一种新型防御素PDBD及其基因、和应用.pdf

上传人：狗**

文档编号：4871744

上传时间：2018-11-20

格式：PDF

页数：10

大小：1.57MB

《一种新型防御素PDBD及其基因、和应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种新型防御素PDBD及其基因、和应用.pdf（10页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102952185 A (43)申请公布日 2013.03.06 CN 102952185 A *CN102952185A* (21)申请号 201210418553.X (22)申请日 2012.10.29 C07K 14/435(2006.01) C12N 15/12(2006.01) C12N 15/79(2006.01) A61K 38/17(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A23K 1/17(2006.01) (71)申请人山东隆科特酶制剂有限公司地址 276400 山东省临沂市沂水县城北二环路家官庄村 (72)发明人郭庆文。

2、王兴吉王忠连李芳芳刘文龙孙硕钱娟娟 (74)专利代理机构北京法思腾知识产权代理有限公司 11318 代理人高宇 (54) 发明名称一种新型防御素 pdBD 及其基因、和应用 (57) 摘要本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种防御素pdBD及其基因和应用。根据本发明的防御素 pdBD 其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.3所示。本发明的防御素对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、嗜水气单胞菌）及革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）均具有抗菌活性。作为一种新型的防御素 , 在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用。

3、价值。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页说明书 5 页序列表 2 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页序列表 2 页附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种防御素 pdBD，其特征在于，其氨基酸序列如 SEQ ID NO.1 或 SEQ ID NO.4 所示。 2. 一种防御素基因 pdBD，其特征在于，编码权利要求 1 所述的防御素。 3.根据权利要求2所述防御素基因pdBD，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 或 SEQ ID NO.5 所示。 4。

4、. 包含权利要求 2 或 3 所述防御素基因 pdBD 的重组载体。 5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pcDNA3.1(+)-pdBD。 6. 包含权利要求 2 或 3 所述防御素基因 pdBD 的重组质粒。 7.根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达宿主为HEK293T 细胞系。 8. 一种制备防御素基因 pdBD 的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1）用权利要求 4 的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒； 2）转染质粒，通过 HEK293T 细胞表达得到防御素 pdBD。 9.权利要求1所述防御素pdBD用于制备革兰。

5、氏阴性菌及革兰氏阳性菌抑制剂的应用。 10. 根据权利要求 9 所述的应用，其特征在于，革兰氏阴性菌为大肠杆菌和 / 或嗜水气单胞菌，所述革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌和 / 或金黄色葡萄球菌。权利要求书 CN 102952185 A 2 1/5 页 3 一种新型防御素 pdBD 及其基因、和应用技术领域 0001 本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种防御素 pdBD 及其基因和应用。背景技术 0002 自然界中各类生物都具有其内在的防御系统，当机体受到外界微生物侵染时，该系统便会产生一类防御性的肽类活性物质，被称为抗菌肽 (antimicrobia。

6、l peptides)。而防御素（defensin）属于一类含有 30-45 个氨基酸残基的抗菌肽，主要分布于皮肤和黏膜上皮，阻止病原微生物的定植并通过结合于病原微生物的胞膜上而将其杀灭（Taylor K,et al.Biopolymers 90:1-7,2008）。防御素是一种小的阳离子肽，是天然宿主识别微生物的基础。截止目前研究发现防御素的种类有：哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素，而在哺乳动物体内又发现 3 种防御素亚家族，即 - 防御素、 - 防御素和 - 防御素 , 而 - 防御素仅存在于灵长动物中（Guan-Guerra E,et al.Cl。

7、inical Immunology 135:1-11,2010）。 0003 防御素是一类分子量为 3-4KDa 的非糖基两亲（亲水、亲脂）低分子短肽，由 30-45 个氨基酸组成，一般富含精氨酸，带正电荷。分子中有 6 个半胱氨酸残基，形成 3 对二硫键，含有 3 个相应对称的折叠片结构，缺少螺旋结构域（Schneider JJ,et al.Journal of Molecular Medicine 83:587-95,2005;Dhople V， et al.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 1758:。

