码一种或数种抗原和/或佐剂的表达盒整合到受接种动物的经转染细胞的基因组中。
根据本发明，编码抗原的核酸、重组酶和佐剂可以同时加入，或者以任何顺序加入。例如，编码抗原的DNA和佐剂可以在加入重组酶之前加入。或者，可以将重组酶在导入下述各项之前或同时导入受体细胞：包含所需一种或多种抗原的编码序列的表达盒，和/或所需佐剂的编码序列，以及重组酶特异性识别序列。或者，可以首先加入编码抗原、重组酶和重组酶特异性识别序列的核酸，然后加入佐剂或编码佐剂的DNA。
在一个实施方式中，重组酶作为mRNA导入细胞，例如，借助于显微操作器注射到雄性原核中。或者，可以通过编码重组酶的重组表达盒(例如质粒)将重组酶导入受体细胞。这样的质粒在本领域中是公知的，并且可以商购或者容易地制备，包括可商购的表达质粒pcDNA3和它的变体。Cre表达质粒也是可商购的，并且包括例如pBS185(CMV-CRE)(Clontech)。在另一个实施方式中，重组酶作为具有酶活性的蛋白质导入受体动物。
在本发明中，DNA构建体可以是任何载体，如：质粒，任何病毒载体，包括但不限于：逆转录病毒、腺病毒、慢病毒、黏端质粒、噬菌体等等。此外，DNA构建体可以是线性的，或者优选地是环状的。本发明的DNA构建体可以在一个构建体、两个或更多构建体，或在多个不同的个别构建体上编码抗原DNA、佐剂DNA和/或重组酶DNA。可以将每种DNA构建体同时施用给动物，或者，优选地，在导入并且表达抗原DNA表达盒后再施用佐剂构建体。本发明的DNA构建体可以进一步包括必要的DNA序列，例如，对于它的维持、复制、抗生素选择等而言必需的DNA序列。此外，DNA构建体可以编码多种功能性DNA序列，例如可引发更强烈的免疫反应的免疫刺激(ISS)序列，如CpG基序等等。
本发明的DNA构建体的施用途径包括注射、口服或鼻内送递等等，或通过本领域公知的任何其它途径，或通过例如以下文献所描述的途径：美国专利No.5,543,158、美国专利No.5,641,515、以及美国专利No.5,399,363，以上文献均并入作为参考，并且不管其通过何种机制引发免疫反应。注射可以是皮下注射、皮内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、脾内注射、透皮注射等等。注射本发明的DNA构建体的一种优选方法是借助基因枪。
可以将DNA作为裸露DNA施用给动物、也可以与脂质体转染(lipofection)试剂一起、与载体(carrier)一起，或者与任何已知的可增强细胞摄取DNA的组合物一起施用给动物，像例如美国专利Nos.4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；以及4,578,770所描述的那样，以上文献均并入作为参考。载体包括疫苗组合物起作用所必需的任何其它活性成分、任何溶剂、分散介质、赋形剂(vehicle)、包衣(coating)、稀释剂、抗细菌或抗真菌剂、缓冲剂、等渗溶液、吸收延迟剂(absorption delayingagent)、胶体、悬浮介质，等等。
待注射的DNA构建体的有效量随着例如以下因素而变化：抗原种类以及它的表达水平(需对于每种抗原标准化)、施用途径、大小(宿主的体重)、编码的抗原的形式，即抗原是细胞质蛋白、膜结合蛋白或是分泌蛋白，等等。要注射到动物中的DNA构建体的有效量或剂量，是指对于任何施用的抗原来说，有效地达到最佳免疫效果或免疫治疗效果的DNA量。例如，对于本发明某些抗原来说，每只动物每个Helios基因枪子弹约1μgDNA的注射剂量是最佳的，但也可以使用其它适当的剂量。DNA接种可以根据适当的计划表重复进行，这取决于所治疗的疾病类型、为维持保护性免疫水平所需要的剂量等等，这些可以由本领域技术人员常规确定。
除了编码目的结构DNA序列以外，表达盒还可以包含编码以下序列的序列：保证所编码的抗原的分泌的分泌前导序列；改善蛋白质可溶性和/或蛋白质折叠以增强抗原递呈细胞对该抗原的摄取的域(例如46残基的COMP域)、用于T辅助细胞依赖性B细胞活化的表位，等等。
本发明还进一步提供编码兔GMCSF蛋白质、多肽或多肽序列的核酸序列，它们可用作佐剂。GMCSF的表达可受到组成型活性启动子、组织特异性启动子或可诱导启动子的控制。
本文还认为给定的兔GMCSF核酸序列可表现为核酸序列具有轻微差别，但仍编码相同蛋白质的天然变体。此外，本发明所使用的术语“功能等价密码子”指的是编码相同氨基酸的密码子，例如编码精氨酸或丝氨酸的6个密码子(表1)，也可指编码生物学上等价的氨基酸的密码子，如本文中讨论的。
表1
氨基酸 密码子
丙氨酸 Ala A GCA GCC GCG GCU
半胱氨酸 Cys C UGC UGU
天冬氨酸 Asp D GAC GAU
谷氨酸 Glu E GAA GAG
苯丙氨酸 Phe F UUC UUU
甘氨酸 Gly G GGA GGC GGG GGU
组氨酸 His H CAC CAU
异亮氨酸 Ile I AUA AUC AUU
赖氨酸 Lys K AAA AAG
亮氨酸 Leu L UUAUUG CUA CUC CUG CUU
甲硫氨酸 Met M AUG
天冬酰胺 Asn N AAC AAU
脯氨酸 Pro P CCA CCC CCG CCU
谷胺酰胺 Gln Q CAA CAG
精氨酸 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
丝氨酸 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
苏氨酸 Thr T ACA ACC ACG ACU
缬氨酸 Val V GUA GUC GUG GUU
色氨酸 Trp W UGG
酪氨酸 Tyr Y UAC UAU
本发明中所用到的DNA片断包括生物学上功能等价的修饰多肽以及肽。这样的序列的产生可能是已知在核酸序列中及由此编码的蛋白质中天然存在的密码子冗余以及功能等价性的结果。或者，功能等价蛋白质或肽可以通过应用DNA重组技术而产生，在DNA重组技术中，基于交换的氨基酸的性质，可以对蛋白质结构的变化进行设计改造(engineer)。可以使用定点诱变技术引入人为设计的变化，来例如改进蛋白质的抗原性、减少蛋白质对接受该蛋白质的受试者的体内毒性作用、或者提高涉及该蛋白的任何治疗的效力。
