分离高纯度细胞群体的生理学方法.pdf

本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，包括分化干细胞群体；和迁移分化细胞通过分化设备中的多孔膜，以分离纯的或富集的分化细胞群体。本公开也提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群的分化设备，设备包含多孔膜；和胞外基质。

权利要求书分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，所述方法包括分化所述干细胞群体；和迁移所述分化细胞通过分化设备中的多孔膜，以分离所述纯的或富集的分化细胞群体。 
权利要求1所述的方法，其中细胞分化产生上皮‑至‑间充质转换(EMT)或间充质‑至‑上皮转换(MTE)。 
权利要求1所述的方法，其中细胞迁移包含趋化性迁移或通过所述分化设备的结构性能或组件布置而诱导的迁移。 
权利要求1所述的方法，其中所述分化细胞用于治疗或研究目的。 
权利要求4所述的方法，其中所述治疗用途包括糖尿病、视网膜病、心脏病或肝脏疾病治疗。 
权利要求1所述的方法，其中干细胞选自胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、胚胎胚原基来源的干细胞、源自卵裂球的干细胞、分离自器官和组织的成体干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自胎儿组织的干细胞、分离自毛囊的干细胞、间充质干细胞，神经元干细胞和癌干细胞。 
权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。 
权利要求1所述的方法，其中分化细胞是原代细胞，其包括：源自内胚层的细胞；源自外胚层的细胞；或源自中胚层的细胞。 
权利要求8所述的方法，其中所述源自内胚层的细胞包括腺细胞，其包括外分泌上皮细胞、激素分泌细胞或具有推进功能的纤毛细胞；所述源自外胚层的细胞包括来自皮肤系统的细胞，其包括角化上皮细胞或湿分层屏障上皮细胞、源自神经系统的细胞，其包括感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和胶质细胞或透镜状细胞；和所述源自中胚层的细胞包括新陈代谢和储存细胞、屏障功能细胞，其包括来自肺、消化道、外分泌腺的细胞和包括肾的泌尿生殖道细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞或间质细胞。 
权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜任选地包括任一高表面积支架， 其包括由下述组成的一种或多种多孔二维或三维膜或海绵体：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸钙；胞外基质，其包括人或非人胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、包含透明质酸的非蛋白聚糖多糖、由重组技术或合成技术获得的材料或源自天然存在的来自人、动物、植物或原核生物的材料；纤维结构和纤维；海绵体；分泌自人细胞的细胞基质，其包括分泌自培养的人成纤维细胞的基质；网状物，其包括二‑维或三‑维网状物；网状结构；生长因子或它们部分的分子，其包括TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；或各种类型的粘附活细胞，其以二维或三维模式布置在分化设备上或其组合。 
权利要求10所述的方法，其中所述多孔二维或三维支架或海绵体或胞外基质或分化设备的其他组件通过具有生物学活性的分子涂布在任一侧，所述分子包括下述：刺激/促进细胞分化的分子；刺激/促进细胞成熟的分子；刺激/促进细胞迁移的分子；支持细胞迁移的分子；刺激/促进EMT或MTE的分子；刺激增殖的活性分子；或支持细胞分化阶段/状态的活性分子，或其任意组合。 
权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜或所述分化设备的其他组件具有细胞粘附抑制性能。 
权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜或海绵体或网状物或网状结构或纤维结构或分化设备的其他组件具有从0.1微米至1000微米的任何大小的孔。 
权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜具有从5微米至12微米的任何大小的孔。 
权利要求1所述的方法，其中所述多孔膜的孔形状包括圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽、或其任意组合。 
权利要求1所述的方法，其中所述分化设备的任何或所有组件是生物可降解的。 
权利要求1所述的方法，其中所述胞外基质或包括多孔膜、海绵体、网状物、网状结构、纤维和纤维结构在内的所述设备的任何其他组件包括同质结构或异质结构或倾斜结构或分层结构。 
权利要求1所述的方法，其中所述分化设备浸入细胞培养基或缓冲液。 
权利要求18所述的方法，其中所述培养基是固定的或经分化设备泵入。 
权利要求1所述的方法，其中所述干细胞接种在顶面和/或在底部和/或中间或以其他各种取向接种在所述分化设备上。 
权利要求1所述的方法，其中所述干细胞与细胞基质预混合，然后接种在所述分化设备上或其中。 
权利要求1所述的方法，其中所述纯的或富集的分化细胞群体的分离包括用破坏和/或消化胞外基质和/或所述分化设备的任何其他组件的化学试剂和/或酶试剂处理。 
权利要求1所述的方法，其中在将细胞接种在所述分化设备中和/或其上之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件。 
权利要求1所述的方法，其中细胞直接进入多孔结构或直接进入胞外基质中发生迁移，所述多孔结构包括多孔膜、海绵体、纤维结构、网状物、网状结构。 
权利要求1所述的方法，其中细胞迁移发生在二‑维或三维系统的表面。 
权利要求1所述的方法，其中细胞迁移发生在毛细管、导管或管内侧。 
源自干细胞的基本上纯化的或富集的分化细胞，其通过权利要求1所述的方法制备。 
权利要求1所述的方法，其中所述方法是用于从多能干细胞群分离纯的或富集的高纯度定形内胚层(DE)群体的体外方法，其包括：使多能干细胞群体与一种或多种分化信号接触；通过允许它们进行上皮‑至‑间充质转换(EMT)来分化接触的细胞，以产生具有间充质表型的细胞；允许具有所述间充质表型的分化细胞迁移通过多孔膜进入三维胞外基质(ECM)；和允许所述三维ECM中的迁移的细胞分化成高纯度DE。 
权利要求28所述的方法，其中所述高纯度DE以大于90%的纯度分离。 
权利要求28所述的方法，其中所述高纯度DE使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4或SOX2表达进行评估。 
权利要求28所述的方法，其中所述高纯度DE被分离而没有污染OCT4‑阳性细胞。 
权利要求28所述的方法，其中所述高纯度DE含有多达80%的CXCR4或SOX17‑阳性细胞。 
权利要求28所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。 
权利要求33所述的方法，其中所述人多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)。 
权利要求34所述的方法，其中所述hESC是WA09细胞系；并且hpSC是phESC‑1、phESC‑3、phESC‑5或hpSC‑Hhom‑1细胞系。 
权利要求28所述的方法，其中所述分化信号是可溶性生长因子。 
权利要求36所述的方法，其中所述分化信号是高水平激活素A信号或Wnt3a信号，其模拟细胞在原条内移期间接收的TGF‑β和Wnt信号。 
权利要求28所述的方法，其中所述多孔膜包含孔，其具有从约6μm至约10μm的直径。 
权利要求38所述的方法，其中所述多孔膜包含孔，其具有从约7μm至约9μm的直径。 
权利要求39所述的方法，其中所述多孔膜包含直径约8μm的孔。 
权利要求28所述的方法，其中所述三维ECM包含I型胶原和/或纤连蛋白。 
权利要求28所述的方法，进一步包括将所述高纯化的DE分化成肝细胞或内分泌胰腺细胞的步骤。 
权利要求42所述的方法，其中所述将高纯化的DE分化成肝细胞的步骤包括用FGF4、BMP2、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M和地塞米松处理DE。 
权利要求28所述的方法，其中所述非迁移未分化的多能干细胞分离自高纯度DE。 
权利要求7或32所述的方法，其中所述细胞是人的。 
用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群的分化设备，所述设备包括多孔膜；和胞外基质。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述细胞迁移通过所述多孔膜发生。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述细胞迁移包括趋化性迁移；或通过所述分化设备的结构性能或组件布置而诱导的迁移。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述干细胞选自胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、胚胎胚原基来源的干细胞或源自卵裂球的干细胞；分离自器官和组织的成体干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自胎儿组织的干细胞、分离自毛囊的干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞；和癌干细胞。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述干细胞是哺乳动物干细胞。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述分化细胞是原代细胞，其包括源自内胚层的细胞；源自外胚层的细胞；或源自中胚层的细胞。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔膜任选地包含任一高表面积支架，其包含由下述组成的一种或多种多孔二维或三维膜或海绵体：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸钙；胞外基质，其包括人或非人胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、包含透明质酸的非蛋白聚糖多糖、得自重组技术或合成技术的材料或源自天然存在的来自人、动物、植物或原核生物的材料；纤维结构和纤维；海绵体；分泌自人细胞的细胞基质，其包括分泌自培养的人成纤维细胞的基质；网状物，其包括二‑维或三‑维网状物；网状结构；生长因子或它们部分的分子，其包括TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；或i)各种类型的粘附活细胞，其以二维或三维模式布置在分化设备上或其组合。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔二维或三维支架或海绵体或胞外基质或分化设备的其他组件通过具有生物学活性的分子涂布在任一侧，所述分子包括下述：刺激/促进细胞分化的分子；刺激/促进细胞成熟的分子；刺激/促进细胞迁移的分子；支持细胞迁移的分子；刺激/促进EMT或MTE的分子；刺激增殖的活性分子；或支持细胞分化阶段/状态的活性分子，或其任意组合。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔膜或分化设备的其他组件具有细胞粘附抑制性能。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔膜或海绵体或网状物或网状结构或纤维结构或分化设备的其他组件具有从0.1微米至1000微米任何大小的孔。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔膜具有从5微米至12微米的任何大小的孔。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述多孔膜的孔形状包括：圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽或其任意组合。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述分化设备的任何或所有组件是生物可降解的。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述胞外基质或包括多孔膜、海绵体、网状物、网状结构、纤维和纤维结构在内的所述设备的任何其他组件包括同质结构或异质结构或倾斜结构或分层结构。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述细胞直接进入多孔结构或直接进入胞外基质发生迁移，所述多孔结构包含多孔膜、海绵体、纤维结构、网状物、网状结构。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述细胞迁移发生在二‑维或三维系统的表面。 
