一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104293829 A (43)申请公布日 2015.01.21 CN 104293829 A (21)申请号 201410555974.6 (22)申请日 2014.10.20 C12N 15/84(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 广东省农业科学院果树研究所 地址 510640 广东省广州市天河区五山大丰 二街 80 号 (72)发明人 程春振 钟云 闫化学 钟广炎 姜波 曾继吾 张永艳 蒋侬辉 胡敏伦 周璧容 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 江裕。

2、强 何淑珍 (54) 发明名称 一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基 因方法 (57) 摘要 本发明公开了一种以柑橘土播实生幼苗为材 料的快速转基因方法， 包括外植体的准备， 农杆菌 侵染液的准备， 实生幼苗的创伤感染， 和拟转化芽 的分子生物学鉴定 ； 所述外植体的准备直接以土 播实生幼苗为外植体， 即直接以土播实生幼苗为 外植体转化出转基因植株。本发明上述方法不需 要准备试管砧木苗， 不用转接拟转化芽， 直接在土 播实生幼苗上创伤转化出芽， 且在温室中土播种 子不受气候与天气影响， 也可周年进行， 具有操作 步骤简便、 成本低、 时间短的优点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页。

3、 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104293829 A CN 104293829 A 1/1 页 2 1. 一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法， 包括外植体的准备， 农杆菌侵 染液的准备， 实生幼苗的创伤感染， 和拟转化芽的分子生物学鉴定， 其特征在于直接以土播 实生幼苗为外植体。 2. 如权利要求 1 所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法， 其特征在于 ： 所述土播实生幼苗的准备包括 ： 选 7 成熟以上的柑橘果子取种子或用市售的柑橘种子， 洗 泡后直接播种于温室营养土中促。

4、发芽， 温室温度为 28-30。 3. 如权利要求 1 所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法， 其特征在于 ： 所述农杆菌侵染液的准备即携带有 pFGC5941 载体的农杆菌侵染液的制备步骤包括 ： 将农 杆菌在含有10-15mg/L Basta的LB培养基上划线， 28暗培养2天后挑取单克隆涂板， 28 暗培养 2 天后用液体 MS 液体培养基洗下菌落， 再用不含抗生素的浓度 100M 乙酰丁香酮 的 MS 液体培养基 28震荡培养 1-2 小时后调 OD600至 0.5-1.0， 用于侵染。 4. 如权利要求 1 所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法所述， 其特征在 于。

5、 ： 所述实生幼苗的创伤感染包括 ： 柑橘种子播种后， 待实生苗长有 2-4 片嫩叶时， 从第一 片叶基部下面切除幼苗的带叶上部， 然后用 parafi lm 封口膜紧绕切口部包成一漏斗形， 漏 斗形上大下小， 在漏斗形口滴入农杆菌侵染液， 使创伤口浸泡在菌液45分钟到1小时， 用滤 纸吸干菌液， 用漏斗形的 parafi lm 封口膜包压切口保湿， 然后用黑膜覆盖暗培养 3 天后， 除 去 parafi lm 封口膜， 用 10-15mg/L Basta 溶液擦拭创伤口 2-3 次， 使创伤口处带有 Basta 溶 液， 用封口膜包紧创伤口 ； 用黑膜覆盖处理苗 10-20 天， 待发出黄色。

6、不定芽时， 揭去黑膜， 使 幼苗及不定芽见光培养生长。 5. 如权利要求 1 所述的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法所述， 其特征在 于 ： 所述拟转化芽的分子生物学鉴定包括 ： 实生幼苗经创伤感染步骤后， 待拟转化芽长有 2-3 片时， 取部分叶提取 DNA， 以 pFGC5941 载体 Bar 基因引物进行 PCR 检测， 长有 5 片叶以 上时， 进行多次 PCR 复检， 获得转基因植株 ； 所述 Bar 基因引物序列为 Bar F ： TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC ； Bar R ： GCT GCC AGA AAC CCA CGT CAT ； 。

7、目标片段 433bp。 权 利 要 求 书 CN 104293829 A 2 1/3 页 3 一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法 技术领域 0001 本发明涉及一种柑橘的快速转基因方法， 具体涉及一种以柑橘土播实生幼苗为材 料的快速转基因方法， 它主要应用于柑橘类种质创新。 背景技术 0002 柑橘种质创新所应用的转基因方法很多， 实验室中主要用根癌农杆菌介导的转化 法， 所用的外植体很多， 有无菌实生菌的上胚轴切段、 子叶、 成年态茎段及田间成年树腋芽 等。利用无菌实生菌上胚切段、 子叶切块的遗传转化率频率较高， 但外植体需无菌培养， 成 本也高 ； 成年茎段的出芽率及转化率极低。。