8、1499-512,2006）。 0004 借助于细胞这个媒介，无论在细胞内或细胞外，防御素都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物。在细胞内环境中，它们通过吞噬微生物而促成厌氧菌的死亡。当被释放到细胞外环境中，它们通过攻击微生物外膜发挥抗菌活性。除此之外，防御素还作为机体内外免疫系统的 “仲裁者” 进行免疫调节以及创伤和神经损伤的修复。防御素在宿主的嗜中性粒细胞、粘膜表面、皮肤和其他上皮细胞免疫中起重要作用，其定位和调控是通过抵抗病原的侵袭和内生细菌的生长两种途径来实现（De Yang,et al.Trends in Immunology 23:291-29。

9、6,2002;Zasloff.Nature415:389-395,2002;Lai Y， et al.Trends in Immunology 30:131-41,2009）。 0005 鱼类防御素相对于哺乳动物防御素研究起步相对较晚，且都集中于海水鱼类的研究，泥鳅作为一种鲤形目的淡水鱼是一种新型且具有代表性的研究对象，为开发一种具有广谱抗菌活性的防御素且投入于水产饲料、渔药等行业的应用提供了一些理论基础。发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种防御素 pdBD。 0007 本发明的再一目的是提供编码上述防御素的基因 pdBD。 0008 本发明的再一目的是提供包含上述防御。

10、素基因的重组载体。 0009 本发明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重组细胞系。说明书 CN 102952185 A 3 2/5 页 4 0010 本发明的再一目的是提供一种制备防御素的方法。 0011 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新防御素。本发明的发明人人从泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）中得到一个新的具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的防御素。适合于水产饲料、渔药等行业中使用。 0012 从泥鳅中获得了一种防御素 pdBD，该蛋白含有 67 个氨基酸和一个终止密码子，预测的信号肽序列为前端24个氨基。

11、酸残基。理论分子量为7.28kDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示： 0013 MKPQCILLLALVVILVLHSKVNEAVSFPWGCASISGVCRQGTCLPSELYFGPLGCG 0014 KGFQ 60 0015 CCVSHFL 67 0016 本发明还提供了编码上述防御素的基因组序列，全长 627bp，包括三个外显子及两个内含子。其中 1-60bp 为第一个外显子， 61-334bp 为第一个内含子， 335-454bp 为第二个外显子， 455-603bp 为第二个内含子， 604-627bp 为第三个外显子。全基因组序列如 SEQ ID NO.2。

12、所示： 0017 atgaaacctc aatgtatact tctactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagtaag 60 0018 ttttatattc ttgcttttgg taaaagatta gtagctttgt gtaaacctga aattatgatt 120 0019 cttatcacat ttttaagcca aaaaacagca ataataaaac ttgctttatt gtgatgtatt 180 0020 ggaagtgaca ttactcatgg atggcaaagg acaaagcagc aaatgccagc tgtattcctc。

13、 240 0021 tagatcacat ttggctgatt ctgtatgtag attgttttca tctgtctgtg ttgatctgtg 300 0022 tggagccaaa acatttattt ttgtctaagg caaggtgaat gaggctgtgt cgtttccctg 360 0023 gggctgtgcg agcatcagtg gagtttgcag acaaggaacg tgtctacctt ctgaactcta 420 0024 ctttggaccg ttaggctgtg gcaagggatt ccagtaagtt ccaatattta tacattccag。

14、 480 0025 ataaacacac acacgcatat atcatatgca catataaatg acatattgtg tgatattctt 540 0026 tacacatcaa gtaaatgatt acaaatctat ttgtttttga tttcttcctt gtttttttcc 600 0027 agatgctgtg tatcacattt tctttga 627 0028 本发明还提供了编码上述防御素的基因。本发明通过 PCR 的方法分离克隆了这一防御素基因的 cDNA 序列如 SEQ ID NO.3 所示： 0029 atgaaacctc aatgtatact tc。

15、tactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagcaag 60 0030 gtgaatgagg ctgtgtcgtt tccctggggc tgtgcaagca tcagtggagt ttgcagacaa 120 0031 ggaacgtgtc taccttctga actctacttt ggaccgttag gctgtggcaa gggattccag 180 0032 tgctgtgtat cacattttct ttga 204 0033 去除前端 24 个氨基酸后的 pdBD 序列如 SEQ ID NO.4 所示： 0034 VSFPWGCASISGVCRQGT。