权利要求46所述的分化设备，其中所述细胞迁移发生在毛细管、导管或管内。 
源自干细胞的纯化的或富集的分化细胞群体，其通过权利要求46所述的分化设备制备。 
权利要求46所述的设备，其中所述设备分离来自多能干细胞群的高纯度DE，所述设备包括多孔膜；和三维ECM。 
权利要求64所述的设备，其中所述高纯度DE以大于90%的纯度分离。 
权利要求65所述的设备，其中所述高纯度DE使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4或SOX2表达进行评估。 
权利要求64所述的设备，其中所述高纯度DE被分离而没有污染OCT4‑阳性细胞。 
权利要求64所述的设备，其中所述高纯度DE含有多达80%的CXCR4或SOX17‑阳性细胞。 
权利要求64所述的设备，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。 
权利要求69所述的设备，其中所述人多能干细胞是人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)或人诱导多能干细胞(hiPSC)。 
权利要求70所述的设备，其中所述hESC是WA09细胞系；并且hpSC是phESC‑1、phESC‑3、phESC‑5或hpSC‑Hhom‑1细胞系。 
权利要求64所述的设备，其中所述多孔膜包含孔，其具有从约6μm至约10μm的直径。 
权利要求72所述的设备，其中所述多孔膜包含孔，其具有从约7μm至约9μm的直径。 
权利要求73所述的设备，其中所述多孔膜包含直径约8μm的孔。 
权利要求64所述的设备，其中所述三维ECM包含I型胶原和/或纤连蛋白。 
权利要求64所述的设备，其中所述高纯化的DE进一步分化成肝细胞或内分泌胰腺细胞。

说明书分离高纯度细胞群体的生理学方法
技术领域
本公开总体上涉及干细胞的领域，并且更具体地涉及分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法和设备。
背景技术
人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(hESC)、人孤雌生殖干细胞(hpSC)和人诱导多能干细胞(hiPSC)能够无限复制并且分化成所有3个胚层：内胚层、中胚层和外胚层的衍生物。因此，人多能干细胞的分化能力具有很大的希望用于治疗性应用。高纯度治疗性细胞的衍生是再生医学的一个主要目标。hESC源自早期胚胎的胚细胞的内细胞团。相比之下，hpSC和hiPSC二者避免该伦理考虑。第一策划产生的hpSC源自由化学刺激物活化的未受精卵母细胞的胚泡的内细胞团。hpSC，像hESC经历广泛的自我更新并且具有体外和体内的多能分化能力。通过诱导特定基因的“强迫”表达，hiPSC人工源自非多能细胞，典型地成体体细胞。hpSC的产生克服了与hESC相关的伦理障碍，因为hpSC的衍生起源于未受精的卵母细胞。iPSC首先于2006年从小鼠细胞并且于2007年从人细胞中产生。除了伦理考虑，hiPSC也避免植入物抗宿主疾病和免疫排斥问题，因为不像hESCs，它们全部源自患者。
多能干细胞的两个有希望的应用包括细胞置换疗法，用于糖尿病和慢性肝病。高纯度DE的产生是产生治疗上有用DE谱系细胞——包括肝细胞和胰内分泌细胞的关键的第一步。DE在原肠胚期间由外胚层细胞形成，所述外胚层细胞经历上皮‑至‑间充质转换(EMT)并且内移通过胚胎原条。当由来自环境的分化信号发射时，外胚层的上皮样细胞经历多个形态学和生物化学变化，这使能够它们呈现间充质细胞表型。该表型包括细胞内粘着复合物的破坏和上皮细胞顶端‑基底极性的丢失。这些细胞骨架变化允许这些细胞离开上皮并开始迁移。EMT的完成通过间充质细胞迁移离开起始的上皮层发信号。一旦形成，经内移起作用的原条产生中内胚层，其随后分离形成中胚层和内胚层。
使用高水平激活素A和Wnt3a信号以模拟细胞在内移期间原条处接收的信号，在体外DE已经由hESC、hpSC和hiPSC得到。但是，关于指导干细胞向DE的主要分化信号的知识还未翻译为方法以分化高纯化的DE而在培养物中没有未分化细胞污染。为了临床应用，这些残留的未分化细胞是主要的安全性考虑，因为它们可产生畸胎瘤。例如，在注入产自hESC的DE衍生物的未纯化胰脏培养物之后，46只小鼠中的7只发展了畸胎瘤。此外，从分化的第一阶段残留的未分化细胞可能显著减小全分化过程的效率。从hESC得到肝细胞样细胞的最先进方案之一产生估计的18‑26%的效率，并且分化的肝细胞的富集需要流式细胞计数步骤(产生其中55%的细胞表达白蛋白的群体)。
数个小组已经解决了分化的DE的细胞纯度的问题，认识到不存在未分化细胞产生的DE的重要性。通过含有高剂量激活素A、骨形态形成蛋白‑4(BMP4)、成纤维细胞生长因子‑2(FGF2)和PI3K化学抑制剂的确定成分培养基实现最好的结果，但是，多能性标记物比如OCT4和NANOG在最终分化细胞产物中是可检测的。所有之前的研究使用二维(2D)培养系统(塑料平皿上的单层培养物)并且不提供基质以促进中内胚层迁移。二维(2D)培养系统也不能容易地呈现生理学有关的三维(3D)ECM环境，其提供在原肠胚形成期间用于迁移的关键信号和底物。因此，本领域仍需要用于分化和纯化DE的新方法和设备。
发明内容
本公开解决了这些需要并且主要通过提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的新方法和设备解决了这些需要，其通过如下步骤进行：分化干细胞群；并且使分化细胞迁移通过分化设备中的多孔膜以分离纯的或富集的分化细胞群。本公开也提供分化设备，用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群，该设备包括多孔膜；和胞外基质。
基于脊椎动物胚胎发育过程的特征，本公开还提供新方法和设备用于提供高纯度DE，其利用DE祖细胞，例如，hESC、hpSC和hiPSC的迁移能力。所公开的方法和设备使用并入与三维(3D)ECM结合的多孔膜的设备来模拟转变通过原条的胚胎发育过程。已经发现，在膜上未分化的hESC、hpSC或hiPSC的处理导致EMT。一旦处理，响应的细胞获得间充质表型和迁移通过膜中的孔进入三维ECM的能力，在那里这些细胞分化成DE。如使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4表达评估的，已经发现得到的DE是高纯化的并且未被未分化细胞污染。
也已发现这些过程保留了DE的功能性质。例如，所公开的设备中分化的DE可产生高度富集的肝细胞样细胞(HLC)的群体，其特征为肝系标记物的表达，包括甲胎蛋白、转甲状腺素蛋白(TTR)、肝细胞核因子4α(HNF4α)、细胞角蛋白18、白蛋白、α1‑抗胰蛋白酶(AAT1)、CYP3A7、CYP3A4、CYP7A1、CYP2B6、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)和苯丙氨酸羟化酶(PAH)；和具有的与人肝细胞关联的功能，比如ICG摄取和释放、糖原贮积(PAS测试)、可诱导的细胞色素P450活性(PROD试验)和移植进免疫缺陷小鼠后植入肝脏中。所公开的方法和设备也是广泛可应用的，并且纯化的DE可使用hESC，以及数个hpSC系获得。所公开的方法和设备表示朝着有效生产源自DE的高纯度细胞，包括肝细胞和胰内分泌细胞的重要步骤，用于再生医学和药物发现，以及用作研究发育期间细胞命运特化和行为的平台，包括阐明原肠胚形成期间细胞内移和在细胞命运特化的根本机制。
因此，在一种实施方式中，本公开提供用于分离来自多能干细胞群高纯度DE的体外方法，如下进行：a)使多能干细胞群与一种或多种分化信号接触，其模拟上胚层的上皮样细胞在原条的内移期间接收的信号；b)通过允许接触的细胞经历EMT使它们分化，以产生具有间充质表型的细胞；c)允许具有间充质表型的分化细胞迁移通过多孔膜进入三维ECM；和d)允许三维ECM中迁移的细胞分化成高纯度DE。
在其他实施方式中，本公开提供分离来自多能干细胞群体高纯度DE的设备，其包括：多孔膜；和三维ECM。
附图简述
图1A‑1D图解了在体内和体外两种条件下细胞在DE分化期间的迁移。A)体内：在原肠胚形成期间细胞迁移通过原条的示意图。B)体外：刺激迁移通过原条的3D‑分化设备的示意图。C)石蜡包埋的、3D‑分化系统切片的苏木素和曙红染色表明在分化3天之后3D‑分化系统中细胞的2个区室，一个群体在膜上一个在膜下。D)石蜡包埋的、3D‑分化系统切片的免疫荧光标记表明位于膜下方的DE细胞的身份(SOX17‑阳性细胞核，绿色)不同于位于膜上方分化的和未分化的(OGT4‑阳性细胞核，红色)细胞的混合物。
图2A‑2F图解了在分化信号下，多能干细胞经历EMT和获得迁移的能力。A)RT‑qPCR显示在hpSC分化期间E‑钙粘着蛋白表达的下调和N‑钙粘着蛋白表达的上调。dO表示获自细胞的结果，所述细胞在诱导分化之前收集自多孔膜上方。B)未分化的和分化的培养物的免疫荧光标记表明在应用分化信号(Oh)之前在未分化细胞中存在E‑钙粘着蛋白表达和在开始分化方案72小时之后(72h)在从三维ECM收集的细胞中缺少E‑钙粘着蛋白表达。C)分化的培养物的免疫荧光标记表明在开始分化方案24小时之后，从三维ECM收集的细胞中N‑钙粘着蛋白的表达。D)相位差和间接免疫荧光显微镜检查表明经历EMT的细胞的细胞骨架重排特征。E)迁移试验：直条表示在分化之前(dO)、在开始分化之后24小时(d1)和48小时(d2)，在多孔膜下收集的细胞的数目。F)由RT‑qPCR测定的在干细胞分化成DE期间整联蛋白表达的时间动态。
图3A‑3D图解了三维(3D)分化系统产生高纯度DE。A)RT‑qPCR显示在干细胞分化成DE期间标记物基因表达的时间动态。B)免疫荧光标记表明在3D‑分化系统中朝着DE分化期间，SOX17和短尾(BRACH)原条标记物的共表达。C)在2D‑(“塑料平皿”)和3D‑(“3D‑胞外基质”)系统中得到的DE的流式细胞分析。D)流式细胞分析表明在分化的3天时，在从分化设备的三维ECM收集的DE培养物中缺乏OCT4‑阳性细胞。
