一种产脂肽短小芽孢杆菌及其应用.pdf

本发明公开了一种产脂肽短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Y8A，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCCM 209108。本发明还公开了上述产脂肽短小芽孢杆菌在促进石油和/或功夫菊酯农药微生物降解过程中的应用。本发明的短小芽孢杆菌Y8A，能高效稳定的产生脂肽类生物表面活性剂，有效促进石油和/或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程。菌株Y8A本身的高效产脂肽功能可望作为新一代抗生素生产菌和促溶剂，广泛应用于农业、医药、化妆品和食品行业，与其它有机污染降解微生物一起可用于污染环境修复之中。该菌株能耐多种抗生素，发酵过程简单，操作容易。

1、  一种产脂肽短小芽孢杆菌，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Y8A，已保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO：M 209108。

2、  权利要求1所述的产脂肽短小芽孢杆菌在促进石油和/或功夫菊酯农药微生物降解过程中的应用。

3、  根据权利要求2所述的应用，其特征在于产脂肽短小芽孢杆菌的培养条件为：在LB培养基中，以蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖或麦芽糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺、Ca²⁺或Mn²⁺，pH5～12，在20～30℃培养至菌体浓度达到最大。

4、  根据权利要求3所述的应用，其特征在于产脂肽短小芽孢杆菌的培养条件为：在LB培养基中，以乳糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺或Ca²⁺，pH5～12，在20～30℃培养至菌体浓度达到最大。

5、  根据权利要求4所述的应用，其特征在于产脂肽短小芽孢杆菌的培养条件为：在LB培养基中，以乳糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺或Ca²⁺，pH7.5，在30℃培养至菌体浓度达到最大。

6、  根据权利要求3-5中任意一项所述的应用，其特征在于所述碳源浓度为10g·L^-1。

7、  根据权利要求3-5中任意一项所述的应用，其特征在于所述金属离子浓度为20mg·L^-1。

8、  根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将产脂肽短小芽孢杆菌Y8A与烷烃降解菌金黄杆菌属菌株和/或芳香烃降解菌氯酚鞘氨醇单胞菌菌株共同接种于石油污染的土壤或水域中，促进石油的微生物降解过程。

9、  根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将产脂肽短小芽孢杆菌Y8A与功夫菊酯降解菌蜡状芽孢杆菌属菌株共同接种于功夫菊酯农药污染的土壤或水域中，促进功夫菊酯农药的微生物降解过程。

一种产脂肽短小芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物工程领域，具体涉及一种产脂肽短小芽孢杆菌及其应用。
背景技术
石油的开采、运输、储存以及事故性泄漏等原因造成每年约有上千万吨石油烃进入环境，引起土壤、地下水、水系和海洋环境的严重污染，日益受到人们的关注。石油污染物进入水体后，不仅使水体的化学需氧量升高，同时水表层的油膜又阻止了空气中的氧向水中扩散，造成局部水域的厌氧状态，使水生动物因缺氧而死亡，水生植物的光合作用也会遭到破坏，给生态系统带来严重危害。石油泄漏渗入土壤，当量超过土壤的自净容量后，积累的油类物质将长期残留于其中，破坏土壤结构，影响土壤通透性，损害植物根部，阻碍根的呼吸与吸收，对土壤植物和土壤微生物生态系统，甚至地下水都产生危害，严重影响土壤生产力和农作物产量。治理石油污染已成为当今各国环境专家的研究热点。
98％以上的杀虫剂和95％以上的除草剂都没有作用到靶标生物上，而是到达了非靶标生物、进入土壤、空气、水和食物之中，破坏生态系统，引起人和动植物急性或慢性中毒。由于大多数农药(例如功夫菊酯等人工合成的拟除虫菊酯类杀虫剂)的水溶性较差、在生物降解过程中与微生物的接触表面积小，使得生物修复过程较慢，这也是农药生物降解周期长的一个主要因素。
最近十年来，一类新的由细菌非核糖体合成的脂肽类次生代谢物不断被发现和研究。细菌脂肽为既亲水又亲脂的两性分子，是功能强大的表面活性剂，能极大地降低表面张力与改变表面特性，因而在环境污染治理方面，特别是在石油和农药等难溶性污染物生物修复方面具有极大的应用潜力。已经发现芽孢杆菌能产生三类脂肽类次生代谢物：表面活性素类(Surfactins)是由一个手性为LLDLLDL的七肽与一个β-羟基脂肪酸(脂肪链长C13～C15)通过内酯键形成的环状结构；伊枯草素类(Iturins)是由一个手性为LDDLLDL的七肽和一个β-氨基脂肪酸(脂肪链长C14～C17)(βAA)形成的环状结构；丰原素类(Fengycins)是由一个手性为LDDDLDLLLL的十肽和一个β-羟基脂肪酸(脂肪链长C15～C17)通过内酯键形成环状结构。这三大类脂肽的手性和3D空间结构不同，性能也有差异，这是为什么不同菌种间产生的生物表面活性剂强度有差异的重要原因，因此筛选高效产脂肽菌株是一项十分重要的工作。细菌脂肽除了具有促进生物修复功能外，还能抑制病原微生物生长，与人工合成的抗生素相比，具有副作用小、靶标活性高的特点，属于一类新型抗生素。此外，由于对人体无毒，也可作为食品和化妆品的添加剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高效产脂肽的短小芽孢杆菌，所产生的脂肽能显著促进石油和/或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述短小芽孢杆菌在促进石油和/或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明人从山东胜利油田石油污染土壤中分离、筛选得到并保藏的短小芽孢杆菌新菌株为Y8A，其分类命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。
目前该菌株保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)；地址：武汉武汉大学；邮编：430072；登记入册的编号：CCTCC NO：M 209108；保藏日期：2009年5月18日。以此菌作为生产菌株。
CCTCC NO：M 209108菌株具有下述性质：
1、形态特征：
短小芽孢杆菌Y8A为杆状，大小为1.5～1.7μm×2.5～3.0μm，革兰氏阳性，能运动，有侧生鞭毛，产芽孢。LB固体平板上30℃培养48h，菌落呈淡黄色、圆形、不透明、边缘不平整、表面扁平、湿润粗糙。
2、生理生化特征：
短小芽孢杆菌Y8A的生理生化特性见表1。
表1菌株Y8A的生理生化特征