16、CLPSELYFGPLGCGKGFQCCVSHFL 43 0035 其核苷酸序列如 SEQ ID NO.5 所示： 0036 gtgtcgtttc cctggggctg tgcaagcatc agtggagttt gcagacaagg aacgtgtcta 60 0037 ccttctgaac tctactttgg accgttaggc tgtggcaagg gattccagtg ctgtgtatca 120 0038 cattttcttt ga 132 0039 通过将防御素基因 pdBD 的 DNA 序列及推导出的氨基酸序列在 GenBank 中进行 BLAST 比对，确定 pdBD 。

17、是一种新的防御素，为防御素基因 pdBD 的改造并在各种外源基因表说明书 CN 102952185 A 4 3/5 页 5 达系统中高效表达提供优良的基因材料。 0040 本发明还提供了包含上述防御素基因 pdBD 的重组载体，优选为 pcDNA3.1(+)-pdBD。将本发明的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将防御素基因插入到质粒 pcDNA3.1(+) 上的 EcoRI 和 BamHI 限制性酶切位点之间，得到重组真核细胞表达质粒 p。

18、cDNA3.1(+)-pdB 和 pcDNA3.1(+)-pdBD-s。 0041 本发明还提供了包含上述防御素基因 pdBD 的表达细胞系，优选为 HEK293T 细胞系。 0042 本发明还提供了一种制备上述防御素 pdBD 的方法，包括以下步骤： 0043 1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒； 0044 2）转染质粒，通过 HEK293T 细胞表达得到防御素 pdBD ； 0045 3）检测所得防御素 pdBD 的抗菌活性。 0046 本发明的防御素对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、嗜水气单胞菌）及革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）均具有抗菌。

19、活性。作为一种新型的防御素 , 在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用价值。附图说明 0047 图1防御素基因pdBD在HEK293T细胞中表达的防御素的western blot分析， 1细胞表达得到的 pdBD ； 2 去除信号肽的成熟蛋白编码基因 pdBD-s 在细胞中的表达； 3 对照空载体 pcDNA3.1(+) 在细胞中的表达。具体实施方式 0048 试验材料和试剂 0049 1、载体及细胞：载体 pcDNA3.1(+) 购自于 Invitrogen 公司，细胞系 HEK293T 购自于 ATCC。 0050 2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶购自 T。

20、akara 公司，反转录试剂盒购自 TOYOBO 公司，脂质体 Lipofetmiane2000购自 Invitrogen 公司，细胞培养相关试剂购自 Invitrogen 和 Nuck 公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。 0051 3、培养基：大肠杆菌培养基 LB(1% 蛋白胨、 0.5% 酵母提取物、 1%NaCl,pH7.0)。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照分子克隆实验指南（第三版） J. 萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。 0052 实施例 1 泥鳅防御素编码基因 p。

21、dBD 的克隆 0053 利用 TRIZON 法提取泥鳅鳃部组织 RNA 并反转为第一链 cDNA。根据发表的鱼类防御素的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列 ENEAASFP 和 GCGKGFLCC，并设计合成了简并引物 DP-BD1-F 和 DP-BD1-R （引物序列见表 1），以泥鳅的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。PCR 反应参数为： 95 5min ； 94 30sec， 55-50 30sec( 其中每个循环后复性温度下降 0.5 )， 72 30s， 10 个循环，然后进入第二个循环程序： 94 30sec， 50 30sec， 72 30s， 28 个循。

22、环后； 72 10min，琼脂糖电泳检测，得到约 100bp 的片段，回收后 pGEM-T Easy 载体相连并转化大肠杆菌 JM109，经检测为阳性后送测序。说明书 CN 102952185 A 5 4/5 页 6 0054 根据测定序列结果，得到长 125bp 片段，在 NCBI 的 GenBank 中利用 BLASTX （http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) 进行序列比对，初步判断该基因片段是防御素片段。根据测序得到的核甘酸序列，上游和下游分别设计三条 TAIL-PCR 特异性引物和两条 RACE-PCR 特异性引物并将它们分别。