图4A‑4F提供3D‑分化系统中源自DE的HLC的特征。A)RT‑qPCR表明在DE朝着HLC分化期间从三维ECM收集的细胞中甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)基因的逐渐上调。B)相位差图像显示在分化方案的8天时，三维ECM中HLC的立方形形态学。C)位于三维ECM中细胞的免疫荧光标记表明分化8天时早期肝细胞标记物的表达。D)RT‑qPCR显示在朝着HLC分化期间增加的甲胎蛋白(AFP)基因表达。E)RT‑qPCR表明朝着HLC分化结束时肝细胞标记物的表达。F)位于三维ECM中细胞的免疫荧光标记表明分化方案结束时白蛋白(ALB)和α‑1‑抗胰蛋白酶(AAT)的表达。
图5A‑5G提供3D‑分化系统中源自DE的HLC的特征。A)PAS染色(粉红色)表示获得的HLC存储糖原。B)绿色表示在3D‑分化系统中得到的HLC摄取的ICG。C)3D‑分化系统中得到的HLC展示细胞色素P450酶活性，如PROD试验评价。D)RT‑qPCR表明朝着HLC分化结束时肝细胞标记物的表达。E)流式细胞分析表明在3D‑分化系统中得到的CFSE‑标记的HLC移植42天之后，在从小鼠肝脏中分离的细胞群体中存在CFSE‑阳性细胞(“HLC”绘图)。F)冷冻的未固定组织切片的荧光显微镜检查分析表明在3D‑分化系统中得到的CFSE‑标记的HLC移植42天之后，小鼠肝脏中存在CFSE‑阳性有活力的细胞。G)冷冻组织切片的免疫荧光标记表明在3D‑分化系统中得到的HLC移植42天之后，小鼠肝脏中存在表达人白蛋白(ALB)的细胞。
下面更加详细描述根据本发明的示例性方法和设备。
发明详述
在描述本方法和设备之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法、设备和实验条件，因为这些条件可变化。也应当理解，本文中使用的术语是仅仅为了描述具体实施方式的目的，而不打算是限制性的，因为本发明的范围将仅仅限制在所附权利要求中。
如本文所使用，单数形式“一个”(a、an)和“所述(the)”包括复数提及物，除非上下文清楚地相反指出。因此，例如，提及“所述方法”包括一种或多种方法，和/或本文所述类型的步骤，当阅读本公开和阐释之后对本领域技术人员将显而易见。
如本文所使用，“分化”是指细胞中出现的变化，其使那些细胞呈现某些特化的功能并且丧失变成成某些其他特化功能单元的能力。能够分化细胞可以是任何全能、多潜能或多能细胞。相对于成熟的成体细胞，分化可以是局部的或全部的。“分化细胞”是指具有特定分化的，即，非胚胎状态的非胚胎细胞。三种较早分化细胞类型是内胚层、中胚层和外胚层。
分化的内胚层(DE)是指经历变化的那些细胞，以呈现内胚层的特化特征并且丧失它们变化成其他特化功能单位的能力。定形内胚层在原肠胚形成期间和两个其他主要的胚层——外胚层和中胚层一起形成，并且在发育期间将产生胃肠道和呼吸道以及其他器官，包括肝脏和胰腺。从hESC有效产生DE需要两个条件：转化生长因子β家族成员，比如激活素A或Nodal发信号；以及从胰岛素/胰岛素样生长因子发信号产生的多潜能自我更新信号经磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)释放。此外，与激活素A一起添加Wnt3a增加中内胚层——DE和中胚层的双潜能前体的特化效率，并且提高同步性，利用其hESC启动向下朝着DE形成的路径。
“孤雌生殖”是在缺乏精子穿透的情况下发生的卵母细胞活化的过程，并且指包含滋养外胚层和内细胞团的早期胚胎的发育，所述早期胚胎通过活化卵母细胞或胚胎细胞，例如，卵裂球获得，其包含所有雌性起源的DNA。在相关的方面，“胚泡”指受精的或活化的卵母细胞的卵裂期，其包含由外部滋养层细胞和内细胞团(ICM)组成的细胞的空心球。
“多(潜)能细胞”指源自通过活化含有所有雌性或雄性起源DNA的细胞而产生的胚胎的细胞，其可在体外长时间，理论上无限时间保持在未分化的状态——可产生不同的分化的组织类型，即外胚层、中胚层和内胚层。可通过在适当条件下培养内细胞团或通过产雄或产雌方法产生的源自胚胎内细胞群体的细胞保持细胞的多潜能状态，例如，通过在成纤维细胞饲养层或包括白血病抑制因子(LIF)的另一饲养层或培养物上培养。可通过各种方法确认这样培养的细胞的多潜能状态，例如，(i)确认多潜能细胞标记物特征的表达；(ii)产生含有表达多潜能细胞基因型细胞的嵌合动物；(iii)将细胞注入动物，例如，SCID小鼠，体内产生不同的分化细胞类型；和(iv)体外观察细胞(例如，当在缺乏饲养层或LIF的情况下培养时)分化成胚胎体和其他分化细胞类型。
“三维胞外基质(三维ECM或ECM)”指支持细胞最佳生长的相。例如，胶原被称为所有胶原纯度(>99.9%胶原含量)、功能的标准，并且可得到的最天然样胶原。胶原约97%是I型胶原，剩余的由III型胶原组成，并且理想的用于涂布表面、提供用于培养细胞的薄层制剂，或用作固体凝胶。其他三维ECM底物包括但不限于基质胶、层粘连蛋白、明胶和纤连蛋白底物。除了1型胶原，三维ECM可包括其他底物，其包括但不限于纤连蛋白、胶原IV、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖和各种生长因子，其包括但不限于bFGF、表皮生长因子、胰岛素样生长因子‑1、源自血小板的生长因子、神经生长因子和TGF‑β‑1)。
在羊膜动物中，按照下述顺序发生原肠胚形成：1)胚胎变得不对称；2)原条形成；3)来自外胚层的细胞在原条经历上皮到间充质转变并且原条内移以形成胚层。在准备原肠胚形成时，胚胎必须沿着近端‑远端轴和前‑后轴变得不对称。当胚胎的细胞形成由胚外组织组成的“卵圆筒”时形成近端‑远端轴，其产生结构，像在近端的胎盘和在远端的外胚层。许多信号传导通路有助于该重组，包括BMP、FGF、nodal和Wnt。内脏内胚层围绕上胚层。远端内脏内胚层(DVE)迁移至胚胎的前部，形成“前内脏内胚层”(AVE)。这打破前‑后对称并且被nodal信号调节。
在原肠胚形成的开始时形成原条并且出现在胚外组织和胚胎后侧和内移位点上上胚层之间的结合处。原条的形成依靠细胞内有助于原条的nodal信号传导和来自胚外组织的BMP4信号传导。通过对抗nodal信号传导，Cer 1和Lefty1将原条限制在适当的位置。限定为原条的区域继续朝着远端末梢生长。在发育的早期阶段，原条是将确立左右对称、确定原肠胚形成的位点和启动胚层形成的结构。为形成原条，爬行动物、鸟类和哺乳动物沿着预期的中线排列间充质细胞，确立第一胚胎轴，以及在原肠胚形成和胚层形成过程期间细胞将内移和迁移的位置。原条，延伸通过该中线并且产生前‑后体轴，成为胚胎中第一对称破坏事件，并且标志着原肠胚形成的开始。该过程包括中胚层和内胚层祖细胞的内移和它们迁移至其最终的位置，在那里它们将分化成三个胚层。
为了细胞从外胚层的上皮细胞移动通过原条以形成新层，细胞必须经历上皮到间充质转变(EMT)，以丢失它们的上皮特点，比如细胞‑细胞粘附。FGF信号是适当EMT所必须的。FGFR1是上调Snail1需要的，其下调E‑钙粘着蛋白，造成细胞粘附的丢失。EMT之后，细胞内移通过原条并且向外分散形成新的细胞层或加入已有的层。FGF8涉及在该从原条分散的过程中。
基于脊椎动物胚胎转变通过原条的发育过程特征，本公开提供新的方法和设备，用于分离高纯度DE(在一些实施方式中，大于90%DE、大于95%DE或大于99%DE)，其利用DE祖细胞，例如，hESC，hpSC或hiPSC的迁移能力。这些方法和设备结合三维ECM并入多孔膜。在膜上未分化的hESC、hpSC或hiPSC的处理导致EMT。一旦处理，响应的细胞取得迁移通过膜中的孔进入三维ECM的能力，在那里这些细胞分化成DE。如使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4表达的评估，已经发现得到的DE是高纯度的并且未被未分化细胞污染。
因此，在一种实施方式中，本公开基于制造激励细胞特定迁移的设备提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法。即，本公开提供了方法，其利用细胞的迁移性能以分离纯的或高纯度或富集的细胞群体。
其他方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中迁移是基于：a)上皮‑至‑间充质转换(EMT)或间充质‑至‑上皮转换(MTE)；b)趋化性，例如在预合成化学物质梯度的方向上的细胞迁移；c)分化设备结构性能的诱导；和/或d)分化设备各种组件预制布置的诱导。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以得到源自干细胞的的纯的或高纯度或富集的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以分离特定类型原代人细胞纯的或高纯度或富集的群体。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以得到源自之前分化细胞(祖细胞)的纯的或高纯度或富集的分化细胞(衍生物)群体。
如本文所使用，利用细胞迁移的方法和分化设备可产生用于医学治疗(例如糖尿病和肝脏疾病)的纯化细胞的分离群体；或用于研究(例如药物测试)；或用于商业目的(例如皮肤护理)。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以得到源自干细胞的纯的或高纯度或富集的分化细胞群体，其中干细胞可以是：a)多能干细胞，其包括胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、得自胚胎生殖细胞的干细胞和得自卵裂球的干细胞；b)成体干细胞，其包括分离自器官和组织的干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自胎儿组织的干细胞，分离自毛囊的干细胞，间充质干细胞，神经元干细胞；和/或c)癌干细胞。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群的方法，其中提供分化设备，以得到源自干细胞的纯的或高纯度或富集的分化细胞群，其中干细胞是人或动物起源的。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群的方法，其中提供分化设备，以得到源自干细胞的纯的或高纯度或富集的分化细胞群，其中分化细胞包括但不限于：a)源自内胚层的细胞，比如：腺细胞(外分泌分泌上皮细胞)；激素分泌细胞；和/或具有推进功能的纤毛细胞；b)源自外胚层的细胞，比如：来自皮肤系统的细胞(例如角化上皮细胞或湿分层屏障上皮细胞)；源自神经系统的细胞(例如感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、透镜状细胞)；和/或c)源自中胚层的细胞(例如新陈代谢和储存细胞；屏障功能细胞(例如来自肺、消化道、外分泌腺和包括肾的泌尿生殖道的细胞)；胞外基质分泌细胞；收缩细胞；血液和免疫系统细胞；色素细胞；生殖细胞；抚育细胞；间质细胞。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以得到源自干细胞的纯的或高纯度或富集的分化细胞群体，其中分化细胞(祖细胞)是通过各种方法得到的自然分化的培养物。