考虑到遗传密码的简并性(表1)，本发明涵盖这样的序列：其有至少大约50％，通常至少大约60％，更通常大约70％，最通常大约80％，优选至少大约90％，最优选大约95％的核苷酸与SEQ ID NO：2的核苷酸一致。
术语“生物学上功能等价”是本领域普遍理解的，并在本文中得到了进一步详细的定义。由此，那些有大约70％至大约80％；或更优选地，大约81％至大约90％；更优选地，大约91％至大约99％的氨基酸与兔GMCSF多肽的氨基酸一致或功能等价的序列，只要保持了该蛋白质的生物活性。
本文中使用的术语“功能等价密码子”指的是编码相同氨基酸的密码子，例如编码精氨酸或丝氨酸的六个密码子，也指编码生物学上等价的氨基酸的密码子(表1)。
以下基于改变氨基酸而产生等价的、乃至改进的二代分子进行讨论。例如，蛋白质结构中的某些氨基酸可以为其它的氨基酸所取代，而不会显著损失与例如抗体的抗原结合区或底物分子上的结合位点等结构的相互作用结合能力。由于蛋白质的生物学功能活性是由蛋白质的相互作用能力以及蛋白质的性质所限定的，因此可在蛋白质序列中，以及作为其基础的DNA编码序列中进行某些氨基酸取代，而仍然生成与其性质类似的蛋白质。因此发明人认为在基因的DNA序列中可进行各种变化而不会对其生物学效用或活性造成明显损失，如下所述。表1显示了编码特定氨基酸的密码子。
在进行这样的变化时，可考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。亲水氨基酸指数对于赋予蛋白质相互作用的生物功能的重要性是本领域普遍理解的(Kyte&Doolittle，1982)。人们公认，氨基酸的相对亲水特性有助于形成蛋白质的二级结构，二级结构进而会决定蛋白质与其他分子，例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等等的相互作用。
本领域还知晓，根据亲水性可有效地进行类似氨基酸的取代。美国专利No.4,554,101(在此并入本文作为参考)称，蛋白质的最大局部平均亲水性由它邻近的氨基酸的亲水性所决定，与该蛋白质的生物学性质之间相互关联。如美国专利No.4,554,101中详述的，已经给氨基酸残基确定了以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
应当理解，一个氨基酸可以被另一具有类似亲水值的氨基酸取代，且仍然生成生物学上等价的以及免疫学上等价的蛋白质。在这样的改变中，所取代的氨基酸的亲水值在+-.2以内是优选的，在+-.1以内是特别优选的，更加优选的是在+-.0.5以内。
如本文所概括的，氨基酸取代通常根据氨基酸侧链取代基的相对类似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小，等等。考虑了前述各种的特性的典型取代对于本领域技术人员而言是熟知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
制备本发明的多肽的另一种实施方式是肽模拟物(mimetics)的利用。模拟物是模拟蛋白质二级结构元件的含肽分子(Johnson 1993)。利用肽模拟物的理论基础是：蛋白质肽骨架的存在，主要是为了确定氨基酸侧链的方向以促进分子间相互作用，如抗体和抗原之间的作用。可以预料，肽模拟物也与天然分子类似地容许分子相互作用。这些原则可以与上面概括的那些原则结合起来，用来设计改造具有佐剂的许多天然性质并且具有变化和改进的特性的第二代分子。
因此，编码兔GMCSF和兔GMCSF功能等价多肽的变体核酸序列在本发明中可用作佐剂。
在本发明的另一个方面，可以施用本发明的DNA构建体的动物包括、但不限于：哺乳动物(例如人类、非人类灵长类、啮齿动物(例如小鼠和大鼠)、非啮齿动物(例如兔、猪、绵羊、山羊、牛、猪、马和驴)、以及鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅等等)。可施用本发明的DNA构建体的动物包括“基因转化动物”，也就是那些通过基因转化和/或体细胞突变大量产生抗体多样性的动物(如兔、鸟、牛、猪，等等)，以及那些在生命早期，典型地，在生命的第一个月之内，抗体重排停止的动物(如兔、鸟、绵羊、山羊、牛、猪、马，等等)。
此外，可施用本发明的DNA构建体的动物还包括任何如上所述的非人类动物，其另外携带编码外源免疫球蛋白转座位的转基因，所述免疫球蛋白转座位优选是人源或人源化免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链序列或其部分。转基因位点可以是种系构型或者是重排的形式。由于转基因编码人源或人源化免疫球蛋白或其片段，它产生人源化的抗体。因此，举例来说，利用如上所述的重组酶介导DNA接种方法，可以利用本发明中描述的兔GMCSF佐剂在非人类动物对象中产生抗体，包括人源化抗体。
通过下面的实施例中援引的某些实施方式进一步说明本发明，但本发明决不仅限于这些实施方式。本领域技术人员可以理解，可以对本发明作各种修改而不对本发明实施的方式产生实质性变化。所有这样的修改都明确地包括在本发明的权利要求的范围之内。
实施例1兔GMCSF的克隆
用30-60ml PBS/2％FCS(Gibco；PET 10270098)灌洗ZIKA兔的腹膜腔，采集腹膜的巨噬细胞，并且洗涤两次。对细胞计数，把细胞铺在24孔板的一个孔中的DMEM/10％FCS中，密度是1-3×105细胞/孔，并用1μg/ml LPS大肠杆菌O111：B4(Sigma；L2630)在5％CO2保温箱中于37℃刺激5小时。收集细胞，用QIAAmpRNA-Mini-Mini-Kit(Qiagen)按照厂商说明书分离总RNA。
利用BD SMART RACE cDNA Amlification Kit(BD Biosciences)，按照厂商的规程，用3′-RACE CDS引物A(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VN-3′)(SEQ ID NO：3)对3-6μl总RNA进行逆转录。以引物对GMCSFup3(5′-aaggctaaggtcctgaggagg-3′)(SEQ ID NO：4)和10x通用引物A混合物(5′CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′(SEQ ID NO：5)和5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(SEQ ID NO：6)的混合物)为引物，利用Eppendorf Triple Master聚合酶与高保真缓冲液从第一链cDNA扩增兔GMCSF。PCR条件是：94℃变性50s，60℃退火50s以及在72℃延伸50s，35个循环。利用1.2％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。切下特异性带，用Gene Clean Turbo凝胶提取试剂盒(Bio101)抽提，克隆进TOPO TA克隆载体(Invitrogen)并测序(Agowa)。