23、命名为 D1,D2,D3( 上游特异性引物 ) 和 U1,U2( 下游特异性引物 ) 见表 1。通过 TAIL-PCR 和 RACE-PCR 分别得到已知基因片段序列的 5 端侧翼序列和 3 端 UTR 序列，扩增得到产物回收后测序。 0055 将简并引物得到的核心片段与经TAIL-PCR得到的侧翼序列和经RACE-PCR得到的 3 端 UTR 序列进行拼接得到 pdBD 全长基因。结果表明，该基编码区全长 204bp（SEQ ID NO.2），编码 67 个氨基酸（SEQ ID NO.1）和一个终止密码子。信号肽序列为前端 24 个氨基酸残基，无序列相同的基因，该编码基。

24、因为一个新基因。 0056 表 1. 防御素 pdBD 特异性引物 0057 0058 aY=C/T,K=T/G， R=A/G， N=A/T/G/C; 划线部分为酶切位点。 0059 实施例 3 泥鳅防御素基因 pdBD 的表达 0060 防御素基因 pdBD 与 pcDNA3.1(+) 连接并在 HEK293T 细胞中进行了表达。根据测序及序列分析的结果设计引物 pcDNA-F 和 pcDNA-R（引物序列见表 1），以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。质粒 pcDNA3.1(+) 和基因（包括带信号肽编码序列的基因和去除信号肽编码成熟蛋白的基因）进行双酶切（EcoRI 。

25、和 BamHI）后连接形成载体 pcDNA3.1(+)-pdBD 和 pcDNA3.1(+)-pdBD-s。制备 TransI 感受态细胞，将重组载体 pcDNA3.1(+)-pdBD 或 pcDNA3.1(+)-pdBD-s 热击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，提取重组质粒并转染细胞。将重说明书 CN 102952185 A 6 5/5 页 7 组质粒与空载体 pcDNA3.1(+) 同时转染 HEK293T 细胞，采用 Lipofetmiane2000脂质体转染法，待细胞长到铺板率约 90% 时，按照质量体积比为 1 比 2 的比例转染质粒和脂质体，转染 6 小时后，吸。

26、去脂质体和质粒，加入培养液再培养 72 小时。瞬时转染 72 小时后，收集细胞，用于做 RT-PCR 以及 western blot 检测其表达情况。提取细胞总 RNA，反转为第一链 cDNA，以此为模版用特异性引物能扩增出目的条带，而相同条件下对照组 pcDNA 空载体不能扩增出相应条带。Western blot 检测是通过收集细胞后，用 HANKS buffer 重悬，超声破碎后 12000rpm 离心 5min，取上清进行 Tricine-SDS-PAGE，随后 100V 转膜 1h，经过一抗二抗孵育后，显色可看出重组蛋白 pcDNA3.1(+)-pdBD 在。

27、 7KDa 附近有一条明显条带，而对照组 pcDNA 空载体 ( 图 1)。 0061 实施例 4 防御素抗菌活性检测 0062 实施例 3 获得的重组蛋白抗菌活性检测：抗菌活性检测的目标菌种为革兰氏阴性菌的大肠杆菌、嗜水气单胞菌及革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。具体检测方法为：取两种菌进行划线 37过夜培养，待长出约 2mm 的单克隆后，挑取到 20ml 的 LB 培养液中，继续培养至其对数期， OD 值约为 0.6，再以 1% 接种量接于低盐 LB 培养基中（NaCl 浓度为 0.22mM），混匀后取 50ul 于 96 孔板中，同时加入等量的。

28、实施例 3 获得的重组蛋白（pcDNA3.1(+)-pdBD、去除信号肽的基因片段。及对照 pcDNA3.1(+)），蛋白的处理方法为：收集细胞后，用不含 NaCl 的 PB 缓冲液重悬细胞，超声破碎后离心取上清进行蛋白定量，确保重组蛋白与对照组空载体的蛋白总量一样，随后取上清进行活性检测，待其同菌一起孵育约 14h 后检测 OD600的读数，对于革兰氏阴性菌的大肠杆菌，缓冲溶液 PB 与其孵育后平均 OD 值为 0.762，空载体与其孵育后平均 OD 值为 0.735， pdBD 与其孵育后的平均 OD 值为 0.351 ；对于嗜水气单胞菌，缓冲溶。