另一方面，本公开提供用于分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中提供分化设备，以分离特定类型原代人细胞的纯的或高纯度或富集的群体，其中原代细胞包括但不限于：a)源自内胚层的细胞比如：腺细胞(外分泌分泌上皮细胞)；激素分泌细胞；和/或具有推进功能的纤毛细胞；b)源自外胚层的细胞比如：来自皮肤系统的细胞(例如角化上皮细胞或湿分层屏障上皮细胞)；源自神经系统的细胞(例如感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、透镜状细胞)；和c)源自中胚层的细胞(例如新陈代谢和储存细胞；屏障功能细胞(例如来自肺、内脏、外分泌腺和包括肾的泌尿生殖道的细胞)；胞外基质分泌细胞；收缩细胞；血液和免疫系统细胞；色素细胞；生殖细胞；抚育细胞；间质细胞。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中设备包括但不限于下述任一种：a)高表面积支架，比如由，比如但不限于聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、碳酸钙的材料制造的一种或多种多孔二维膜(一个或多个)或三维支架(一个或多个)或海绵体(一个或多个)；b)下述材料单独或组合以各种取向附着在分化设备上的胞外基质：人或非人胶原、层粘连蛋白，纤连蛋白，弹性蛋白，蛋白聚糖(包括硫酸肝素，硫酸软骨素；硫酸角质素)；非蛋白聚糖多糖比如透明质酸；得自重组技术或合成技术的材料或源自天然存在的来自人、动物、植物或原核生物的材料；c)纤维结构和纤维；d)海绵体；e)分泌自人细胞的细胞基质(例如，比如分泌自培养的人成纤维细胞的基质)；f)网状物，包括二‑维或三‑维网状物；g)网状结构；h)纤维结构和纤维；i)生长因子或它们部分的分子，包括但不限于TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；和j)以二维或三维模式布置在分化设备(一个或多个)上的各种类型的粘附活细胞。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备的多孔二维膜或三维支架或海绵体或胞外基质或任何其他组件在任意侧含有具有生物学活性的分子涂层，如包括但不限于下述的分子：a)刺激/促进细胞分化；b)刺激/促进细胞成熟；c)刺激/促进细胞迁移；d)支持细胞迁移；e)刺激/促进EMT或MTE；f)刺激增殖的活性分子；和/或g)支持细胞分化阶段/状态的活性分子。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备的多孔二维膜或三维支架或海绵体或胞外基质或任何其他组件可由下述材料组成，所述材料包括但不限于：a)刺激/促进分化；b)刺激/促进细胞成熟；c)刺激/促进细胞迁移；d)支持细胞迁移；e)刺激/促进EMT或MTE；f)刺激增殖的活性分子；和/或g)支持细胞分化阶段/状态的活性分子。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中多孔膜或任何其他组件的材料可具有细胞粘附性能或可防止细胞粘附。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备的多孔膜或海绵体或网状物或网状结构或纤维结构或任何其他组件具有从0.1微米至1000微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中多孔膜具有从5微米至12微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中多孔膜的孔形状可以是，但不限于：圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽或任意组合或所列举形状的重叠。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备的任何或所有的组件是生物可降解的。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中胞外基质或设备的任何其他组件(包括多孔膜、海绵体、网状物、网状结构、纤维和纤维结构)可具有同质结构或异质结构或倾斜结构或分层结构。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备浸入细胞培养基或缓冲液。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化设备浸入细胞培养基或缓冲液，并且其中培养基是固定的或经分化设备泵入。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中将细胞铺板/接种在顶面和/或在底部和/或中间或以其他各种取向在分化设备上(例如在二维或三维膜的顶面或底部)。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中细胞与细胞基质预混合并且接着接种在分化设备上或其中。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中方法分离未受未分化的细胞或不想要类型细胞污染的纯的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中方法纯化来自未分化细胞的细胞群体。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中方法分离未受不想要类型的细胞污染的细胞群体。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中期望的细胞群体分离自分化设备的顶部或底部或任何其他部分。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中期望的细胞群体的分离通过用破坏/消化胞外基质和/或分化设备任何其他组件的试剂(包括酶)的处理完成。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中在将细胞铺板或接种在分化设备中/其上之后或期间施加分化条件。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中在将细胞铺板或接种在分化设备中/其上之后或期间或之前施加分化条件。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中在迁移之前或/和期间或/和之后施加分化条件至细胞群体。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中期望的/目标细胞群体在迁移之后或期间分离。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中分化条件如下产生：a)将引导分化的分化信号添加进入培养基，包括生长因子和/或活性分子；和/或b)从培养基回收支持细胞特定未分化或分化状态的因子。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中细胞通过多孔结构进入胞外基质发生迁移，所述结构包括，但不限于：多孔膜；海绵体、纤维结构；网状物；和网状结构。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中细胞直接进入多孔结构或直接进入胞外基质发生迁移，所述结构包括，但不限于：多孔膜；海绵体；纤维结构；网状物；和网状结构。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中细胞迁移发生在二‑维或三维系统的表面。
另一方面，本公开提供基于制造激励细胞特定迁移的设备分离纯的或高纯度或富集的细胞群体的方法，其中细胞迁移发生在毛细管或导管或小管的内侧。
另一方面，本公开通过下述提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法：a)分化干细胞群体；和b)使分化的细胞迁移通过分化设备中的多孔膜，以分离纯的或富集的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞分化导致上皮‑至‑间充质转换(EMT)或间充质‑至‑上皮转换(MTE)。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞迁移包含：a)趋化性迁移；或b)通过经分化设备中的结构性能或组件布置的诱导的迁移。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中方法分离用于医学治疗、研究或商业目的的纯的或富集的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中医学治疗包含糖尿病或肝脏疾病治疗。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中干细胞是多能干细胞，其包含：a)胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、胚胎胚原基来源的干细胞或源自卵裂球的干细胞；b)分离自器官和组织的成体干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自胎儿组织的干细胞、分离自毛囊的干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞；或c)癌干细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中干细胞是人或哺乳动物干细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中分化细胞是原代细胞，其包含：a)源自内胚层的细胞；b)源自外胚层的细胞；或c)源自中胚层的细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中：a)源自内胚层的细胞包含腺细胞，包含外分泌分泌上皮细胞，激素分泌细胞或具有推进功能的纤毛细胞；b)源自外胚层的细胞包含来自皮肤系统的细胞，包含角化上皮细胞或湿分层屏障上皮细胞，源自神经系统的细胞，包含感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞或透镜状细胞；和c)源自中胚层的细胞，其包含新陈代谢和储存细胞、屏障功能细胞，包含来自肺、消化道、外分泌腺和泌尿生殖道的细胞，包括肾细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞或间质细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔膜任选地包含：a)包含由下述组成的一种或多种多孔二维或三维膜或海绵体的高表面积支架：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸钙；b)胞外基质，其包含人或非人胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、包含透明质酸的非蛋白聚糖多糖、源自重组技术或合成技术的材料或源自天然存在的来自人、动物、植物或原核生物的材料；c)纤维结构和纤维；d)海绵体；e)分泌自人细胞的细胞基质，其包括分泌自培养的人成纤维细胞的基质；f)网状物，其包括二‑维或三‑维网状物；g)网状结构；h)生长因子或它们部分的分子包含TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；或i)各种类型的粘附活细胞，其以二维或三维模式布置在分化设备上。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔二维或三维支架或海绵体或胞外基质或分化设备的任何其他组件被具有生物学活性的分子在任意侧上涂布，所述分子包括下述：a)刺激/促进细胞分化的分子；b)刺激/促进细胞的成熟的分子；c)刺激/促进细胞迁移的分子；d)支持细胞迁移的分子；e)刺激/促进EMT或MTE；f)刺激增殖的活性分子；或g)支持细胞分化阶段/状态的活性分子。