干扰EV71病毒的新靶点及其小干扰RNA和应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102796734 A (43)申请公布日 2012.11.28 CN 102796734 A *CN102796734A* (21)申请号 201210162382.9 (22)申请日 2012.05.23 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/113(2010.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第四军医大学 地址 710032 陕西省西安市长乐西路 169 号 (72)发明人 张国成 邓军霞 徐志凯 雷迎峰 聂晓晶 许东亮 (74)专利代理机构 西安通大专利代理有。

2、限责任 公司 61200 代理人 陆万寿 (54) 发明名称 干扰EV71病毒的新靶点及其小干扰RNA和应 用 (57) 摘要 本发明公开了干扰 EV71 病毒的新靶点及其 小干扰 RNA 和应用， 所述的靶点包括下列区域 ： EV71 病毒基因组的 5 - 非翻译区的第 115 133nt 的区域 ； EV71 病毒基因组的 5 - 非翻译区 的第 648 666nt 的区域。针对两个新的靶点分 别提供了小干扰RNA， 对其转染到RD细胞后， 接种 EV71 病毒， 于感染后不同时间点倒置显微镜观察 细胞病变， 结果表明两对靶向 EV71 基因组 5 - 非 翻译区的 siRNAs 能够延缓。

3、及减轻 EV71 感染致 CPE。由于 5 - 非翻译区在病毒复制当中的必要 性和其高度保守的特性， 使得该对靶点具有更广 谱及有效的抗病毒作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 1 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 用于干扰 EV71 病毒复制的靶点， 其特征在于， 包括下列区域 ： EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 115 133nt 的区域 ； EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 648 666nt 的区。

4、域。 2. 如权利要求 1 所述的用于干扰 EV71 病毒复制的靶点， 其特征在于， 所述的第 115 133nt 的核苷酸序列为 ： cagcaaacca cgatcaata ； 所述的第 648 666nt 的核苷酸序列为 ： cagagcaatt gtttaccta。 3. 权利要求 1 所述的用于干扰 EV71 病毒复制的靶点作为设计小干扰 RNA 所针对的靶 点的应用。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述小干扰RNA用于抑制EV71病毒复制， 包 括针对两个区域其中之一小干扰 RNA 或者为两者的混合。 5.一种干扰EV71病毒复制的小干扰RNA， 其特征在于， 包括正。

5、义链和反义链， 其正义链 序列为 ： cagcaaacca cgaucaauat t， 反义链序列为 ： uauugaucgu gguuugcugt t ； 或 者 其 正 义 链 序 列 为 cagagcaauu guuuaccuat t，反 义 链 序 列 为 ： uagguaaacaauugcucugt t。 6. 权利要求 5 所述的干扰 EV71 病毒复制的小干扰 RNA 对抑制 EV71 病毒复制的应用。 7.权利要求5所述的干扰EV71病毒复制的小干扰RNA在制备抑制EV71病毒复制的药 物的制备的应用。 8. 如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述的干扰 EV71 病。

6、毒复制的小干扰 RNA 是 在经过修饰或结合于转运载体之后应用于抑制 EV71 病毒复制的药物的制备， 所述的修饰 包括 ： 核糖修饰、 磷酸骨架修饰、 碱基修饰 ； 所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、 细胞靶 向性配体、 纳米颗粒。 权 利 要 求 书 CN 102796734 A 2 1/7 页 3 干扰 EV71 病毒的新靶点及其小干扰 RNA 和应用 技术领域 0001 本发明属于 EV71 病毒复制抑制技术领域， 涉及干扰 EV71 病毒的新靶点及其小干 扰 RNA 和应用。 背景技术 0002 肠道病毒 71 型 （Enterovirus 71， EV71） 属于小 RNA 病毒科。