29、液 PB 与其孵育后平均 OD 值为 0.495，空载体与其孵育后平均 OD 值为 0.463， pdBD 与其孵育后的平均 OD 值为 0.140 ；同样的对于枯草芽孢杆菌三个数值分别为 0.623、 0.595、 0.102，对于金黄色葡萄球菌三个数值分别为 0.670、 0.625、 0.319，数据经过 spass 软件统计后， pdBD 孵育后的细菌 OD 值显著低于 PB 及空载体对照（P0.01），数据经过 spass 软件统计后，可以看出实施例 3 获得的重组蛋白相对于对照组 pcDNA3.1(+) 来说对革兰氏阴性菌的大肠杆菌、嗜水气单胞菌及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌嗜水气单胞菌有显著抑制作用，对枯草芽孢杆菌有极显著抑制作用。说明书 CN 102952185 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序列表 CN 102952185 A 8 2/2 页 9 序列表 CN 102952185 A 9 1/1 页 10 图 1 说明书附图 CN 102952185 A 10 。

摘要
申请专利号：	CN201210418553.X	申请日：	2012.10.29
公开号：	CN102952185A	公开日：	2013.03.06
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/435申请日:20121029\|\|\|公开
IPC分类号：	C07K14/435; C12N15/12; C12N15/79; A61K38/17; A61P31/04; A23K1/17	主分类号：	C07K14/435
申请人：	山东隆科特酶制剂有限公司
发明人：	郭庆文; 王兴吉; 王忠连; 李芳芳; 刘文龙; 孙硕; 钱娟娟
地址：	276400 山东省临沂市沂水县城北二环路家官庄村
优先权：
专利代理机构：	北京法思腾知识产权代理有限公司 11318	代理人：	高宇
PDF完整版下载：	PDF下载

内容摘要

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种防御素pdBD及其基因和应用。根据本发明的防御素pdBD其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1或SEQ？ID？NO.3所示。本发明的防御素对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、嗜水气单胞菌）及革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）均具有抗菌活性。作为一种新型的防御素,在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用价值。

权利要求书

权利要求书一种防御素pdBD，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。
一种防御素基因pdBD，其特征在于，编码权利要求1所述的防御素。
根据权利要求2所述防御素基因pdBD，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。
包含权利要求2或3所述防御素基因pdBD的重组载体。
根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pcDNA3.1(+)‑pdBD。
包含权利要求2或3所述防御素基因pdBD的重组质粒。
根据权利要求6所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达宿主为HEK293T细胞系。
一种制备防御素基因pdBD的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒；
2）转染质粒，通过HEK293T细胞表达得到防御素pdBD。
权利要求1所述防御素pdBD用于制备革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌抑制剂的应用。
根据权利要求9所述的应用，其特征在于，革兰氏阴性菌为大肠杆菌和/或嗜水气单胞菌，所述革兰氏阳性菌为枯草芽孢杆菌和/或金黄色葡萄球菌。