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔膜或分化设备的任何其他组件具有细胞粘附抑制性能。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔膜或海绵体或网状物或网状结构或纤维结构或分化设备的任何其他组件具有从0.1微米至1000微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔膜具有从5微米至12微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中多孔膜的孔形状包括：圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽或任意组合或所列举形状的重叠。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中分化设备的任何或所有组件是生物可降解的。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中胞外基质或包括多孔膜、海绵体、网状物、网状结构、纤维和纤维结构的设备的任何其他组件包括同质结构或异质结构或倾斜结构或分层结构。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中分化设备浸入细胞培养基或缓冲液。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中培养基是固定的或经分化设备泵入。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中将干细胞铺板/接种在顶面和/或在底部和/或中间或以其他各种取向在分化设备上，其包括在二维或三维膜的顶面或底部。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中干细胞与细胞基质预混合并且接着接种在分化设备上或其中。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中方法分离未受未分化的细胞或不想要类型细胞污染的分化细胞的纯群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中方法从未分化细胞纯化分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中方法分离未受不想要类型细胞污染的分化细胞的群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中分离的纯的或富集的分化细胞群体分离自分化设备的顶部或底部或任何其他部分。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中纯的或富集的分化细胞群体的分离包括用破坏和/或消化胞外基质和/或分化设备的任何其他组件的化学试剂和/或酶试剂处理。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中在将细胞铺板或接种至分化设备中和/或其上之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中在迁移之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件至细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中分离的纯的或富集的分化细胞群体在迁移之后或期间分离。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞分化条件包括含a)将引导分化的分化信号添加至培养基，包括生长因子和/或活性分子；或b)从培养基回收支持细胞特定未分化或分化状态的因子。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞直接进入多孔结构或直接进入胞外基质发生迁移，所述多孔结构包括多孔膜、海绵体、纤维结构、网状物、网状结构。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞迁移发生在二‑维或三维系统的表面。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的方法，其中细胞迁移发生在毛细管、导管或管内。
另一方面，本公开提供通过本文所公开的方法制备的源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，设备包含a)多孔膜；和b)胞外基质。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群的分化设备，其中细胞分化导致上皮‑至‑间充质转换(EMT)或间充质‑至‑上皮转换(MTE)。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞迁移通过多孔膜发生。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞迁移包含：a)趋化性迁移；或b)通过分化设备中的结构性能或组件布置而诱导的迁移。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中设备分离用于医学治疗、研究或商业目的的纯的或富集的分化细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中医学治疗包含糖尿病或肝脏疾病治疗。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中干细胞是多能干细胞包括：a)胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、诱导多能干细胞、胚胎胚原基来源的干细胞或源自卵裂球的干细胞；b)分离自器官和组织的成体干细胞、分离自脐带血的干细胞、分离自胎儿组织的干细胞、分离自毛囊的干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞；或c)癌干细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中干细胞是人或哺乳动物干细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中分化细胞是原代细胞，其包含：a)源自内胚层的细胞；b)源自外胚层的细胞；或c)源自中胚层的细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中：a)源自内胚层的细胞包括腺细胞，包含外分泌分泌上皮细胞，激素分泌细胞或具有推进功能的纤毛细胞；b)源自外胚层的细胞包括来自皮肤系统的细胞，包括角化上皮细胞或湿分层屏障上皮细胞，源自神经系统的细胞，包括感觉传导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞或透镜状细胞；和c)源自中胚层的细胞包括新陈代谢和储存细胞，屏障功能细胞，包括来自肺、消化道、外分泌腺和泌尿生殖道的细胞，包括肾细胞、胞外基质分泌细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、色素细胞、生殖细胞、抚育细胞或间质细胞。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔膜任选地包含：a)包含由下述组成的一种或多种多孔二维或三维膜或海绵体的高表面积支架：聚碳酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或碳酸钙；b)胞外基质，其包括人或非人胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、包含硫酸肝素的蛋白聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、包含透明质酸的非蛋白聚糖多糖、得自重组技术或合成技术的材料或源自天然存在的来自人、动物、植物或原核生物的材料；c)纤维结构和纤维；d)海绵体；e)分泌自人细胞的细胞基质，其包括分泌自培养的人成纤维细胞的基质；f)网状物，其包括二‑维或三‑维网状物；g)网状结构；h)生长因子或它们部分的分子，包含TGF家族蛋白、激活素A、各种FGF、各种BMP、HGF、KGF、OSM；或i)各种类型的粘附活细胞，其以二维或三维模式布置在分化设备上。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔二维或三维支架或海绵体或胞外基质或分化设备的任何其他组件被具有生物学活性的分子涂布在任意侧上，所述分子包括下述分子：其a)刺激/促进细胞分化；b)刺激/促进细胞的成熟；c)刺激/促进细胞迁移；d)支持细胞迁移；e)刺激/促进EMT或MTE；f)刺激增殖的活性分子；或g)支持细胞分化阶段/状态的活性分子。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔膜或分化设备的任何其他组件具有细胞粘附抑制性能。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔膜或海绵体或网状物或网状结构或纤维结构或分化设备的任何其他组件具有从0.1微米至1000微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔膜具有从5微米至12微米任何大小的孔。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中多孔膜的孔形状包括：圆形、椭圆形、长方形、三角形、正方形、裂口/裂缝/狭槽或任意组合或所列举形状的重叠。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中分化设备的任何或所有组件是生物可降解的。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中胞外基质或包括多孔膜、海绵体、网状物、网状结构、纤维和纤维结构的设备的任何其他组件包括同质结构或异质结构或倾斜结构或分层结构。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中分化设备浸入细胞培养基或缓冲液。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中培养基是固定的或经分化设备泵入。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中将干细胞铺板/接种在顶面和/或在底部和/或中间或以其他各种取向在分化设备上，其包括在二维或三维膜的顶面或底部。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中干细胞与细胞基质预混合并且接着接种在分化设备上或其中。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中设备分离未受未分化的细胞或不想要类型细胞污染的分化细胞的纯群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中设备从未分化细胞纯化分化细胞的群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中设备分离未受不想要类型细胞污染的分化细胞的群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中分离的纯的或富集的分化细胞群体分离自分化设备的顶部或底部或任何其他部分。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中纯的或富集的分化细胞群体的分离包括用破坏和/或消化胞外基质和/或分化设备的任何其他组件的化学试剂和/或酶试剂处理。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中在将细胞铺板或接种至分化设备和/或其上之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中在迁移之前、和/或期间、和/或之后施加分化条件至细胞群体。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中分离的纯的或富集的分化细胞的群体在迁移之后或期间分离。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞分化条件包括a)将引导分化的分化信号添加至培养基，包括生长因子和/或活性分子；或b)从培养基回收支持细胞特定未分化或分化状态的因子。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞直接进入多孔结构或直接进入胞外基质发生迁移，所述多孔结构包括多孔膜、海绵体、纤维结构、网状物、网状结构。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞迁移发生在二‑维或三维系统的表面。