7、肠道病毒属成员， 其感 染性强， 致病性高， 已经在世界范围内有过十几次大的爆发和流行， 且引起越来越严重的中 枢神经系统症状， 严重危害婴幼儿的生命健康， 被喻为 21 世纪的脊髓灰质炎。目前临床缺 乏抑制病毒的特异性药物， 寻求新的药物治疗手段已成为世界范围内关注的热点。 0003 病毒为严格活细胞内寄生的微生物， 故抗病毒药物必须进入细胞， 并能选择性作 用于病毒， 但实际上， 病毒的复制过程与宿主细胞的生物合成过程相似， 两者难以区分， 故 很难获得能杀死或抑制病毒而又不影响细胞的药物。 0004 RNA 干扰技术的出现对选择毒性提出了可能， 为抗病毒研究提供了新思路。RNA 干 扰是。

8、RNA序列特异性转录后基因沉默现象。 由小干扰RNA （small interfering RNA,siRNA） 的反义链指导形成的 RNA 介导的沉默复合物在 siRNA 引导下与互补的 mRNA 结合， 降解靶基 因 mRNA， 有效特异性的抑制靶基因的表达。与以往抗病毒治疗的手段相比， RNA 干扰技术具 有显著的优势 ： RNA 干扰介导的抗病毒效应具有高度的特异性， 对非同源基因表达几乎没 有影响， 因此可将不良反应降到最小 ； RNA 干扰能高效抑制病毒复制， 少量的 siRNA 就可达 到降低病毒表达产物的作用 ； RNA 干扰可以针对病毒基因组保守区域发挥作用， 从而在一 定程。

9、度上限制了病毒产生逃避突变株的能力。因此， RNA 干扰所具有的对靶基因沉默作用 特异性、 高效性、 稳定性以及不改变宿主基因组等特性， 为 RNA 干扰在抗病毒治疗中的应用 提供了可能， 并决定了其用于治疗疾病时可以出现药效强、 不良反应小的特性。 设计合成靶 向 EV71 病毒基因组的 siRNAs 将可能成为抑制 EV71 病毒感染的有效途径。 0005 EV71 病毒基因组是由约 7408 个核苷酸组成的单股正链 RNA， 基因组 RNA 也是翻译 前蛋白的 mRNA 模板， 因此特别适合 RNA 干扰的治疗。选择合适的 siRNA 靶点是抗病毒治疗 关键一步。在 RNA 干扰治疗 E。

10、V71 病毒的国内外研究中， 几个实验室使用 RNA 干扰有效地阻 止了病毒的复制， 报道了 EV71 病毒基因组中 VP1、 3D、 3C、 2C、 3 - 非翻译区的有效靶序列。 发明内容 0006 本发明解决的问题在于提供干扰 EV71 病毒的新靶点及其小干扰 RNA 和应用， 在 EV71病毒基因组保守的5 -非翻译区寻找出新的靶点， 并针对该靶点设计小干扰RNA， 可应 用于 EV71 病毒复制的抑制。 0007 本发明是通过以下技术方案来实现 ： 0008 用于干扰 EV71 病毒复制的靶点， 包括下列区域 ： 0009 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 115 133n。

11、t 的区域 ； 0010 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 648 666nt 的区域。 说 明 书 CN 102796734 A 3 2/7 页 4 0011 所述的用于干扰 EV71 病毒复制的靶点， 其特征在于， 所述的第 115 133nt 的核 苷酸序列为 ： cagcaaacca cgatcaata ； 所述的第 648 666nt 的核苷酸序列为 ： cagagcaatt gtttaccta。 0012 所述的用于干扰EV71病毒复制的靶点作为设计小干扰RNA所针对的靶点的应用。 0013 所述小干扰 RNA 用于抑制 EV71 病毒复制， 包括针对两个区域其中之一小干。

12、扰 RNA 或者为两者的混合。 0014 一种干扰 EV71 病毒复制的小干扰 RNA， 包括正义链和反义链， 其正义链序列为 ： cagcaaacca cgaucaauat t， 反义链序列为 ： uauugaucgu gguuugcugt t ； 0015 或 者 其 正 义 链 序 列 为 cagagcaauu guuuaccuat t，反 义 链 序 列 为 ： uagguaaacaauugcucugt t。 0016 所述的干扰 EV71 病毒复制的小干扰 RNA 对抑制 EV71 病毒复制的应用。 0017 所述的干扰 EV71 病毒复制的小干扰 RNA 在制备抑制 EV71 病毒。