说明书

说明书一种新型防御素pdBD及其基因、和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种防御素pdBD及其基因和应用。
背景技术
自然界中各类生物都具有其内在的防御系统，当机体受到外界微生物侵染时，该系统便会产生一类防御性的肽类活性物质，被称为抗菌肽(antimicrobial peptides)。而防御素（defensin）属于一类含有30‑45个氨基酸残基的抗菌肽，主要分布于皮肤和黏膜上皮，阻止病原微生物的定植并通过结合于病原微生物的胞膜上而将其杀灭（Taylor K,et al.Biopolymers 90:1‑7,2008）。防御素是一种小的阳离子肽，是天然宿主识别微生物的基础。截止目前研究发现防御素的种类有：哺乳动物防御素、昆虫防御素和植物防御素，而在哺乳动物体内又发现3种防御素亚家族，即α‑防御素、β‑防御素和θ‑防御素,而θ‑防御素仅存在于灵长动物中（Guaní‑Guerra E,et al.Clinical Immunology 135:1‑11,2010）。
防御素是一类分子量为3‑4KDa的非糖基两亲（亲水、亲脂）低分子短肽，由30‑45个氨基酸组成，一般富含精氨酸，带正电荷。分子中有6个半胱氨酸残基，形成3对二硫键，含有3个相应对称的β折叠片结构，缺少α螺旋结构域（Schneider JJ,et al.Journal of Molecular Medicine 83:587‑95,2005;Dhople V，et al.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)‑Biomembranes 1758:1499‑512,2006）。
借助于细胞这个媒介，无论在细胞内或细胞外，防御素都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物。在细胞内环境中，它们通过吞噬微生物而促成厌氧菌的死亡。当被释放到细胞外环境中，它们通过攻击微生物外膜发挥抗菌活性。除此之外，防御素还作为机体内外免疫系统的“仲裁者”进行免疫调节以及创伤和神经损伤的修复。防御素在宿主的嗜中性粒细胞、粘膜表面、皮肤和其他上皮细胞免疫中起重要作用，其定位和调控是通过抵抗病原的侵袭和内生细菌的生长两种途径来实现（De Yang,et al.Trends in Immunology 23:291‑296,2002;Zasloff.Nature415:389‑395,2002;Lai Y，et al.Trends in Immunology 30:131‑41,2009）。
鱼类防御素相对于哺乳动物防御素研究起步相对较晚，且都集中于海水鱼类的研究，泥鳅作为一种鲤形目的淡水鱼是一种新型且具有代表性的研究对象，为开发一种具有广谱抗菌活性的防御素且投入于水产饲料、渔药等行业的应用提供了一些理论基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防御素pdBD。
本发明的再一目的是提供编码上述防御素的基因pdBD。
本发明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重组载体。
本发明的再一目的是提供包含上述防御素基因的重组细胞系。
本发明的再一目的是提供一种制备防御素的方法。
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的新防御素。本发明的发明人人从泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）中得到一个新的具有抗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌活性的防御素。适合于水产饲料、渔药等行业中使用。
从泥鳅中获得了一种防御素pdBD，该蛋白含有67个氨基酸和一个终止密码子，预测的信号肽序列为前端24个氨基酸残基。理论分子量为7.28kDa。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：
MKPQCILLLALVVILVLHSKVNEAVSFPWGCASISGVCRQGTCLPSELYFGPLGCG
KGFQ                                                                60
CCVSHFL                                                             67
本发明还提供了编码上述防御素的基因组序列，全长627bp，包括三个外显子及两个内含子。其中1‑60bp为第一个外显子，61‑334bp为第一个内含子，335‑454bp为第二个外显子，455‑603bp为第二个内含子，604‑627bp为第三个外显子。全基因组序列如SEQ ID NO.2所示：
atgaaacctc aatgtatact tctactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagtaag    60
ttttatattc ttgcttttgg taaaagatta gtagctttgt gtaaacctga aattatgatt    120
cttatcacat ttttaagcca aaaaacagca ataataaaac ttgctttatt gtgatgtatt    180
ggaagtgaca ttactcatgg atggcaaagg acaaagcagc aaatgccagc tgtattcctc    240
tagatcacat ttggctgatt ctgtatgtag attgttttca tctgtctgtg ttgatctgtg    300
tggagccaaa acatttattt ttgtctaagg caaggtgaat gaggctgtgt cgtttccctg    360
gggctgtgcg agcatcagtg gagtttgcag acaaggaacg tgtctacctt ctgaactcta    420
ctttggaccg ttaggctgtg gcaagggatt ccagtaagtt ccaatattta tacattccag    480
ataaacacac acacgcatat atcatatgca catataaatg acatattgtg tgatattctt    540