另一方面，本公开提供用于分离源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体的分化设备，其中细胞迁移发生在毛细管、导管或小管内。
另一方面，本公开提供通过本文所公开的分化设备制备的源自干细胞的纯的或富集的分化细胞群体。
在其他实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，通过如下进行：a)使多能干细胞群体与一种或多种分化信号接触，其模拟上胚层的上皮样细胞在原条的内移期间接收的信号；b)通过允许接触的细胞经历EMT使它们分化，以产生具有间充质表型的细胞；c)允许具有间充质表型的分化细胞迁移通过多孔膜进入三维ECM；和d)允许三维ECM中迁移的细胞以分化成高纯度DE。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中高纯度DE以大于90%的纯度分离。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中高纯度DE使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4或SOX2表达评估。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中高纯度DE被分离而没有OCT4‑阳性细胞的污染。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中高纯度DE含有多达80%的CXCR4或SOX17‑阳性细胞。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多能干细胞是人多能干细胞。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多能干细胞是人多能干细胞，其中人多能干细胞是hESC、hpSC或hiPSC。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多能干细胞是人多能干细胞，其中人多能干细胞是hESC、hpSC或hiPSC，其中hESC是WA09细胞系；并且hpSC是phESC‑1、phESC‑3、phESC‑5或hpSC‑Hhom‑1细胞系。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中分化信号是可溶性生长因子。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中分化信号是可溶性生长因子，其中分化信号是高水平激活素A信号或Wnt3a信号，其模拟细胞在原条内移期间接收的TGF‑β和Wnt信号。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多孔膜包含孔，其具有从约6μm至约10μm的直径。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多孔膜包含孔，其具有从约7μm至约9μm的直径。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中多孔膜包含直径约8μm的孔。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中三维ECM包含I型胶原和/或纤连蛋白。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，进一步包括将高纯化的DE分化成肝细胞或内分泌胰腺细胞的步骤。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，进一步包括将高纯化的DE分化成肝细胞或内分泌胰腺细胞的步骤，其中将高纯化的DE分化成肝细胞的步骤包括用FGF4、BMP2、肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M和地塞米松处理DE。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中高纯度DE通过这些方法制备。
另一方面，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的体外方法，其中非迁移未分化的多能干细胞分离自高纯度DE。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其包括：多孔膜；和三维ECM。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中高纯度DE以大于90%的纯度分离。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中高纯度DE以大于90%的纯度分离，其中高纯度DE使用免疫细胞化学和流式细胞术通过OCT4或SOX2表达评估。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中高纯度DE被分离而没有OCT4‑阳性细胞的污染。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中高纯度DE含有多达80%的CXCR4或SOX17‑阳性细胞。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中多能干细胞是人多能干细胞。
在另一实施方式中，本公开提供用于分离来自人多能干细胞群体的高纯度DE的设备，其中人多能干细胞是hESC、hpSC或hiPSC。
在另一实施方式中，本公开提供用于从hESC、hpSC或hiPSC的群体分离高纯度DE的设备，其中hESC是WA09细胞系；并且hpSC是phESC‑1、phESC‑3、phESC‑5或hpSC‑Hhom‑1细胞系。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中多孔膜包含孔，其具有从约6μm至约10μm的直径。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中多孔膜包含孔，其具有从约7μm至约9μm的直径。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中多孔膜包含直径约8μm的孔。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中三维ECM包含胶原I和/或纤连蛋白。
在另一实施方式中，本公开提供用于从多能干细胞群体分离高纯度DE的设备，其中高纯化的DE进一步分化成肝细胞或内分泌胰腺细胞。
人多能干细胞，包括hESC、hpSC和hiPSC，能够无限复制并且分化成所有三个胚层：内胚层、中胚层和外胚层的衍生物。因此，干细胞具有提供用于各种应用的无限来源细胞的潜能，所述应用包括用于宽范围人疾病的基于细胞的治疗，阐明细胞命运特化潜在的机制，并且作为用于确定药物化合物新陈代谢和毒理学性质的体外模型。有两个非常有希望的衍生自多能干细胞候选物批次的目标细胞类型：肝细胞和内分泌胰腺细胞，二者都源自共同的祖细胞——DE。
DE在原肠胚形成期间由经过胚胎原条并且经历EMT的外胚层细胞形成。一旦来自胚胎环境的分化信号发出，外胚层的上皮样细胞经历使其能够呈现间充质细胞表型的多重生物化学变化，其包括细胞内粘着复合物的破坏和上皮细胞特征性顶部‑基底(apico‑basal)极性的丢失。细胞骨架变化对于这些细胞离开上皮并且开始独立迁移是关键的。通过顶结构的形成和基底细胞骨架的瓦解开始发生这些改变。同时，金属蛋白酶活性导致根本基础膜的降解。因此，在经历EMT后，响应细胞获得迁移和侵入性能。EMT完成由间充质细胞迁移远离其起源的上皮层而发出信号。一旦形成，经内移起作用的原条产生中内胚层，其随后通过替换下胚层细胞经EMT(也称为上胚层‑中胚层转变)分离以形成中胚层和内胚层，其推测经历凋亡或经EMT有助于中胚层。
在二维(皮氏培养皿)体外系统，DE可源自使用高水平激活素A和Wnt3a信号的hESC、hpSC和/或iPS，其模拟在内移期间原条处接受细胞的TGF‑β和Wnt信号。除了来自可溶生长因子的信号，来自三维ECM蛋白的信号可被赋予干细胞的分化程序。在一种尝试中，检查了hESC在二维和三维培养系统中分化成肝细胞的潜能。胚胎体被插入胶原支架或培养在涂布胶原的培养皿中并且用外源生长因子刺激以诱导肝组织发生。尽管在胶原支架中得到的肝细胞样细胞与在二维培养系统中得到的肝细胞样细胞相比显示出更高水平的肝细胞标记物表达，但是最终细胞群体的纯度低。
往前进入临床的有希望干细胞类型之一可以是hpSC。首先期望制造的hpSC源自获得自被化学刺激物活化的未受精卵母细胞的胚泡内细胞团。不同的活化技术以及卵母细胞的自发活化允许产生HLA杂合hpSC，其与卵母细胞供体完全HLA匹配，或HLA纯合hpSC，其与人群体的主要片段是组织相容的。这些通用的HLA单倍型的匹配hpSC可减小在它们分化的衍生物的移植之后的免疫排异的风险；因此比源自具有单一组HLA基因的受精卵母细胞的hESC提供用于基于细胞的治疗的显著优势。此外，hpSC的产生克服了与hESC相关的伦理障碍，因为hpSC的衍生起源于未受精的卵母细胞。该新的多能干细胞类型在目前的工作中与hESC一起使用。
hpSC是具有大量潜能的多能干细胞，作为用于基于细胞治疗的细胞来源：hpSC可具有相比hESC的组织相容性优势，并且hpSC的衍生不需要有活力的胚泡破坏。对于所有基于多能干细胞治疗的平移，不被未分化细胞污染的分化细胞产物的衍生是主要的技术障碍。所公开的方法和本文提供的设备设计为克服该障碍。另外，已经发现肝细胞样细胞的高度富集培养物可使用所公开的直接分化方案衍生自hpSC。
所公开的方法和设备基于捕获原肠胚形成阶段胚胎重要特征的新3D‑分化系统。这些方法和设备利用可溶性生长因子以诱导多能干细胞的分化，三维ECM，以促进细胞‑细胞和细胞‑ECM相互作用，和物理路径(孔)通过膜用于促进细胞迁移。已经发现，该系统应用至各种多潜能细胞系产生高纯度DE而没有OCT4‑阳性细胞的污染。另外，已经发现所得高纯度DE可被进一步分化成有功能的肝细胞样细胞(HLC)。所公开的方法和设备也提供来自hpSC的高度富集的HLC分化的第一例证。