8、李卫等发表的 柑桔基因转化新方法的研究 （ 植物学报 ,1997,39(8):782-784） 中是以田间成年树腋为外植体， 转化率仅为 5.26%， 这 种方法有离体扩繁鉴定， 增加了组培的成本。陈善春等 2009 年申请了一项专利 ： 一种柑桔 的转基因方法 （申请号 ： 200910104100.8） ， 这种方法需要准备无菌试管砧木及嫁接苗的制 备， 增加了准备步骤与成本。 发明内容 0003 本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足， 提供一种经济、 简便、 快速且转 化率高的以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法。 0004 实现本发明目的技术方案是 ： 一种以柑橘土播实生幼苗。

9、为材料的快速转基因方法， 包括外植体的准备， 农杆菌侵染 液的准备， 实生幼苗的创伤感染， 和拟转化芽的分子生物学鉴定 ； 所述外植体的准备直接以 土播实生幼苗为外植体， 即直接以土播实生幼苗为外植体转化出转基因植株。 0005 进一步优化实施地， 所述土播实生幼苗的准备包括 ： 选 7 成熟以上的柑橘果子取 种子或用市售的柑橘种子， 洗泡后直接播种于温室营养土中促发芽， 温室温度为 28-30。 0006 进一步优化实施地， 所述农杆菌侵染液的准备即携带有 pFGC5941 载体的农杆菌 侵染液的制备步骤包括 ： 将农杆菌在含有 10-15mg/L Basta 的 LB 培养基上划线， 28。

10、暗 培养 2 天后挑取单克隆涂板， 28暗培养 2 天后用液体 MS 液体培养基洗下菌落， 再用不含 抗生素含有 100M 的乙酰丁香酮的 MS 液体培养基 28震荡培养 1-2 小时后调 OD600至 0.5-1.0， 用于侵染。 0007 进一步优化实施地， 所述实生幼苗的创伤感染包括 ： 柑橘种子播种后， 待实生苗长 有2-4片嫩叶时， 从第一片叶基部下面切除幼苗的带叶上部， 然后用parafi lm封口膜紧绕切 口部包成一漏斗形， 漏斗形上大下小， 在漏斗形口滴入农杆菌侵染液， 使创伤口浸泡在菌液 45 分钟到 1 小时， 用滤纸吸干菌液， 用漏斗形的 parafi lm 封口膜包压切。

11、口保湿， 然后用黑膜 覆盖暗培养 3 天后， 除去 parafi lm 封口膜， 用 10-15mg/L Basta 溶液擦拭创伤口 2-3 次， 使 创伤口处带有 Basta 溶液， 用封口膜包紧创伤口 ； 用黑膜覆盖处理苗 10-20 天， 待发出黄色 不定芽时， 揭去黑膜， 使幼苗及不定芽见光培养生长。 0008 进一步优化实施地， 所述拟转化芽的分子生物学鉴定包括 ： 实生幼苗经创伤感染 说 明 书 CN 104293829 A 3 2/3 页 4 步骤后， 待拟转化芽长有 2-3 片时， 取部分叶提取 DNA， 以 pFGC5941 载体 Bar 基因引物进行 PCR 检测， 长有 。

12、5 片叶以上时， 进行多次 PCR 复检， 获得转基因植株 ； 所述 Bar 基因引物序列 为 Bar F ： TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC ； Bar R ： GCT GCC AGA AAC CCA CGT CAT ； 目标片段 433bp。 0009 上述方法不需要准备试管砧木苗， 不用转接拟转化芽， 直接在土播实生幼苗上创 伤转化出芽， 且在温室中土播种子不受气候与天气影响， 也可周年进行， 所以本方法操作步 骤简便、 成本降低、 时间更短。本发明还具有如下优点和技术效果 ： 1、 在土播实生幼苗的准备上， 种子不用剥皮、 不用消毒， 直接播到营养土中，。