注：“+”：表示利用或呈阳性反应；“-”：即为阴性反应
3、16SrDNA序列分析
测得短小芽孢杆菌Y8A的16S rDNA序列长度为1471bp，具体见SEQ ID No.1所示。将所测序列在RDP数据库比对分析，选取数据库中相关的16S rDNA序列，采用Bioedit，MEGA3.1软件对Y8A进行系统发育分析，构建系统进化树。结果表明，菌株Y8A与短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)同源性达100％，再结合以上生理生化特性，将Y8A鉴定为短小芽孢杆菌，具体为短小芽孢杆菌Y8A(CCTCC NO：M 209108)。
4、生物表面活性剂的特性：
(1)生物表面活性剂的提取与定量分析
提取获得的短小芽孢杆菌Y8A产的生物表面活性剂粗品为浅黄色粉末状。短小芽孢杆菌Y8A生物表面活性剂的产量为5.05g·L^-1。
(2)表面活性剂的定性分析：
短小芽孢杆菌Y8A的生物表面活性剂粗品的薄层层析(TLC)检测：在硅胶板上点样不展层，产物经茚三酮显色剂显色后呈紫红色，初步判定菌株产生的是脂肽类生物表面活性剂。
短小芽孢杆菌Y8A产生的生物表面活性剂红外光谱检测：在FT-IR谱图上，3285～3295cm^-1是由分子链间氢键引起的NH收缩振动谱带，3070～3075cm^-1是NH基团的分子内氢键引起的NH伸缩谱带，1650～1655cm^-1、1534～1535cm^-1分别为酰胺谱带I和II。这些特征吸收表明该表面活性剂分子含有肽链。谱图上2960～2870cm^-1和1455～1380cm^-1的两处吸收峰是来自脂肪族碳链的C-H伸缩振动，1225～1231cm^-1和699cm^-1是内酯的特征吸收峰，表明该表面活性剂分子含有脂肪酸分子。因此，短小芽孢杆菌Y8A产生的生物表面活性剂属脂肽类。
(3)发酵液乳化性能测定：
将发酵液与石蜡混合后，每隔12h检测乳化体积的变化，连续监测48h，菌株Y8A的发酵液均能很好的乳化石蜡。Y8A发酵液在12h内，乳化体积维持在100％。随着时间的延长，乳化体积有所下降，但下降速度非常缓慢，Y8A发酵液在48h内乳化体积仍保持在80％。放置7d后，乳化体积仍可达到70％。因此，短小芽孢杆菌Y8A发酵液乳化性能稳定，增溶效果良好。
(4)临界胶束浓度(CMC)的测定：
将提取到的表面活性剂粗品分别稀释至10mg·L^-1，20mg·L^-1，30mg·L^-1，40mg·L^-1，50mg·L^-1，100mg·L^-1，200mg·L^-1后，测不同质量浓度的表面活性剂溶液的表面张力。随着表面活性剂质量浓度的增大，溶液的表面张力逐渐降低，降到23.4mN·m^-1后基本保持不变，计算菌株所产生物表面活性剂的CMC值为30mg·L^-1，比一般化学表面活性剂的CMC值(SDS 2120mg·L^-1，吐温20600mg·L^-1)低1～2个数量级，因此生物表面活性剂比一般的化学表面活性剂在性能方面更优越。