在脊椎动物原肠胚形成期间，已经获得间充质表型的外胚层细胞迁移通过原条以形成DE和中胚层(图1A)。基于类似的体外迁移行为，本公开提供方法和分化设备，其从未分化的多能干细胞分离DE。(图1B、1C和1D)。这些方法和设备的特征包括使用在其上可培养hpSC(分化的)的膜；通过它们迁移通过膜中孔的能力而分离；和在膜下面的三维ECM，通过其分化细胞可迁移并且包埋。
图1A‑1D图解了在体内和体外两种条件下在DE分化期间的细胞迁移。A)体内：在原肠胚形成期间通过原条的细胞迁移的示意图。外胚层的上皮样细胞(橙色)经历EMT和取得迁移能力(绿色细胞)。这些细胞内移通过原条，取代内胚层细胞(黄色)，接着进一步分化成中胚层和DE。B)体外：模仿通过原条迁移的3D‑分化设备的示意图。在分化信号下，多能干细胞(橙色)经历EMT(绿色细胞)。这些细胞迁移通过膜孔进入三维ECM(黄色)和在高水平激活素A信号下继续朝着DE分化。因此通过膜分化细胞从未分化细胞分离并且DE的高纯度群体被分化并且物理分离。C)石蜡包埋的、3D‑分化系统切片的苏木素和曙红染色显示在分化3天之后3D‑分化系统中细胞的2个区室，一个群体在膜上一个在膜下。D)石蜡包埋的、3D‑分化系统切片的免疫荧光标记表明，位于膜下方的DE细胞的身份(SOX17‑阳性细胞核，绿色)不同于位于膜上方分化的和未分化的(OGT4‑阳性细胞核，红色)细胞混合物。在DE分化之后3天制备切片。
在施加的生长因子、三维ECM和分化方案中包括的表面提示下，发现细胞展示数个EMT特点。例如，结合处蛋白的下调是EMT的必要部分。钙粘着蛋白是一类1型跨膜蛋白，其在细胞粘附中起着重要的作用，确保组织内的细胞结合在一起。发现分化细胞中E‑钙粘着蛋白基因表达(图2A)伴随着E‑钙粘着蛋白细胞‑表面免疫定位的丧失(图2B)。有效的细胞迁移需要N‑钙粘着蛋白。发现N‑钙粘着蛋白的上调发生在分化细胞的信息(图2A)和蛋白水平(图2C)。细胞中EMT的诱导也通过肌动蛋白细胞骨架的特征性结构重排确认。未分化的干细胞具有相对少的焦点粘附，肌动蛋白丝的外皮排列和桩蛋白的主要细胞质库(图2D)。响应于分化方案的细胞中，肌动蛋白应力纤维取代皮层肌动蛋白网络和焦点接触蛋白桩蛋白，从主要细胞质分布再定位至良好组织的肌动蛋白应力纤维末端的主要焦点粘附位置(图2D)。这些结构重排伴随着获得EMT需要的另一至关重要的行为——细胞迁移的能力。
图2A‑2F图解了在分化信号下，多能干细胞经历EMT并获得迁移的能力。A)RT‑qPCR显示在hpSC分化期间E‑钙粘着蛋白表达的下调和N‑钙粘着蛋白表达的上调。dO表示获自细胞的结果，所述细胞在诱导分化之前收集自多孔膜上方。d1、d2、d3表示在开始分化方案24，48，和72小时之后，在膜下从三维ECM收集的细胞获得的结果。Y‑轴表示相对于d3时间点规范化的基因表达。图中的数据使用SD误差条表示。B)未分化的和分化的培养物的免疫荧光标记表明在应用分化信号(Oh)之前在未分化细胞中存在E‑钙粘着蛋白表达和在开始分化方案72小时之后(72h)在从三维ECM收集的细胞中缺少E‑钙粘着蛋白表达。图像分成绿色加蓝色通道(E‑钙粘着蛋白和DAPI)。C)分化的培养物的免疫荧光标记表明在开始分化方案24小时之后，从三维ECM收集的细胞中N‑钙粘着蛋白的表达。图像分成绿色(N‑钙粘着蛋白，左侧)和绿色加蓝色通道(N‑钙粘着蛋白和DAPI，右侧)。D)相位差和间接免疫荧光显微镜检查表明经历EMT的细胞的细胞骨架重排特征。每个图显示4个版本：相位差(灰度标，最左侧)、肌动蛋白(红色，中间左侧)、桩蛋白(绿色，中间右侧)，和肌动蛋白、桩蛋白和DAPI的重叠(最右侧，DAPI为蓝色)。在开始分化方案的36小时之后(36h)，肌动蛋白应力纤维已经取代在分化之前(Oh)存在的皮层肌动蛋白网络，并且焦点接触蛋白桩蛋白已经从细胞质再定位至在肌动蛋白应力纤维末端的焦点粘附。肌动蛋白细胞骨架使用连接类鬼笔素的546被可视化。E)迁移试验：直条表示在分化之前(dO)、在开始分化之后24小时(d1)和48小时(d2)，在多孔膜下收集的细胞的数目。显示三个不同的迁移条件：单独膜(“没有3D‑胞外基质”)、具有三维ECM的膜(“3D‑胞外基质”)和具有补充纤连蛋白的三维ECM的膜(“具有FN的3D‑胞外基质”)。图中的数据使用SD误差条表示。F)由RT‑qPCR测定在干细胞分化成DE期间整联蛋白表达的时间动态。Y‑轴显示相对基因表达的水平。dO至d3表示从开始分化的天数。图中的数据使用SD误差条表示。
可通过下述细胞迁移通过分化设备膜中的孔，评估未分化的和分化细胞迁移的能力。在一些实施方式中，孔可具有从约6μm至约10μm的直径。在其他实施方式中，孔可为从约7μm至约9μm的直径。在其他实施方式中，孔可形成约8μm的直径。在平铺在膜上的60万细胞分化之前(0天)，在膜下未观察到可检测的细胞数目。但是，在分化条件下在膜下检测的细胞的数目逐天增加。分化的第二天，约50万细胞到达膜的下侧，如果三维ECM不施加至系统。三维ECM施加至膜的下侧在第二天产出超过80万的迁移细胞(图2E)。在这些研究中使用的三维ECM主要是I型胶原。因为基片含有纤连蛋白，也测试补充纤连蛋白的三维ECM。利用纤连蛋白，在分化第二天在三维ECM中检测的细胞的数量比在不含有纤连蛋白三维ECM系统中的1.5‑倍高，并且比仅具有膜的系统高2.7‑倍(图2E)。最终，在DE分化的结束时，含有膜和补充纤连蛋白的三维ECM的系统促进相当好的分化和迁移效率：第三天从60万未分化的平铺的hpSC，大于160万细胞迁移通过膜。相比之下，阴性对照实验表示使用正常生长培养基的hpSC或hESC持续培养不产生在多孔膜下可检测数目的细胞。在分化条件下，也观察到整联蛋白的降低表达，细胞表面受体介导细胞附着至胚基片(图2F)。该结果与分化细胞在经历EMT之后取得弱化的附着结合处和促进活性迁移的表达模式的观察一致。
迁移进入三维ECM的细胞被表征以测定在分化期间它们DE‑特定基因的动态表达。在开始分化24小时之后，原条标记物短尾（brachyury）在这种细胞中以高水平表达(图3A)。所有与脊椎动物DE相关的FOXA2、CER1和SOX17转录体也在第一个24小时后展示快速增加的表达。趋化因子受体CXCR4的表达相对于其他DE标记物延迟24小时，但是在48小时时是可检测的。这4个DE标记物的表达维持3天，但是高的短尾基因表达是暂时的，并且在第2天被抑制。多潜能性基因SOX2和OCT4在3天分化期间快速下调(图3A)。因此，迁移通过膜进入三维ECM的细胞表明基因表达的时序与在脊椎动物原肠胚形成期间DE分化过程中发生的类似。
图3A‑D图解了三维(3D)分化系统产生高纯度DE。A)RT‑qPCR显示在干细胞分化成DE期间标记物基因表达的时间动态。Y‑轴表示在迁移和包埋在设备的三维ECM之后(灰条)或来自塑料平皿(白条)的细胞相关基因表达。dO表示在分化诱导之前从多孔膜上方或从塑料平皿收集的细胞获得的结果。d1、d2、d3数据来自分化24、48和72小时之后从膜下三维ECM或塑料平皿收集的细胞。图中的数据使用SD误差条表示。B)免疫荧光标记表明在3D‑分化系统中朝着DE分化期间，SOX17和短尾(BRACH)原条标记物的共表达。在分化24小时之后(24h)，大部分细胞表达短尾(红色)。在48和72小时，短尾表达是不可检测的并且SOX17表达(绿色)增加。在36小时，大部分细胞表达两种蛋白(橙色和黄灰色)，反映短尾‑阳性前体转变成SOX17‑阳性DE。C)在2D‑(“塑料平皿”)和3D‑(“3D‑胞外基质”)系统中得到的DE的流式细胞分析。图显示从分化设备的三维ECM或从塑料平皿收集的细胞分化3天时细胞的数目对荧光强度。解离细胞并且用抗‑CXCR4抗体染色。可使用相同的细胞进行同种型匹配的对照抗体染色，以测定背景荧光。D)流式细胞分析表明在分化的3天时，在从分化设备的三维ECM收集的DE培养物中缺乏OCT4‑阳性细胞。在支持多潜能性的条件下培养的未分化细胞作为阳性对照。可使用相同的细胞进行同种型匹配的对照抗体染色，以测定背景荧光。
另外，与在2D‑环境中相同培养基中分化的细胞相比较，迁移进入三维ECM的细胞显示更快的多潜能性基因下调的动力学、显著更高水平的内胚层基因表达(SOX17、FOXA2、CER1、CXCR4)、在24h更高峰水平的短尾信息，和48h更快速降低的短尾表达(图3A)。在激活素A处理末尾，包埋在三维ECM中细胞中，未观察到与胚外内胚层(SOX7、AFP)、中胚层(FOXF1、BMP4、MEOX1、FLK1)、外胚层(SOX1、SOX2)或滋养外胚层(HCG、CDX2)相关的转录体一致的增加。
在2D‑分化DE范例中，hpSC以及hESC继续进行在原肠胚形成期间发生的基因表达顺序事件，如当多能干细胞经历与短尾表达启动同时的EMT时可见，并且SOX17‑阳性细胞源自短尾‑阳性前体。为了跟踪迁移进入三维ECM中细胞群体中表达SOX17细胞的起始点，表征随着时间推移的SOX17和短尾免疫反应性。在24小时有大量的短尾‑阳性细胞核；到分化36小时，大于一半的表达SOX17的细胞也是短尾免疫反应性的，并且在48和72小时，大部分细胞表达SOX17，但是再也检测不到短尾蛋白(图3B)。
利用三维‑分化系统，常规观察到三维ECM中绝大多数的细胞在激活素A处理的结尾是SOX17‑阳性的，如通过免疫细胞化学测定。为了量化细胞群体的纯度，进行细胞表面趋化因子受体CXCR4的流式细胞分析。在激活素A处理的结尾，三维ECM中大于90%的细胞是CXCR4‑阳性的(图3C)。相反，在使用相同分化方案的2D‑系统中，源自hpSC的约一半细胞是CXCR4‑阳性的。
最近公开的报道表明含有多达80%的CXCR4‑或SOX17‑阳性细胞的DE群体可以使用常规2D‑培养系统获自人多能干细胞。这些高度富集的DE培养物与初始多潜能细胞相比较具有显著减小的OCT4表达(4‑5倍)，但是未分化的OCT4‑阳性细胞在移植之后仍然是畸胎瘤的潜在来源。在最终分化的培养物中残留的OCT4‑阳性细胞的问题比使用传统2D分化方案的hpSC更严重：在DE分化的3天过程之后，50%或更多的细胞是OCT4‑阳性。因为未分化的细胞(像上皮细胞)具有有限的迁移能力，在所公开的3D分化系统中膜的主要优点是它用于从DE细胞群体分离未分化的OCT4‑阳性细胞，通过对分化设备上的两个细胞群体染色而确认(图1C)。此外，在所公开的3D‑分化系统中，在分化的培养物中观察到OCT4基因表达的大于11‑倍的降低(图3A)。这些观察导致确定在使用3D‑分化系统产生的DE群体中OCT4阳性细胞的数量。使用OCT4特定抗体、使用位于膜下侧分化培养物的免疫组织化学染色进行三个独立的实验。未分化细胞的培养物用作阳性对照。在每个实验中分析至少3000个细胞核。在从3D‑培养系统的膜下侧分离的任何培养物中没有观察到OCT4‑阳性细胞。通过FACS分析确认在分化的3天结束时，在从膜下分离的最终DE群体中缺乏OCT4‑阳性细胞(图3D)。
可通过将它们进一步分化成HLC来测试获得的DE细胞的发育能力。激活素A处理之后，分化细胞用FGF4和BMP2处理，其支持前肠的腹部区域参与肝脏‑细胞命运。甲胎蛋白(AFP)和白蛋白基因表达在第6天变得可检测，并且在分化过程期间持续增加(图4A)。AFP表达在第5天之前是不可检测的，如所期望如果大量的胚外内胚层细胞出现在培养物中。在FGF4和BMP2处理结束时，三维ECM中细胞的形态学类似肝细胞典型的立方形形状(图4B)。此外，来自该群体的大部分细胞表达AFP、细胞角蛋白18(CK18)和肝细胞核因子3β(HNF3β)，通过免疫细胞化学检测(图4C)。