tacacatcaa gtaaatgatt acaaatctat ttgtttttga tttcttcctt gtttttttcc    600
agatgctgtg tatcacattt tctttga                                        627
本发明还提供了编码上述防御素的基因。本发明通过PCR的方法分离克隆了这一防御素基因的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示：
atgaaacctc aatgtatact tctactggct ctcgtggtca tcttggtatt gcacagcaag    60
gtgaatgagg ctgtgtcgtt tccctggggc tgtgcaagca tcagtggagt ttgcagacaa    120
ggaacgtgtc taccttctga actctacttt ggaccgttag gctgtggcaa gggattccag    180
tgctgtgtat cacattttct ttga                                           204
去除前端24个氨基酸后的pdBD序列如SEQ ID NO.4所示：
VSFPWGCASISGVCRQGTCLPSELYFGPLGCGKGFQCCVSHFL        43
其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：
gtgtcgtttc cctggggctg tgcaagcatc agtggagttt gcagacaagg aacgtgtcta    60
ccttctgaac tctactttgg accgttaggc tgtggcaagg gattccagtg ctgtgtatca    120
cattttcttt ga                                                        132
通过将防御素基因pdBD的DNA序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，确定pdBD是一种新的防御素，为防御素基因pdBD的改造并在各种外源基因表达系统中高效表达提供优良的基因材料。
本发明还提供了包含上述防御素基因pdBD的重组载体，优选为pcDNA3.1(+)‑pdBD。将本发明的基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将防御素基因插入到质粒pcDNA3.1(+)上的EcoRI和BamHI限制性酶切位点之间，得到重组真核细胞表达质粒pcDNA3.1(+)‑pdB和pcDNA3.1(+)‑pdBD‑s。
本发明还提供了包含上述防御素基因pdBD的表达细胞系，优选为HEK293T细胞系。
本发明还提供了一种制备上述防御素pdBD的方法，包括以下步骤：
1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组质粒；
2）转染质粒，通过HEK293T细胞表达得到防御素pdBD；
3）检测所得防御素pdBD的抗菌活性。
本发明的防御素对革兰氏阴性菌（大肠杆菌、嗜水气单胞菌）及革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌）均具有抗菌活性。作为一种新型的防御素,在水产饲料添加剂和渔药等行业都有应用价值。
附图说明
图1防御素基因pdBD在HEK293T细胞中表达的防御素的western blot分析，1细胞表达得到的pdBD；2去除信号肽的成熟蛋白编码基因pdBD‑s在细胞中的表达；3对照空载体pcDNA3.1(+)在细胞中的表达。
具体实施方式
试验材料和试剂
1、载体及细胞：载体pcDNA3.1(+)购自于Invitrogen公司，细胞系HEK293T购自于ATCC。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶、连接酶购自Takara公司，反转录试剂盒购自TOYOBO公司，脂质体Lipofetmiane2000购自Invitrogen公司，细胞培养相关试剂购自Invitrogen和Nuck公司。其它都为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
3、培养基：大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1泥鳅防御素编码基因pdBD的克隆
利用TRIZON法提取泥鳅鳃部组织RNA并反转为第一链cDNA。根据发表的鱼类防御素的序列比对结果找到两个保守氨基酸序列ENEAASFP和GCGKGFLCC，并设计合成了简并引物DP‑BD1‑F和DP‑BD1‑R（引物序列见表1），以泥鳅的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95℃5min；94℃30sec，55‑50℃30sec(其中每个循环后复性温度下降0.5℃)，72℃30s，10个循环，然后进入第二个循环程序：94℃30sec，50℃30sec，72℃30s，28个循环后；72℃10min，琼脂糖电泳检测，得到约100bp的片段，回收后pGEM‑T Easy载体相连并转化大肠杆菌JM109，经检测为阳性后送测序。
根据测定序列结果，得到长125bp片段，在NCBI的GenBank中利用BLASTX（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行序列比对，初步判断该基因片段是防御素片段。根据测序得到的核甘酸序列，上游和下游分别设计三条TAIL‑PCR特异性引物和两条RACE‑PCR特异性引物并将它们分别命名为D1,D2,D3(上游特异性引物)和U1,U2(下游特异性引物)见表1。通过TAIL‑PCR和RACE‑PCR分别得到已知基因片段序列的5’端侧翼序列和3’端UTR序列，扩增得到产物回收后测序。
将简并引物得到的核心片段与经TAIL‑PCR得到的侧翼序列和经RACE‑PCR得到的3’端UTR序列进行拼接得到pdBD全长基因。结果表明，该基编码区全长204bp（SEQ ID NO.2），编码67个氨基酸（SEQ ID NO.1）和一个终止密码子。信号肽序列为前端24个氨基酸残基，无序列相同的基因，该编码基因为一个新基因。
表1.防御素pdBD特异性引物