13、 生长快、 成 本低、 可周年进行。 0010 2、 选生长约 1 月的实生幼苗为起始材料， 这种苗带 2-4 片嫩叶， 叶基部还未木质 化， 有利于转化 ； 3、 在转化过程中， 创伤切口用 parafi lm 封口膜包成漏斗状， 在漏斗状开口处滴入农杆 菌液， 液即不外漏又可与伤口充分接触， 可进一步提高转化率。 0011 4、 为了提高不定芽的生长速度， 对创伤感染后的苗进行遮荫保暗培养 10-20 天， 可使不定芽萌发率达 90% 以上。 0012 5、 经验证， 本发明所述的柑橘转基因方法转化率可达到 15.3%， 甚至更高 ； 且本发 明没有由实验室转到田间的过程， 不会由此产生转。

14、基因植株死亡的现象。比彭爱红等发表 在 分子植物育种 （2009， 7（1） ： 51-55） 上的论文 根癌农杆菌介导甲型肝炎病毒 （HAV） 衣壳蛋白融合基因转化柑桔成年材料的研究 提到的田间转化率 （4%） 高， 以及比陈善春等 2009 年申请的项专利 一种柑桔的转基因方法 （申请号 ： 200910104100.8） 所提到的田间 转化率 （9.6%） 高。 具体实施方式 0013 下面结合实施例对本发明作进一步说明， 但本发明的实施和保护范围并不仅限于 此， 需指出的是， 以下若有未特别详细说明的过程， 均是本领域技术人员可参照现有技术实 现的。 0014 实施例 ： 1、 土播实。

15、生幼苗的准备 选 7 成熟以上的果子取种子， 也可用购买来的种子， 洗泡后直接播种于营养土中， 与田 间普通播种育苗基本相同。 0015 本例用的营养土， 泥炭土与椰糠各 50%（体积） ， 营养土可用各种育苗盆或杯装， 播 种后再盖上 1cm 厚的营养土， 然后浇水保湿促发芽， 温室温度 28-30。 0016 2、 携带有 pFGC5941 载体的农杆菌侵染液的准备 将农杆菌在含有10mg/L Basta （保试达） 的LB培养基上划线， 28暗培养2天后挑取单 克隆涂板， 28暗培养2天后用液体MS液体培养基洗下菌落， 再用不含抗生素， 含有100M 乙酰丁香酮的 MS 液体培养基 28。

16、震荡培养 2 小时后调 OD600至 0.5-1.0， 用于侵染。 0017 3、 创伤、 感染 播种后一个月， 实生苗长有 2-4 片嫩叶时， 从第一片叶基部下面切除幼苗的带叶上部， 然后用 parafi lm 封口膜紧绕切口部包成一漏斗形 （上大下小） ， 在漏斗形口滴入农杆菌侵染 说 明 书 CN 104293829 A 4 3/3 页 5 液， 使创伤口浸泡在菌液 45 分钟到 1 小时， 用滤纸吸干菌液， 用漏斗形的 parafi lm 封口膜包 压切口保湿， 然后用黑膜覆盖处理苗， 暗培养 3 天后， 除去封口膜， 用 10mg/L Basta 溶液擦 拭创伤口 2-3 次， 使创。

17、伤口处带有 Basta 溶液， 用封口膜包紧创伤口。用黑膜覆盖处理苗 2 周， 待发出黄色不定芽时， 揭去覆盖膜， 使幼苗及不定芽见光培养生长。实验所用 164 株实 生苗中有 154 株 （93.9%） 长出不定芽。其中 85 株长出 1 个不定芽， 其余 69 株长出 2 个或 多于 2 个不定芽。 0018 4、 拟转化芽的分子生物学鉴定 拟转化芽长有 2-3 片时， 可取部分叶提取 DNA， 以 pFGC5941 载体 Bar 基因引物 （Bar F ： TGC ACC ATC GTC AAC CAC TAC ATC ； Bar R ： GCT GCC AGA AAC CCA CGT 。

18、CAT ； 目标片段 433bp） 进行 PCR 检测 ； 长有 5 片叶以上时， 可进行多次复检， 获得转基因植株。在用于检测 的 183 个转化芽中有 28 个经多次 PCR 检测仍为阳性， 转化率约为 15.3%。 0019 5、 转基因植株扩繁、 土播营养土回收处理 对验证确定获得的转基因植株进行嫁接扩繁， 以备进一步实验的需求。同时原土播营 养土回收进行灭菌处理， 以免质粒向环境释放。 0020 本发明创建的直接以土播实生幼苗为外植体的根癌农杆菌介导法是在温室里日 常光照下进行的， 避免了试管砧木苗的无菌培养及不定芽嫁接的过程， 成本低、 转化率高、 操作简便， 且可周年播种操作。 说 明 书 CN 104293829 A 5 。