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1、(10)申请公布号 CN 104221882 A (43)申请公布日 2014.12.24 CN 104221882 A (21)申请号 201410550994.4 (22)申请日 2014.10.17 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人 山东农业大学 地址 271018 山东省泰安市岱宗大街 61 号 (72)发明人 邢世岩 王萱 李继红 吴岐奎 刘晓静 孙立民 (54) 发明名称 银杏组织培养外植体消毒方法 (57) 摘要 本发明公开了一种银杏组织培养外植体消毒 的方法。本发明介绍了银杏组织培养中不同外植 体的处理和消毒方法， 以降低银杏组培的污染率， 和因处理不当造成。
2、的死亡率。本发明利用银杏组 织培养中常见外植体 ： 茎段， 胚， 冬芽， 在传统的 组培消毒方法上进行了部分改良， 从而提高了外 植体接种的成活率， 达到提高银杏组培繁殖的效 率和产量的目的。本方法对银杏外植体进行消毒 处理， 操作简单、 可行。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 (10)申请公布号 CN 104221882 A CN 104221882 A 1/1 页 2 1. 一种银杏组织培养外植体消毒的方法， 该方法包括以下步骤 ： (1)消毒液的选用 ： 使用70酒精和0.。
3、1氯化汞进行消毒， 0.1氯化汞每升加入3-4 滴吐温 20 ； (2) 外植体选取时间 ： 银杏组培中常用的外植体有幼嫩茎段， 胚， 冬芽 ； 茎段培养外植 体最佳选取时间为 4 月上中旬， 取当年银杏苗木抽生的新枝， 长约 10cm ； 胚培养外植体最佳 选取时间为 10 月上中旬， 取当年银杏种核 ； 冬芽培养外植体最佳选取时间为 3 月上旬冬芽 萌发前， 取一到两年生枝条的芽 ； (3) 茎段消毒 ： 茎段剪去叶片， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作台下 依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯化汞消毒 8-10min， 无菌水冲洗 3-5 次， 然 。
4、后用无菌的滤纸吸去茎段表面的水分， 剪成 1-2cm 长， 留 1-2 个腋芽或顶芽， 接种 ； (4) 胚消毒 ： 除去果皮和种壳， 剥离种皮， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌 操作台下依次用70酒精消毒30s， 带吐温20的0.1氯化汞消毒6-8min， 无菌水冲洗3-5 次， 然后用无菌的滤纸吸去种仁表面的水分， 从胚乳中取出胚， 接种 ； (5) 冬芽消毒 ： 从当年生的枝条中部剪取约 1cm 长、 带有一个冬芽的茎段， 用肥皂水擦 洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作台下依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯 化汞消毒 8-10min， 无菌水冲洗。
5、 3-5 次， 用无菌的滤纸吸去表面的水分， 然后切除茎段， 留一 小部分茎段与冬芽连接的木质部分， 剥去外层芽鳞， 至第一幼叶露出时， 取与小部分木质连 接的芽作为外植体， 接种。 2.根据权利要求1所述的一种银杏组织培养外植体消毒方法， 其特征在于， 步骤(1)所 描述的消毒液的选用。 3.根据权利要求1所述的一种银杏组织培养外植体消毒方法， 其特征在于， 步骤(2)所 描述的培养时期的选择。 4. 根据权利要求 1 所述的一种银杏组织培养外植体消毒方法， 其特征在于， 步骤 (3) (4)(5) 所描述的外植体消毒方法。 权 利 要 求 书 CN 104221882 A 2 1/3 页 。
6、3 银杏组织培养外植体消毒方法 技术领域 0001 本发明属于树木生长发育及繁殖的技术领域， 特别是一种关于银杏组织培养外植 体消毒的方法。 背景技术 0002 银杏 (Ginkgo biloba L.) 是第四纪冰川的孑遗植物， 是叶果材兼优的珍稀树种。 中国作为世界上银杏第一大国， 拥有世界银杏种质资源的 90以上， 在我国可考证的栽培 历史达千年之久， 具有较高的经济、 生态和文化价值。利用植物组织培养快速繁殖优良品 种， 是苗木生产中最见成效、 应用最广的技术之一。目前， 银杏组织培养中常用的外植体有 茎段、 胚和冬芽， 而这些外植体在处理消毒过程中主要存在以下突出问题 ： (1) 外。
7、植体处理 不当， 导致成活率低， 生长不良。(2) 外植体消毒不彻底， 导致污染率高， 影响了银杏组培繁 殖的效率和产量。 0003 本发明利用银杏组织培养中常见外植体 ： 茎段， 胚， 冬芽， 在传统的组培消毒方法 上进行了部分改良， 从而降低了银杏组培的污染率， 和因处理不当造成的死亡率。 目前还未 见银杏组织培养外植体消毒方法的报道， 本发明是在这样的技术背景下提出的。 发明内容 0004 本发明旨在降低银杏组织培养中的污染率， 在传统的组培消毒方法上做了部分改 进， 重点介绍了银杏组织培养中常见外植体的消毒方法， 操作简便， 污染率低， 提高了银杏 组培繁殖的效率和产量。本发明采用了以。