实施例2通过基因接种在兔中产生抗CD20抗体
分离来自LPS刺激的兔腹膜巨噬细胞和淋巴细胞的信使RNA(mRNA)，并进行逆转录。利用PCR扩增兔GMCSF和Flt3L cDNAs。接着，把cDNAs克隆进表达质粒。合成编码人CD20可溶部分的cDNA，并将其克隆进同一表达质粒中。最终的构建体如图1所示。纯化质粒DNA并将其与等量的编码C31整合酶的质粒混合。按照厂家说明将质粒DNA涂覆于Helios基因枪子弹上(约1μg/子弹)。将兔适度地麻醉，于第0天和第14天射击每只耳朵。收集血液并使其凝结。通过离心收集血清。通过流式细胞术利用人外周血单核细胞检测抗CD20抗体。将进行兔GMCSF免疫和没有进行兔GMCSF免疫的动物进行对比，结果显示，用兔GMCSF免疫显著地提高了免疫反应。
序 列 表
<110>人类多细胞治疗股份有限公司(THERAPEUTIC HUMAN POLYCLONALS，INC.)
BUELOW，ROLAND
PLATZER，JOSEF
<120>利用重组酶/转座酶的改进的DNA免疫法
<130>39691-0013 PCT
<140>To Be Assigned
<141>Herewith
<150>US 60/636,361
<151>2004-12-14
<160>19
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>144
<212>PRT
<213>穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>1
Met Trp Leu Gln Asn Leu Phe Leu Leu Gly Ser Val Val Cys Thr Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr His Gln Pro Asn Thr Val Ser Gln Pro Leu Lys His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Arg Ile Ile Leu Ser Arg Ser Asn Asp
35 40 45
Ser Ala Ala Val Pro Gly Glu Met Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Pro Gln Lys Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Glu Arg Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln Asn Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Glu Thr Glu Phe Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Cys Phe Leu Phe Val Ile Pro Phe Asn Cys Trp Glu Pro Val Gln Lys
130 135 140
<210>2
<211>657
<212>DNA
<213>穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<400>2
aaggctaagg tcctgaggag gatgtggttg cagaacctgt tcctcctagg cagtgtggtc 60
tgcaccatct ctgcacccac ccaccagccc aacactgtca gccagccctt gaagcatgtg 120
gatgccatca aggaggcccg gatcatcctg agccgcagta acgattctgc cgctgtgccg 180
ggcgaaatgg tagaagtcgt ctctgaaatg tttgatcctc agaaaccaac ttgcctgcag 240
acccgcctgg aactgtacaa gcaaggcctg cggggcagcc tggagcggct ctcgagtacc 300
ctgactttga tggccagcca ctacaagcaa aactgtcccc caaccccgga aacttcctgt 360
gagaccgagt ttatcacctt caaaagtttc aaagagaacc tgaagtgctt tctgtttgtc 420
atccccttta actgctggga gccagtccag aagtgaggaa gcgcaggcta gccaggccag 480
ccctggttgt tgacctcaga gactactgct ctcccaccca aaagagccaa aaactcagga 540
tcttcgtgtt ggagggacca aggggccact gtggggacag catggacctg ccctggacca 600
cactgaccca gttatggacc tgccctggac cacactgacc cagttatgga cctgccc 657
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
aagcagtggt atcaacgcag agtact 26
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
aaggctaagg tcctgaggag g 21
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
ctaatacgac tcactatagg gc 22
<210>7