aY=C/T,K=T/G，R=A/G，N=A/T/G/C;划线部分为酶切位点。
实施例3泥鳅防御素基因pdBD的表达
防御素基因pdBD与pcDNA3.1(+)连接并在HEK293T细胞中进行了表达。根据测序及序列分析的结果设计引物pcDNA‑F和pcDNA‑R（引物序列见表1），以cDNA为模板进行PCR扩增。质粒pcDNA3.1(+)和基因（包括带信号肽编码序列的基因和去除信号肽编码成熟蛋白的基因）进行双酶切（EcoRI和BamHI）后连接形成载体pcDNA3.1(+)‑pdBD和pcDNA3.1(+)‑pdBD‑s。制备TransI感受态细胞，将重组载体pcDNA3.1(+)‑pdBD或pcDNA3.1(+)‑pdBD‑s热击转化宿主菌。鉴定阳性重组子，提取重组质粒并转染细胞。将重组质粒与空载体pcDNA3.1(+)同时转染HEK293T细胞，采用Lipofetmiane2000脂质体转染法，待细胞长到铺板率约90%时，按照质量体积比为1比2的比例转染质粒和脂质体，转染6小时后，吸去脂质体和质粒，加入培养液再培养72小时。瞬时转染72小时后，收集细胞，用于做RT‑PCR以及western blot检测其表达情况。提取细胞总RNA，反转为第一链cDNA，以此为模版用特异性引物能扩增出目的条带，而相同条件下对照组pcDNA空载体不能扩增出相应条带。Western blot检测是通过收集细胞后，用HANKS buffer重悬，超声破碎后12000rpm离心5min，取上清进行Tricine‑SDS‑PAGE，随后100V转膜1h，经过一抗二抗孵育后，显色可看出重组蛋白pcDNA3.1(+)‑pdBD在7KDa附近有一条明显条带，而对照组pcDNA空载体(图1)。
实施例4防御素抗菌活性检测
实施例3获得的重组蛋白抗菌活性检测：抗菌活性检测的目标菌种为革兰氏阴性菌的大肠杆菌、嗜水气单胞菌及革兰氏阳性菌的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。具体检测方法为：取两种菌进行划线37℃过夜培养，待长出约2mm的单克隆后，挑取到20ml的LB培养液中，继续培养至其对数期，OD值约为0.6，再以1%接种量接于低盐LB培养基中（NaCl浓度为0.22mM），混匀后取50ul于96孔板中，同时加入等量的实施例3获得的重组蛋白（pcDNA3.1(+)‑pdBD、去除信号肽的基因片段。及对照pcDNA3.1(+)），蛋白的处理方法为：收集细胞后，用不含NaCl的PB缓冲液重悬细胞，超声破碎后离心取上清进行蛋白定量，确保重组蛋白与对照组空载体的蛋白总量一样，随后取上清进行活性检测，待其同菌一起孵育约14h后检测OD600的读数，对于革兰氏阴性菌的大肠杆菌，缓冲溶液PB与其孵育后平均OD值为0.762，空载体与其孵育后平均OD值为0.735，pdBD与其孵育后的平均OD值为0.351；对于嗜水气单胞菌，缓冲溶液PB与其孵育后平均OD值为0.495，空载体与其孵育后平均OD值为0.463，pdBD与其孵育后的平均OD值为0.140；同样的对于枯草芽孢杆菌三个数值分别为0.623、0.595、0.102，对于金黄色葡萄球菌三个数值分别为0.670、0.625、0.319，数据经过spass软件统计后，pdBD孵育后的细菌OD值显著低于PB及空载体对照（P<0.01），数据经过spass软件统计后，可以看出实施例3获得的重组蛋白相对于对照组pcDNA3.1(+)来说对革兰氏阴性菌的大肠杆菌、嗜水气单胞菌及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌嗜水气单胞菌有显著抑制作用，对枯草芽孢杆菌有极显著抑制作用。