13、复制的药物的制备 的应用。 0018 所述的干扰 EV71 病毒复制的小干扰 RNA 是在经过修饰或结合于转运载体之后应 用于抑制 EV71 病毒复制的药物的制备， 所述的修饰包括 ： 核糖修饰、 磷酸骨架修饰、 碱基修 饰 ； 所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、 细胞靶向性配体、 纳米颗粒。 0019 与现有技术相比， 本发明具有以下有益的技术效果 ： 0020 本发明提供的用于干扰 EV71 病毒复制的靶点， 是 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区 的两个新的有效靶点， 由于 5 - 非翻译区在病毒复制中的重要性和其高度保守的特性， 使 其可能具有更广谱及有效的抗病毒作用， 而且 5 。

14、- 非翻译区靶点的提供及针对其设计的小 干扰 RNA， 使得与针对基因组编码区设计的其他有效 siRNAs 联合应用抑制可能存在的病毒 新的突变株或多株 EV71 成为可能。 0021 进一步， 本发明针对两个新的靶点分别提供了小干扰 RNA， 转染到 EV71 敏感的 RD 细胞后， 接种 EV71 病毒， 于感染后不同时间点倒置显微镜观察细胞病变， 结果表明两对靶 向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNAs 能够延缓及减轻 EV71 病毒感染致细胞病变效 应 （Cytopathic effect， CPE） 。 0022 同时这两对小干扰 RNA 能够显著降低感染细胞 EV。

15、71 mRNA 的转录水平， 能够显著 降低感染细胞释放子代病毒。另外， 随着 siRNA 转染浓度的增加， 抑制 EV71 病毒感染和复 制作用逐渐增强。 0023 针对所提供的新的靶点设计的 siRNAs 能够抑制 EV71 病毒的复制， 既表明了所筛 选的靶点的有效性又表明了所设计的 siRNAs 具有针对病毒基因组的分子治疗的前景， 而 且所设计的小干扰 RNA 具有高效、 特异、 低毒及具有量效关系的特性， 从而可应用于抑制病 毒复制的药物的制备。当然也不排除针对所提供的靶点进行 RNA 干扰， 设计出其他形式的 siRNA 或 shRNA 等对抑制病毒所具有的效果。 附图说明 00。

16、24 图 1 是荧光及流式细胞仪检测不同浓度的 siRNA 的转染。 0025 图 2 是 siRNA 对培养细胞的毒性分析图。 0026 图 3 是 siRNA 对 EV71 病毒感染致 CPE 的抑制作用。 说 明 书 CN 102796734 A 4 3/7 页 5 0027 图 4 是 siRNA 对感染细胞 EV71 mRNA 的转录水平影响。 0028 图 5-1 是 siRNA 对 EV71 感染细胞上清空斑形成的影响 ； 图 5-2 是不同浓度 siRNA 对 EV71 感染细胞上清病毒滴度的影响。 具体实施方式 0029 下面结合具体的实施方式对本发明做进一步的详细说明， 所。

17、述是对本发明的解释 而不是限定。 0030 1、 细胞培养和病毒株来源 0031 人横纹肌肉瘤细胞(Rhabdomyosarcoma， RD)为EV71敏感的宿主细胞， 由西安市疾 病控制中心惠赠， 常规生长在含 10% 胎牛血清 (Gibco BRL,Grand Island,NY， USA) 的 DMEM 培养基中。 0032 EV71 病毒株来自临床分离样本 （GenBank accession No.HM003207.1） ， 由西安市 疾病控制中心惠赠， 病毒在 RD 细胞上增殖， -80保存。 0033 2、 靶向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNA 序列的设计 。

18、0034 选择合适的 siRNA 靶点是抗病毒治疗关键一步。EV71 病毒基因组中 5 - 非翻译 区含有约 742 个核苷酸 （其核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.1 所示） ， 它通常折叠成多个特异性的 空间结构， 这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组 mRNA 的合成以及 病毒蛋白翻译过程中发挥重要作用。此外， 5 - 非翻译区还涉及病毒基因的宿主范围以及 毒力等多个方面的功能。尤其重要的是， 5 - 非翻译区在不同的 EV71 病毒株中高度保守。 0035 鉴于 5 - 非翻译区的保守性及在病毒复制中的重要作用， 针对 5 - 非翻译区的 siRNAs 可能具有更广谱及。