<211>144
<212>PRT
<213>人(Homo sapien)
<400>7
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg LeuLeu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Ash Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210>8
<211>141
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>8
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ile Thr Val Thr Arg Pro Trp Lys His
20 25 30
Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asn Leu Leu Asp Asp Met Pro Val
35 40 45
Thr Leu Asn Glu Glu Val Glu Val Val Ser Asn Glu Phe Ser Phe Lys
50 55 60
Lys Leu Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Ile Phe Glu Gln Gly Leu
65 70 75 80
Arg Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Thr Ala Ser
85 90 95
Tyr Tyr Gln Thr Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Asp Cys Glu Thr
100 105 110
Gln Val Thr Thr Tyr Ala Asp Phe Ile Asp Ser Leu Lys Thr Phe Leu
115 120 125
Thr Asp Ile Pro Phe Glu Cys Lys Lys Pro Val Gln Lys
130 135 140
<210>9
<211>144
<212>PRT
<213>猫属(Felis)
<400>9
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Asn Thr Val Val Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Ser Ser Pro Ser Ser Val Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Met Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Glu
35 40 45
Ile Thr Ala Val Met Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Pro Glu Glu Pro Lys Cys Leu Gln Thr His Leu Lys Leu Tyr Glu
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Ser Leu Lys Glu Pro Leu Arg Met
85 90 95
Met Ala Asn His Tyr Lys Gln His Cys Pro Leu Thr Pro Glu Thr Pro
100 105 110
Cys Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Asn Phe Lys Glu Lys Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Phe Asn Asn Pro Phe Asp Cys Trp Gly Pro Asp Gln Lys
130 135 140
<210>10
<211>146
<212>PRT
<213>马属(Equus)
<400>10
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Tyr Ser Met
1 5 10 15
Pro Ala Pro Thr Arg Gln Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Ile Met Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Thr Phe
50 55 60
Asp Ala Glu Glu Leu Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Ile Lys Leu Glu Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Leu Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Met Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Lys Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Phe Glu Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Ala Gln Lys
130 135 140
Leu Glu
145
<210>11
<211>144
<212>PRT
<213>猕猴属(Macaca)
<400>11
Met Trp Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Gly Thr Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Mal Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Ser Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210>12
<211>144