5、发酵培养基及发酵条件的优化：
(1)菌体生长与发酵液表面张力的关系：
菌株的生长量与发酵液表面张力呈反比，表面张力随着菌体生长而下降，菌体浓度达到最大时，表面张力达到最低，且在整个稳定期，发酵液的表面张力变化不大。菌株Y8A生长的延迟期为8h，8h后进入对数生长期，在22 h菌体浓度达到最大，与之相应的培养液的表面张力达到最小。
(2)不同碳源对菌体生长和产表面活性剂的影响：
在LB培养基中加入不同碳源(蔗糖，葡萄糖，乳糖，木糖，麦芽糖)，终浓度均为10g·L^-1。菌株Y8A在上述碳源中均生长良好，但加入乳糖能够明显降低菌株Y8A发酵液表面张力，最低达到28.6mN·m^-1。
(3)温度对菌体生长和表面活性剂产生的影响：
培养温度分别选取20℃，25℃、30℃、37℃，不改变其它发酵条件。30℃为菌株Y8A的最适生长温度，产生的表面活性剂量最大，发酵液表面张力值最低达到28.3mN·m^-1。但20℃和25℃时菌体生长和表面活性剂的产生也均较好，表明其具有较宽的温度适应范围。而37℃对菌体的生长影响不大，但对表面活性剂的产生影响很大。说明只在一定温度范围内，菌株Y8A的生长和合成表面活性剂的温度是相一致的。
(4)pH值对菌体生长和表面活性剂产生的影响：
将发酵培养基的初始pH分别调至4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10、11、12，其它发酵条件不改变。菌株Y8A在pH值为5～12范围内生长均良好，产生的表面活性剂使培养液的表面张力有显著降低，而且差异不大，但在pH4.0时，生长严重受到抑制。说明Y8A具有很宽的pH适应范围。
(5)通气量对菌体生长和表面活性剂产生的影响：
在250mL三角瓶中分别加入25，50，75，100，125，150mL发酵培养基，其它发酵条件不改变。菌株Y8A在装液量为50mL时生长最好，培养液的张力值最低，而在其他装液量时，生长和培养液的表面张力都略有下降。说明Y8A对通气量要求不高，能够在氧气含量较少的条件下很好生长并产生表面活性剂。
(6)金属离子对菌体生长和表面活性剂产生的影响：
在培养基中分别加入各种金属离子(Fe²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺)，使其终浓度均为20mg·L^-1。其它发酵条件不改变。20mg·L^-1Ca²⁺和Fe²⁺能够显著促进Y8A的生长和表面活性剂的产生，使发酵液表面张力降低，而20mg·L^-1Zn²⁺和Cu²⁺抑制Y8A的生长和表面活性剂的产生。20mg·L-1 Mn²⁺对Y8A的生长和表面活性剂的产生有轻微的促进作用。
(7)菌株对抗生素的抗性
以1％接种量分别将菌株Y8A的种子液接入抗生素浓度为10mg·L^-1的LB液体培养基中，30℃、170rpm培养24h。在供试的九种抗生素中，Y8A除了对庆大霉素没有抗性外，对其它八种抗生素均有抗性，见表2。
表2菌株Y8A对抗生素的抗性