19、有效的抗病毒作用， 故以 5 - 非翻译区作为靶点的筛选区域。 0036 另外， EV71 病毒感染周期短， RNA 干扰不必要长期发生作用， 以免发生非特异性不 利影响， 化学合成的 siRNA 用于抑制 EV71 病毒复制是一个很好的策略， 且 siRNA 简单， 适合 进一步化学修饰应用于体内。 0037 靶向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNA 序列设计综合考虑 RNA 靶点可行 性、 双链 siRNA 热力学特性、 siRNA 设计原则等， 应用 siRNA 设计软件及二级结构预测软件 (http:/sfold.wadsworth.org/cgi-bin/sirna。

20、.pl and http:/www.genebee.msu.su/ services/na2_reduced.html)， 同时考虑针对 HM003207.1 设计的 siRNA 与 GenBank 数据库 中近5年来发布的具有全基因序列的中国流行的EV71病毒株对应序列的核苷酸同源性， 应 用 DNAStar program 进行比对， 筛选出 EV71 基因组 5 - 非翻译区的两个靶点区域 ： 0038 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 115 133nt 的区域 ； 0039 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的第 648 666nt 的区域。 0040 并分别针对这两个。

21、区域合成两对 siRNA（siRNA-1、 siRNA-2） ， 其中 siRNA-1 针对 第 115 133nt 的区域， 其双链序列如下 ： 0041 正义链序列为 ： cagcaaacca cgaucaauat t， 0042 反义链序列为 ： uauugaucgu gguuugcugt t ； siRNA-2针对第648666nt的区域， 其双链序列如下 ： 0043 正义链序列为 ： cagagcaauu guuuaccuat t， 0044 反义链序列为 ： uagguaaaca auugcucugt t ； 说 明 书 CN 102796734 A 5 4/7 页 6 0045。

22、 将siRNA-2序列打乱， 设计scrambled-siRNA （scr） 作为阴性对照。 同时将siRNA-2 进行FAM标记 （si-2FAM） 了解转染情况， 优化转染条件。 所有siRNAs均用BLAST(www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST) 确认其特异性， 排除与人及鼠基因的同源性。 0046 上述所有的 siRNAs 均按序列合成， 具体委托上海吉玛制药技术有限公司合成。 0047 3、 siRNA 转染 RD 细胞条件的优化 0048 利用荧光检测及流式细胞仪分析技术， 以带有 FAM 标记的 si-2FAM 来了解转染情 况， 优化转染条件， 测定转染效率。

23、。 0049 RD细胞以细胞数为3.2105/孔接种于6孔板， 24小时后待细胞生长达7080 时进行 siRNA 的转染。将不同浓度 (25、 50、 100nM) 的 si-2FAM 和 LipofectamineTM2000(In vitrogen,Carlsbad,CA,USA) 转染 RD 细胞， 具体操作按 LipofectamineTM2000 使用说明书 进行。另外设仅用 si-2FAM 处理， 未加入 LipofectamineTM 2000 的 RD 细胞作为对照。 0050 在 siRNA 转染后 5h， 换 2% 胎牛血清的 DMEM 培养基， 转染后 6h 细胞用 P。

24、BS 洗两次， 荧光显微镜观察 si-2FAM 的位置及浓度不同所引起的荧光变化。 0051 荧光观察完成后， 用 0.25% 胰酶消化 RD 细胞， 制备单细胞悬液， 0.5ml 固定液固定 后流式细胞仪检测荧光标记细胞的比例以精确测定转染效率。 0052 结果表明， 转染后 6h， FAM 标记的 si-2FAM 在 RD 细胞浆中可见， 随着 si-2FAM 浓度 的增加， si-2FAM 在 RD 细胞中的量相应增加 ； 而未加入 LipofectamineTM2000， 仅用 si-2FAM 处理的对照组未观察到荧光 ( 荧光观察结果如图 1 中的 A 部分所示 )。这表明在无转染试。