<212>PRT
<213>猪属(Sus)
<400>12
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Pro Pro Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asn Ser Asn Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Val Met Asn Glu Thr Val Asp Val Val Cys Glu Met Phe
50 55 60
Asp Pro Gln Glu Pro Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Asn Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Arg Leu Lys Ser Pro Leu Thr Leu
85 90 95
Leu Ala Lys His Tyr Glu Gln His Cys Pro Leu Thr Glu Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Glu Thr Gln Ser Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Asp Ser Leu Asn
115 120 125
Lys Phe Leu Phe Thr Ile Pro Phe Asp Cys Trp Gly Pro Val Lys Lys
130 135 140
<210>13
<211>144
<212>PRT
<213>狒狒属(Papio)
<400>13
Met Trp Leu Gln Gly Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala Arg Leu Pro Ser Pro Gly Met Gln Pro Trp Glu His
20 25 30
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Glu Met Asn Lys Thr Val Glu Val Val Ser Glu Met Phe
50 55 60
Asp Leu Gln Glu Pro Ser Cys Val Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Gln Ser Phe Lys Glu Asp Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
130 135 140
<210>14
<211>143
<212>PRT
<213>水牛属(Bubalus)
<400>14
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Pro Pro Ser Thr Val Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Gln Ser Ser Glu
35 40 45
Pro Asp Ala Gly Met Asn Asp Thr Glu Val Val Ser Glu Met Phe Asp
50 55 60
Ala Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys Lys
65 70 75 80
Gly Leu Gln Gly Ser Leu Thr Ser Leu Met Gly Ser Leu Thr Met Met
85 90 95
Ala Thr His Tyr Glu Lys His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys
100 105 110
Gly Thr Gln Phe Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asp Leu Lys Glu
115 120 125
Phe Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Ala Gln Lys
130 135 140
<210>15
<211>144
<212>PRT
<213>鹿属(Cervus)
<400>15
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Pro Ala Ser Pro Val Thr Arg Pro Trp Gln His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn His Ser Ser Asp
35 40 45
Thr Ala Ala Val Met Asn Glu Thr Val Glu Val Val Ser Glu Pro Phe
50 55 60
Asp Ser Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Lys Leu Tyr Lys
65 70 75 80
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Ser Leu Ser Gly Ser Leu Thr Met
85 90 95
Met Ala Arg His Tyr Glu Gln His Cys Pro Pro Thr Gln Glu Thr Ser
100 105 110
Cys Glu Thr Gln Thr Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
115 120 125
Asp Phe Leu Phe Ile Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Ala Gln Lys
130 135 140
<210>16
<211>145
<212>PRT
<213>沙鼠属(Meriones)
<400>16