8、下技术方案 ： 0005 (1) 消毒液的选用 ： 使用 70酒精和 0.1氯化汞进行消毒， 0.1氯化汞每升加 入 3-4 滴吐温 20。 0006 (2) 外植体选取时间 ： 银杏组培中常用的外植体有幼嫩茎段， 胚， 冬芽。茎段培养 外植体最佳选取时间为 4 月上中旬， 取当年银杏苗木抽生长约 10cm 的新枝 ； 胚培养外植体 最佳选取时间为 10 月上中旬， 取当年银杏种核 ； 冬芽培养外植体最佳选取时间为 3 月上旬 冬芽萌发前， 取当年生枝条上未萌发的芽。 0007 (3) 茎段消毒 ： 茎段剪去叶片， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作 台下依次用70酒精消毒30s。
9、， 带吐温20的0.1氯化汞消毒8-10min， 无菌水冲洗3-5次， 然后用无菌的滤纸吸去茎段表面的水分， 剪成 1-2cm 长， 留 1-2 个腋芽或顶芽， 接种。 0008 (4) 胚消毒 ： 除去果皮和种壳， 剥离种皮， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作台下依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯化汞消毒 6-8min， 无菌水冲 洗 3-5 次， 然后用无菌的滤纸吸去种仁表面的水分， 从胚乳中取出胚， 接种。 0009 (5) 冬芽消毒 ： 从当年生的枝条中部剪取约 1cm 长、 带有一个冬芽的茎段， 用肥 皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操。
10、作台下依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯化汞消毒 8-10min， 无菌水冲洗 3-5 次， 用无菌的滤纸吸去表面的水分， 然后切除茎 段， 留一小部分茎段与冬芽连接的木质部分， 剥去外层芽鳞， 至第一幼叶露出时， 取与小部 说 明 书 CN 104221882 A 3 2/3 页 4 分木质连接的芽作为外植体， 接种。 0010 本发明的有益效果是 ： 0011 (1)在0.1氯化汞的消毒液中加入吐温20， 吐温20是一种表面活性物质， 可以使 氯化汞消毒更加彻底。 0012 (2) 外植体选取时间 ： 春季银杏苗木抽生新枝后， 长约 10cm， 即可进行， 但最佳时。
11、 间为 4 月上中旬， 这段时间的嫩茎生长旺盛， 且不易滋生内生菌影响培养。胚培养外植体最 佳选取时间为10月上中旬， 此时的胚可长到0.5-1cm， 萌发率高。 冬芽培养外植体最佳选取 时间为 3 月上旬冬芽萌发前， 取一到两年生枝条的芽， 此时冬芽外植体较饱满， 易接种， 取 当年生枝条的芽， 这样保证冬芽为叶芽， 而不是花芽， 影响实验。 0013 (3) 茎段的消毒 ： 茎段经冲洗、 消毒后， 剪成 1-2cm 长， 留 1-2 个腋芽或顶芽， 茎段 冲洗消毒彻底能降低培养的污染率。 0014 (4) 胚消毒 ： 除去果皮和种壳， 剥离种皮消毒， 可使种仁消毒更加彻底， 再从胚乳 中取。
12、出胚接种， 大大降低了污染率。 0015 (5) 冬芽消毒 ： 冬芽外植体处理， 切除茎段时， 留一小部分茎段与冬芽连接的木质 部分， 剥去外层芽鳞， 至第一幼叶露出时， 取与小部分木质连接的茎尖部分作为外植体， 留 小部分木质是为了保护芽体， 避免破坏生长点。 0016 利用上述方法对银杏组培常见外植体进行消毒， 操作简便， 污染率低， 提高了银杏 组培繁殖的效率和产量。 具体实施方式 0017 实施例 1 0018 应用本方法在山东省泰安市山东农业大学南校区组织培养实验室中进行， 在传统 的组培消毒方法上做了部分改进， 重点介绍了银杏组织培养中常见外植体的消毒方法， 操 作简便， 污染率低。
13、， 提高了银杏组培繁殖的效率和产量。 银杏组织培养外植体消毒方法实施 步骤如下 ： 0019 1. 消毒液的选用 0020 配制 70酒精和 0.1氯化汞进行消毒， 0.1氯化汞每升加入 3-4 滴吐温 20。 0021 2. 外植体的选择 0022 4 月上中旬， 取当年银杏苗木抽生长约 10cm 的新枝 ； 10 月上中旬， 取当年银杏种 核 ； 3 月上旬， 取当年生枝条上未萌发的芽。 0023 3. 茎段消毒 0024 茎段剪去叶片， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作台下依次用 70 酒精消毒30s， 带吐温20的0.1氯化汞消毒8-10min， 无菌水冲洗3-5次， 。
14、然后用无菌的滤 纸吸去茎段表面的水分， 剪成 1-2cm 长， 留 1-2 个腋芽或顶芽， 接种。 0025 4. 胚消毒 0026 除去果皮和种壳， 剥离种皮， 用肥皂水擦洗， 再在自来水下冲洗干净， 无菌操作台 下依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯化汞消毒 6-8min， 无菌水冲洗 3-5 次， 然 后用无菌的滤纸吸去种仁表面的水分， 从胚乳中取出胚， 接种。 0027 5. 冬芽消毒 说 明 书 CN 104221882 A 4 3/3 页 5 0028 从当年生的枝条中部剪取约 1cm 长、 带有一个冬芽的茎段， 用肥皂水擦洗， 再在自 来水下冲洗干净， 无菌操作台下依次用 70酒精消毒 30s， 带吐温 20 的 0.1氯化汞消毒 8-10min， 无菌水冲洗 3-5 次， 用无菌的滤纸吸去表面的水分， 然后切除茎段， 留一小部分茎 段与冬芽连接的木质部分， 剥去外层芽鳞， 至第一幼叶露出时， 取与小部分木质连接的芽作 为外植体， 接种。 0029 本发明不局限于以上实施方式， 只要是在银杏组织培养中上采取了以上消毒的方 法， 都将落入本发明的保护范围内。 说 明 书 CN 104221882 A 5 。