25、 剂的存在下 siRNA 不能单独转染到 RD 细胞中， siRNA 成功转染到 RD 细胞需要转染试剂的 参与。 0053 流式细胞仪检测结果如图 1 中的 B 部分所示， RD 细胞转染 25nM、 50nM、 100nM 的 si-2FAM， 转染效率分别为 79.471.79%、 87.732.67%、 97.170.86%。故选择 50nM 和 100nM siRNA 用于 RNA 干扰。 0054 4、 siRNA 对培养细胞的毒性 0055 RD 细胞以细胞数为 1.6104/ 孔接种于 96 孔板， 24h 后待细胞生长达 70 80 时转染 100nM 浓度的 siRNA-1。

26、、 siRNA-2， 转染后 24h、 48h、 72h 显微镜下观察 RD 细胞的形态 学变化， 然后每孔加入 MTT 溶液 (5mg/ml;Sigma,St.Louis， Mo， USA)20ul， 37孵育 4h 后， 小心吸弃孔内上清， 每孔加入 150ulDMSO, 振荡 10min， 选择 570nm 波长检测吸光值。 0056 MTT 法检测吸光值， 结果如图 2 所示， 在不同的时间点 （24h、 48h、 72h） ， 两对靶向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNAs 转染组 MTT 检测获得的吸光值均与未转染 siRNA 的对照组 (mock) 没有明显差别。

27、， 表明 siRNA 转染组的活细胞数与未转染 siRNA 的 mock 组 没有明显差别， 即高剂量的 siRNA 未影响细胞的生长及生存， 对培养细胞无明显毒性。 0057 5、 siRNA 转染和病毒感染 0058 RD细胞于37， 5%CO2培养箱中培养至80%-90%， 胰酶消化后加含10%胎牛血清、 无 抗生素的DMEM培养基， 以细胞数为8104/孔接种于24孔板， 24小时后待细胞生长达70 80时进行转染。 0059 转染前将培养基换为 500ml(Gibco BRL,Grand Island,NY， USA)， 然后不同量的 siRNA（30pmol、 60pmol）分别稀。

28、释于 50ul 的在另一只试管 说 明 书 CN 102796734 A 6 5/7 页 7 中 1ul 的 LipofectamineTM2000 也稀释于 50ul 的中， 室温下孵育 5 分钟后， 将 两种溶液轻轻混合， 室温下孵育 20 分钟， 使 siRNA:LipofectamineTM2000 复合物形成， 后每 孔加 100ul 的混合物， 通过轻柔前后摇晃培养板混和摇均， 使最终 siRNA 的浓度为 50nM 或 100nM。scr 组转染 scrambled-siRNA。mock 组除未加 siRNA， 一切同前。 0060 转染后 5h， 每孔接种 EV71 病毒稀释液。

29、 （MOI=0.01） ， 吸附 1 小时后弃病毒稀释液， 加入 500ul 含 2% 胎牛血清的 DMEM 培养基， 置于培养箱中， 于感染后不同时间点连续观察细 胞病变， 注意有无胞体圆缩、 折光特性改变、 间隙明显、 聚集、 脱落等病毒感染特征。收集细 胞裂解物及上清， -80保存备检。 0061 感染后 24 小时， 未转染 siRNA 的 mock 组细胞及 scr 转染组细胞出现 CPE， 表现为 细胞圆缩、 折光度增强 ； siRNA-1、 siRNA-2 转染组细胞未出现 CPE。感染后 36 小时， 50nM 浓 度的 siRNA-1 转染组细胞表现出轻微的 CPE。感染后 。

30、48 小时的观察结果如图 3 所示， 100nM 的 siRNA-1、 siRNA-2 转染组细胞表现出减轻或轻微的 CPE， 而 mock 组细胞及 scr 转染组细 胞出现完全的 CPE， 表现为细胞圆缩、 折光度增强、 间隙明显、 聚集、 脱落。 0062 siRNA-1能够延缓EV71病毒感染致CPE至感染后36小时。 siRNA-2能够延缓EV71 病毒感染致CPE至感染后48小时。 两对靶向EV71病毒基因组5 -非翻译区的siRNAs作用 持续时间均达感染后 72 小时。siRNA-2 对 EV71 病毒感染致 CPE 的抑制作用强于 siRNA-1。 另外， 随着 siRNA 。