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Phe Leu Ser Ile Val Val Tyr Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr His Ser Pro Ile Thr Val Thr Gln Pro Trp Lys His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Glu Lys Met Leu Lys
35 40 45
Ile Pro Ala Met Leu Asp Glu Asp Asp Val Asp Ile Val Ser Glu Glu
50 55 60
Phe Ser Val Gln Arg Pro Thr Cys Leu Gln Lys Arg Leu Lys Val Tyr
65 70 75 80
Glu Gln Gly Leu Arg Gly Asn Phe Thr Arg Phe Arg Gly Thr Leu Ala
85 90 95
Met Ile Ala Arg His Tyr Gln Lys Tyr Cys Pro Pro Thr Pro Glu Asp
100 105 110
Glu Cys Glu Thr Glu Val Thr Thr Phe Gly Asp Phe Ile Asp Ser Leu
115 120 125
Lys Asn Phe Leu Phe Asp Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln
130 135 140
Glu
145
<210>17
<211>145
<212>PRT
<213>豚鼠属(Cavia)
<400>17
Met Trp Leu Gln Asn Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Val Cys Ser Ile
1 5 10 15
Cys Ala Pro Thr Asp Leu Leu Ser Pro Val Thr Gln Ser Trp Lys His
20 25 30
Val Asp Ala Thr Ile Asn Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn His Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ala Ala Val Met Asn Glu Thr Val Glu Val Val Tyr Asp Gln
50 55 60
Phe Glu Pro Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Ala Leu Phe
65 70 75 80
Met Lys Gly Leu Arg Gly Asn Leu Thr Arg Leu Glu Gly Ser Leu Thr
85 90 95
Leu Met Ala Asn Phe Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr
100 105 110
Ser Cys Met Thr Gln Ile Ile Thr Phe Lys Ser Phe Lys Glu Asn Leu
115 120 125
Lys Arg Phe Leu Phe Ala Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln
130 135 140
Lys
145
<210>18
<211>141
<212>PRT
<213>棉鼠属(Sigmodon)
<400>18
Met Trp Leu Gln Phe Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Cys Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ala Ser Val Thr Arg Pro Trp Lys His
20 25 30
Val Asp Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ser Leu Leu Asn Asp Met Pro Ala
35 40 45
Met Glu Asn Glu Asp Val Asp Ile Val Ser Lys Glu Phe Ser Ile Gln
50 55 60
Arg Pro Thr Cys Val Gln Thr Arg Leu Lys Val Tyr Gln Gln Gly Leu
65 70 75 80
Gln Gly Asn Phe Thr Lys Leu Lys Gly Ala Leu Asn Met Met Ala Ser
85 90 95
His Tyr Gln Lys Asn Cys Pro Pro Thr Pro Glu Ile Asp Cys Glu Thr
100 105 110
Gln Val Thr Thr Phe Glu Asp Phe Ile Asp Asn Leu Lys Gly Phe Leu
115 120 125
Phe Asp Ile Pro Phe Asp Cys Trp Lys Pro Val Gln Lys
130 135 140
<210>19
<211>90
<212>PRT
<213>白足鼠属(Peromyscus)
<400>19
Met Trp Leu Lys Ile Leu Leu Phe Leu Gly Ile Val Val Cys Ser Phe
1 5 10 15
Ser Ala Pro Thr Arg Ser Pro Ala Pro Val Thr Gln Pro Trp Asn His
20 25 30
Val Glu Ala Ile Lys Glu Ala Leu Ile Leu Leu Asp Asn Ala Pro Asp
35 40 45
Ile Val Ser Glu Asp Glu Asp Val Glu Ile Val Ser Glu Glu Phe Ser
50 55 60
Val Gln Lys Cys Val Gln Glu Arg Leu Gln Leu Tyr Glu Lys Gly Leu
65 70 75 80
Arg Gly Asn Leu Thr Lys Leu Lys Gly Ala
85 90