注：“+”表示生长；“-”表示不生长
综上，本发明的产脂肽短小芽孢杆菌产脂肽的培养条件为：在LB培养基中，以蔗糖、葡萄糖、乳糖、木糖或麦芽糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺、Ca²⁺或Mn²⁺，pH5～12，在20～30℃培养至菌体浓度达到最大。优选培养条件为：在LB培养基中，以乳糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺或Ca²⁺，pH5～12，在20～30℃培养至菌体浓度达到最大。更优选的培养条件为：在LB培养基中，以乳糖为碳源，加入金属离子Fe²⁺或Ca²⁺，pH7.5，在30℃培养至菌体浓度达到最大，在此条件下，产脂肽能力达到最强。其中，所述碳源浓度为10g·L^-1，所述金属离子浓度为20mg·L^-1。
本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)Y8A(CCTCC NO：M 209108)，能高效产生脂肽类生物表面活性剂，将紧密粘附在土壤颗粒表面的强疏水性有机污染物分散、增加有机污染物降解菌与污染物的接触位点，因此可与其它有机污染物降解菌如石油和/或功夫菊酯农药降解菌联合使用，加快石油和/或功夫菊酯农药的降解过程。
优选的，将本发明的产脂肽短小芽孢杆菌Y8A与烷烃降解菌金黄杆菌属菌株和/或芳香烃降解菌氯酚鞘氨醇单胞菌菌株共同接种于石油污染的土壤或水域中，促进石油的微生物降解过程。
优选的，将本发明的产脂肽短小芽孢杆菌Y8A与功夫菊酯降解菌蜡状芽孢杆菌属菌株共同接种于功夫菊酯农药污染的土壤或水域中，促进功夫菊酯农药的微生物降解过程。
有益效果：本发明筛选到的短小芽孢杆菌菌株Y8A(CCTCC NO：M 209108)，能高效稳定的产生脂肽类生物表面活性剂，能够有效促进石油和/或功夫菊酯农药降解菌的生物降解过程。菌株Y8A本身的高效产脂肽功能可望作为新一代抗生素生产菌和促溶剂，广泛应用于农业、医药、化妆品和食品及化工行业，与其它有机污染降解微生物一起可用于污染环境修复之中。该菌株能耐多种抗生素，发酵过程简单，操作容易。
附图说明
图1本发明的短小芽孢杆菌Y8A的电镜负染照片。
图2本发明的短小芽孢杆菌Y8A在血平板上的溶血情况(左边)，与之对照的是本实验室分离筛选到的另一株产脂肽不动细菌属菌株[Acinetobacter sp.BHSN(EU293155)]。
图3本发明的短小芽孢杆菌Y8A发酵液的乳化效果(左边)，与之对照的是本实验室分离筛选到的另一株产脂肽不动细菌属菌株[Acinetobacter sp.BHSN(EU293155)]。
图4本发明的短小芽孢杆菌Y8A产生的生物表面活性剂的红外吸收光谱图。
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
在LB培养基中加入20mg·L^-1 Fe²⁺和Ca²⁺能显著促进Y8A的生长和表面活性剂的产生；10g·L^-1的乳糖能显著促进表面活性剂的产生；菌株Y8A在20～30℃，pH5～12范围内生长和产生表面活性剂的能力均较强；在容量为250mL三角瓶中，液体种子按1％接种量接于50mL LB培养基中(加入10g·L^-1乳糖、20mg·L^-1 Fe²⁺和Ca²⁺，pH7.5)，30℃下170rpm摇床培养24h。发酵结束后测定菌体发酵液的表面张力值，该值最小可达到23.5mN·m^-1。
实施例2：
取石油污染土壤风干后过筛混匀，121℃灭菌30min，烘干。分为六组进行对比试验，每组设计三个平行：(A)加入产脂肽菌株Y8A菌液，(B)加入烷烃降解菌金黄杆菌属菌株(Chryseobacterium sp.ATCC 11642)，(C)加入芳香烃降解菌氯酚鞘氨醇单胞菌菌株(Sphingomonas chlorophenolica ATCC 39723)菌液，(D)加入Y8A和金黄杆菌属菌株菌液，(E)加入Y8A和氯酚鞘氨醇单胞菌菌液，(F)加入Y8A、金黄杆菌属菌株和氯酚鞘氨醇单胞菌菌液。接菌量均为1.1×10⁸个·g^-1，混匀，以不加菌液土壤为对照(CK)。容器表面覆盖塑料薄膜，扎孔通气，30℃培养30d，采用重量法测定土壤中原油残留量。试验结果如表3。
表3  Y8A对石油污染生物修复的促进作用

实施例3：
在1/10LB含功夫菊酯(终浓度为100mg·L^-1)培养基中同时接入功夫菊酯降解菌蜡状芽孢杆菌菌株(Bacillus cereus ATCC7039)和本发明的产脂肽菌株Y8A，接种比例为1∶1，接种量均为1％，在不同时间分别测定发酵液OD₆₀₀和功夫菊酯残留量。与蜡状芽孢杆菌菌株单独培养时，菌体的生长和对功夫菊酯降解率相比，混合培养时，功夫菊酯降解速度明显加快，34小时达到最大降解量，比未加Y8A提前了7个小时，降解过程缩短了近1/6。培养2天后的测定结果表明，在功夫菊酯降解菌蜡状芽孢杆菌单独培养时，功夫菊酯的降解率为38.7％，蜡状芽孢杆菌和Y8A共同培养时，功夫菊酯的降解率显著提高到87.7％，因此Y8A能显著地促进农药的生物降解。
SEQUENCE LISTING
<110>南京农业大学
<120>一种产脂肽短小芽孢杆菌及其应用
<130>njau090521
<160>1
<170>PatentIn version                                              3.3
<210>1
<211>1471
<212>DNA
<213>短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)
<400>1
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