31、转染浓度的增加， EV71 病毒感染致 CPE 明显减轻。两对靶向 EV71 病毒基 因组 5 - 非翻译区的 siRNA 能够延缓及减轻 EV71 病毒感染致 CPE。 0063 6、 siRNA 对感染细胞 EV71mRNA 的转录水平影响 0064 6.1RNA 的提取及定量 0065 EV71 感染后 36h， 24 孔板中各组细胞用 PBS 洗后， 每孔加入 150ulCelLyticTM M Cell Lysis Reagent(Sigma,St.Louis， Mo， USA)， 收集样本后采用Viral RNA Mini Kit(Qiagen,Valencia,CA,USA) 提。

32、取病毒 RNA。具体操作如下 ： a、 吸取 560ul 含 有 carrier RNA 的 buffer AVL 至 1.5ml 离心管中 ； b、 将离心后样本加入至装有 buffer AVL-carrier RNA 的离心管中， 充分混匀， 室温 （15 -25） 放置 10min， 后瞬时离心 ； c、 样 本中加入 560ul 无水乙醇， 充分混匀， 后瞬时离心 ； d、 吸取 630ul 上步中的液体小心的加入 到 column（已放入 2ml 收集管中） ， 盖上盖子， 8000rpm 离心 1min, 将 column 放入新的 2ml 收集管中， 弃去旧的收集管 ； e、 小。

33、心打开 column 的盖子， 重复第 6 步 ； f、 小心打开 column 的盖子， 加入 500ul buffer AW1， 盖上盖子， 8000rpm 离心 1min, 将 column 放入新的 2ml 收 集管中， 弃去旧的收集管 ； g、 小心打开 column 的盖子， 加入 500ul buffer AW2， 盖上盖子， 14000rpm 离心 3min ； h、 将 column 放入新的 2ml 收集管中， 弃去旧的收集管， 14000rpm 离心 1min ； i、 将column放入1.5ml离心管中， 弃去旧的收集管， 小心的打开column， 加入60ul室 温。

34、的 buffer AVE， 盖上盖子， 室温放置 1min， 8000rpm 离心 1min 洗脱病毒 RNA。RNA 定量时 将提取的 RNA 用 DEPC 处理水进行稀释， 紫外分光光度仪测定 OD260、 OD280 值， 计算 RNA 浓 度。 0066 6.2 逆转录、 PCR 扩增 0067 采 用 肠 道 病 毒 71 型 核 酸 扩 增 检 测 试 剂 盒 (Suoao Biomedtech Co.Ltd.,Beijing,China) 进行逆转录及 PCR 扩增。 0068 试剂盒中包含 ： 说 明 书 CN 102796734 A 7 6/7 页 8 0069 上游引物 ：。

35、 5 -GCAGCCCAAAAGAACTTCACT-3（2366-2386） 0070 下游引物 ： 5 -ATCTGCCACCCTATCTCCCT-3（2436-2455） 0071 及 TaqMan probe ： 5 -FAM-TGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGC-TAMRA-3 （2396-2420） 。 0072 根据说明书， 向反应管中每管加入 7ul EV71-RT MIX、 2ul RNA、 1ul 逆转录酶， 10000rpm 瞬时离心 30 秒， 将各反应管放入 PCR 仪器的反应槽中， 在 PCR 仪上进行以下逆转 录操作 ： 4230min， 后985mi。

36、n灭活逆转录酶。 接下来进行PCR扩增。 向反应管中每管加 入20ul EV71-PCR MIX、 2ul Taq酶系、 3ul处理后样本或10倍系列稀释EV71-阳性定量标准 品， 10000rpm 瞬时离心 30 秒， 将各反应管放入 PCR 仪器的反应槽中， 循环条件 ： 94 2min， 后 93 30s， 55 45s， 40 个循环。利用 10 倍系列稀释 EV71- 阳性定量标准品建立的标准 曲线定量 EV71 RNA。 0073 50nM、 100nM浓度的siRNA-1转染组与未转染siRNA的mock组相比， 感染细胞EV71 RNA 水平为 29.721.72%、 17.。

37、642.03%（图 4） 。50nM、 100nM 浓度的 siRNA-2 转染组与 mock 组相比， 感染细胞 EV71 RNA 水平仅为 16.842.30%、 6.801.04%（图 4） 。siRNA-2 抑制感染细胞 EV71 RNA 的作用优于 siRNA-1（图 4） 。随着 siRNA 转染浓度的增加， 感染细 胞 EV71RNA 水平明显下降 （#p0.05） ( 图 4)。两对靶向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNA 能够显著降低感染细胞 EV71 mRNA 的转录水平 ( p0.05)( 图 4)。 0074 7、 空斑形成实验 0075 为了解siR。

38、NA介导的细胞内抑制EV71病毒的复制是否影响子代病毒的释放， 病毒 感染 48 小时后收集各组细胞上清， 稀释至 10-4进行空斑形成实验， 测定病毒滴度。RD 细胞 在 6 孔板中生长成单层， 每孔加入 500ul 稀释至 10-4的各组细胞上清， 吸附 1 小时后弃孔 内稀释液， 每孔加入 3ml 含 1% 甲基纤维素的 DMEM 维持液， 37培养 3 天后小心吸弃孔内液 体， 福尔马林固定后， 1% 结晶紫溶液染色， 计数空斑。 0076 siRNA-1、 siRNA-2转染组与未转染siRNA的mock组相比， 能够明显减少空斑形成， 而且 siRNA-2 作用优于 siRNA-1。

39、， 结果如图 5-1 所示。随着 siRNA 转染浓度的增加， 病毒滴 度降低 （#p0.05） ， 两对靶向 EV71 病毒基因组 5 - 非翻译区的 siRNAs 能够减少感染细胞 释放子代病毒， 抑制空斑形成， 显著降低感染细胞上清病毒滴度(p0.05)， 结果如图5-2 所示。空斑形成实验结果与 siRNAs 对感染细胞 EV71 mRNA 的转录水平影响一致。 0077 鉴于上述两对 siRNAs 均能够延缓及减轻 EV71 病毒所致 CPE， 能够降低 EV71 病毒 mRNA 的转录水平以及减少感染细胞释放子代病毒， 抑制病毒的复制， 表现出抗病毒作用， 那 么这两对 siRNA。

40、s 就能够应用于抑制 EV71 病毒复制、 尤其是应用于抑制 EV71 病毒复制的药 物的制备。 0078 考虑到药物的制备时制剂的要求， 进一步在保留其序列的特异性的基础上对 siRNAs 进行修饰或结合于转运载体， 通过不同形式的修饰或转运达到提高 siRNA 的稳定 性、 减少脱靶效应以及免疫刺激反应、 提高 siRNA 的转运效率， 产生更稳定和更强的 RNA 干 扰效果， 更好的应用于体内。一般来讲， 所述的修饰包括 ： 核糖修饰、 磷酸骨架修饰、 碱基修 饰 ； 所述的转运载体包括细胞穿透性多肽、 细胞靶向性配体、 纳米颗粒。具体的修饰方式或 转运载体的选择可根据制剂的要求或效果来。

41、确定。 0079 进一步， 出于对病毒多靶点干扰的考虑， 在制备抑制 EV71 病毒复制的药物时是将 说 明 书 CN 102796734 A 8 7/7 页 9 siRNA-1、 siRNA-2 混合， 从而达到更广谱的病毒干扰作用。 0080 在上述两对 siRNAs 对抑制 EV71 病毒所表现的作用下， 由于 5 - 非翻译区在病毒 复制中的重要性和其高度保守的特性， 那么其所针对的两个靶点区域就成为了干扰 EV71 病毒复制的有效的靶点。 说 明 书 CN 102796734 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102796734 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102796734 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102796734 A 12 3/3 页 13 图 5-1 图 5-2 说 明 书 附 图 CN 102796734 A 13 。