图4A‑4F提供3D‑分化系统中源自DE的HLC的特征。A)RT‑qPCR表明在DE朝着HLC分化期间从三维ECM收集的细胞中甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)基因的逐渐上调。Y‑轴表示相关基因的表达。从多潜能细胞向DE开始分化的起始计数分化的天数。图中的数据使用SD误差条表示。B)相位差图像显示在分化方案的8天时，三维ECM中HLC的立方形形态学。C)位于三维ECM中细胞的免疫荧光标记表明分化8天时早期肝细胞标记物的表达。D)RT‑qPCR显示在朝着HLC分化期间增加的甲胎蛋白(AFP)基因表达。从分化设备的三维ECM收集的细胞的AFP表达(实线)比从塑料平皿中收集的细胞的AFP表达(虚线)更高。Y‑轴表示规范化至d3时间点的相关基因表达。图中的数据使用SD误差条表示。E)RT‑qPCR表明在朝着HLC分化结束时肝细胞标记物的表达。Y‑轴表示从3D‑分化系统中收集的细胞中相关基因的表达(灰条)，规范化至肝细胞系HepG2中收集的细胞中的相关基因的表达(白条)。深灰条‑源自hpSC系phESC‑3的HLC；浅灰条‑源自hESC系WA09的HLC。图中的数据使用SD误差条表示。F)位于三维ECM中细胞的免疫荧光标记表明分化方案结束时白蛋白(ALB)和α‑1‑抗胰蛋白酶(AAT)的表达。
为了促进在3D‑分化系统中得到的早期肝细胞的成熟，在制瘤素M(OSM)和地塞米松(Dex)之后可使用肝细胞生长因子(HGF)处理。当添加HGF至培养基时，分化的培养物显著增加AFP基因表达(图4D)。用3D‑系统得到的细胞的该增加比在2D中暴露于相同分化方案的细胞大5倍。该观察可以是3D培养物更高HLC纯度和/或在三维ECM系统中培养的细胞比在塑料平皿中分化的单层细胞以更高水平表达肝脏‑特定蛋白的可能性的结果。
发现3D‑分化系统中得到的HLC表达许多肝系基因，包括HNF4a、a1‑抗胰蛋白酶(AAT)、转甲状腺素蛋白(TTR)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)和苯丙氨酸羟化酶(PAH)(图4E、4F)。必须注意，这些肝细胞标记物的表达水平与源自hpSC的HLC和源自hESC的HLC类似(图4E)。这些HLC具有肝细胞的功能特点，包括糖原贮积[图5A中过碘酸雪夫氏（periodic acid‑schiff）(PAS)染色显示]和吲哚菁绿的摄取和消除(IGC；图5B)。PROD试验表明通过hpSC衍生的HLC烷氧基9‑羟基异吩噻唑(alkyloxyresorufin)水解成9‑羟基异吩噻唑(resorufin)，确认细胞中的细胞色素CYP2B活性(图5C)。实时定量PCR(RT‑qPCR)也表明CYP2B mRNA和其他三种P450细胞色素，CYP3A7、CYP3A4和CYP7A1(图4E)。为了测定获得的HLC的纯度，进行位于三维ECM中培养物的流式细胞计数并且对特定肝细胞标记物染色。FACS分析显示大部分细胞表达AFP和AAT；相比同种型对照，通道增加AFP为3.63‑倍和AAT为1.63‑倍。
图5A‑5G提供3D‑分化系统中源自DE的HLC的特征。A)PAS染色(粉红色)表示获得的HLC存储糖原。细胞核用苏木素复染色(紫色)。B)绿色表示被3D‑分化系统中得到的HLC摄取的ICG。C)3D‑分化系统中得到的HLC展示细胞色素P450酶活性，如PROD试验评价。在该合并的荧光/相位差图像中的亮红色表示，非荧光烷氧基9‑羟基异吩噻唑已经被P450细胞色素CYP2B水解成荧光9‑羟基异吩噻唑。D)RT‑qPCR表明朝着HLC分化结束时肝细胞标记物的表达。Y‑轴表示在从3D‑分化系统中收集的细胞(灰条)中的相关基因表达，标准化为从成人肝脏分离的人原代肝细胞的那些(白条)。图中的数据使用SD误差条表示。E)流式细胞分析表明，在3D‑分化系统中得到的CFSE‑标记的HLC移植42天之后，在从小鼠肝脏中分离的细胞群体中存在CFSE‑阳性细胞(“HLC”图)。分析从对照肝脏分离的细胞群体(仅仅用培养基接种)以测定背景荧光。F)冷冻的未固定组织切片的荧光显微镜分析表明，在从3D‑分化系统中得到的CFSE‑标记的HLC移植42天之后，小鼠肝脏中存在CFSE‑阳性有活力的细胞。G)冷冻组织切片的免疫荧光标记表明，在3D‑分化系统中得到的HLC移植42天之后，小鼠肝脏中存在表达人白蛋白(ALB)的细胞。
为了估计HLC的成熟阶段，可进行与末端分化的原代成人肝细胞关联的基因表达水平的比较分析。如在图5D中所观察到，RT‑qPCR分析揭示与人原代肝细胞相比较，显著更高水平的AFP(通常在胎儿中表达，但不在成体肝细胞中表达)、CYP1B1和CYP1A1(人成体肝脏中缺乏或以非常低水平存在)的表达。HLC表达非常少的通常在成体肝细胞中表达的CYP2B6、CYP2D6、CYP3A4和UGT2B7。肝细胞另一标记物TTR的表达在所有测试的细胞中保持相同水平(图5D)。总之，结果显示胎儿比成人更多的细胞表达特征。也观察到在该系统中得到的HLC继续增殖，对于Ki67蛋白——增殖细胞的标记物，多达14%的细胞核染色。
为了评估得到的HLC体内存活的力，CFSE‑标记的细胞被移植进入免疫缺陷小鼠。用CFSE标记，允许清楚检测移植的细胞，与细胞功能相关联并且允许这些细胞通过荧光显微镜检查可视化。在移植之后大于40天，通过流式细胞术在小鼠肝脏中检测到明显的CFSE细胞群体。此外，在FACS柱状图上的三个实体峰表明接种的HLC的至少三个连续世代(图5E)，与增殖表型一致。也在宿主肝脏切片中观察到存活的CFSE阳性细胞块(图5F)。这些切片的免疫组织化学分析表明存在表达人白蛋白的细胞(图5G)。这些数据表示，源自高纯度DE的HLC能够从脾迁移整合进入肝脏，增殖并且存活至少42天。
所公开的3D‑分化系统在人多能干细胞的5个不同系上测试，包括1个hESC系(WA09)，和4个hpSC系(phESC‑1、phESC‑3、phESC‑5和hpSC‑Hhom‑1)。使用phESC‑3获得结果。但是，所有5个干细胞系给出类似的结果，包括产生多达92%的CXCR4阳性细胞的高纯度DE，在分化成DE期间基因表达的适当时间动态，适当DE标记物的表达和进一步分化成表达肝细胞标记物和行使肝细胞功能的能力。
设计这些体外实验以再现外胚层细胞在胚胎发育期间它们迁移通过原条并且分化成DE遇到的条件和微环境。中内胚层的迁移能力可用于分离从多潜能phSC分化的DE的高纯度群体。分化设备利用附着至多孔膜底部的三维ECM的关键排列。多能干细胞(hpSC或hESC)平铺在膜的顶面，并且暴露于已知引导朝着DE分化的可溶性生长因子。细胞通过基因表达、形态学和行为标准经历EMT，并且取得迁移和侵入性能，如分化细胞块迁移通过膜孔进入在膜下侧的三维ECM所表示。观察到的细胞迁移是非常令人回忆的生理学过程，其发生在当外胚层细胞内移通过原条时，脊椎动物原肠胚形成期间。
多孔膜和三维ECM二者表现出对于提高分化设备的性能是重要的。多孔膜设计为从最终细胞群体中排除未分化细胞。选择小于未分化细胞直径的多孔尺寸，以便膜仅可被取得对于迁移通过作为EMT部分的小孔的细胞骨架变化的细胞通过。设计的成功得到在细胞暴露于分化提示之前，甚至在多潜能性保持条件下延长培养时间之后，在膜下方几乎完全缺乏细胞所支持。因此，多孔膜通过在整个生长和分化范例中排除未分化细胞对获得的DE的纯度有贡献。
许多报道提示，ECM在包括与原肠胚形成关联的分化在内的胚胎发育期间对于调节干细胞分化成不同的谱系起到关键的作用。在所公开的设备中，三维ECM可在几个方面增强细胞分化效率。可能有一些来自ECM本身的直接(向性)信号，促进迁移通过多孔膜，因为当ECM添加至系统时，迁移细胞的数量增加，并且当纤连蛋白添加至ECM时进一步增加。该发现与早期的报道一致，即，胶原支架可对分化肝细胞有吸引力。
另外，三维ECM促进的3D‑细胞分布可能促进细胞‑细胞信号，其近似在原肠胚形成期间细胞之间的相互作用，是3D优于2D系统的理论优势。3D环境，其中每个细胞被类似细胞围绕，这可加强每个细胞从其邻居经历的化学信号，帮助同步和促进整个细胞群体的分化。该设想与下述观察一致：在分化至DE期间，3D‑系统的基因表达的特征性变化相比2D‑系统范围更大，并且时间上更窄。这也与生长文献一致，显示当在3D与2D中培养时许多细胞类型具有不同的分泌特征。
这些结果显示在激活素A处理结束时在三维ECM中检测的细胞类型是可信的DE。在蛋白和RNA水平的标记物分析与DE的形成一致。因为短尾表达在早期内胚层系中还未鉴别到，SOX17表达在短尾‑阳性前体中启动的观察，与缺乏SOX7和AFP表达一起进一步巩固SOX17‑阳性细胞是DE而不是也可迁移的早期内胚层的结论。获得的DE的纯度非常高，对于研究的所有干细胞系，流式细胞术显示大于90%的CXCR4阳性细胞。在使用2D‑系统的类似研究中，可信的DE细胞的分数报道为不同的hESC系为50‑80%和hpSC为50%或更少。
三维ECM中进一步引导的DE细胞分化产生HLC，其存储糖原，摄取并且消除IGC，并且表达活性CYP2B酶，和使用P450细胞色素CYP2B水解戊氧基9‑羟基异吩噻唑成为9‑羟基异吩噻唑。细胞也呈现成熟肝细胞的特征性立方形形状，并且表达多种肝细胞基因和蛋白，包括P450细胞色素家族的4个成员。这些结果表示，DE细胞的分化能力，和三维ECM作为细胞分化环境的效率。成体细胞色素的全部储备对于在毒性研究中使用这些细胞可能是必须的，但是胎儿肝细胞表型可在进一步表征之后用于选择的儿科肝脏疾病患者的临床移植。人胎儿肝细胞移植已经在所选择的儿科群体中使用并且在临床研究下用于成体的慢性肝病。
发现所公开的3D‑条件优于2D‑培养系统用于产生纯的群体DE并且用于有效地产生HLC。在DE衍生期间，3D‑系统诱导特征性内胚层基因的更大表达，基因表达更好定义的时空峰，并且在激活素A处理之后更高百分数的CXCR4‑阳性细胞。在进一步分化DE至HLC之后，3D‑系统中的大部分细胞行使相同的肝细胞功能，而2D‑系统仅仅产生HLC分离的群落。
这些结果可在干细胞和发育生物的未来工作中具有数种提示。首先，利用其能力排除响应不同信号的一些细胞类型，3D‑分化系统可允许从宽范围的多能干细胞中衍生高纯度细胞群体。不同细胞系的一致结果提示能够响应于直接DE分化信号的任何多能干细胞将在3D‑分化设备中产生DE细胞分离的高纯度群体。
其次，迁移通过多孔膜提供的选择性，与三维ECM提供的生理学条件可用于广泛的应用，包括在干细胞分化期间分离各种细胞群体，从不同的组织分离原代细胞培养物，或对细胞迁移和入侵的研究，包括细胞内移进入原条。膜孔尺寸和三维ECM的组成可变化以适应应用，但是基本技术可应用于具有迁移能力的任何细胞类型或应用于具有不同的迁移能力的细胞群体。
第三，ECM的组成在细胞分化中是重要可变化的，并且分化设备的该组分应当进一步最优化。源自小鼠胚胎干细胞的肝细胞对ECM组成敏感，并且I型胶原可以是最优的，用于引导胚胎干细胞朝着肝细胞系。在所公开的分化设备中，含有I型胶原的ECM可用作主要的组分。但是，设备中ECM或其他蛋白的不同组合对于其他细胞类型和分化过程可能是最优的。
第四，用3D‑分化系统实现的高纯度可减小对其他分离和纯化方法比如FACS和磁性细胞分类的需要。细胞减小的应力可改善在朝着最终细胞系的任何进一步分化的产率和选择性。在DE中实际缺乏OCT4‑阳性细胞在从多能干细胞开发安全的细胞产物中是重要步骤。
最终，这些结果可帮助确立hpSC作为干细胞技术开始材料的有用来源。孤雌生殖干细胞避免一些与hESC相关的伦理问题。它们可也减小基于细胞的治疗的免疫抑制要求，因为它们可产生具有HLA‑纯合性与人群体的大部分是组织相容的。直到最近，就hpSC用于引导分化成期望细胞系的能力知道的很少。hpSC的早期研究仅仅表明它们体外和体内自发分化的能力。动物研究已经显示孤雌多潜能细胞可分化成有功能的细胞。但是，使用来自非人灵长类和小鼠的细胞的研究提示孤雌多能干细胞能够足月发育，并且可分化成身体成熟和有功能的细胞。例如，产自灵长类孤雌生殖干细胞的多巴胺神经元显示中脑区域和细胞‑特定转录因子的持久表达，其确立它们适当的身份并且允许它们的存活。这些孤雌多巴胺神经元的移植已经恢复偏侧帕金森，6‑羟基‑多巴胺‑损伤大鼠中的马达功能。此外，从体外培养的小鼠孤雌生殖干细胞经四倍体胚胎互补产生活的孤雌生殖小狗，其有助于胎盘发育。最近也调查了人孤雌生殖干细胞的分化能力。发现，在hpSC朝着定形内胚层分化中，基因表达的时间顺序与脊椎动物原肠胚形成中出现的和在hESC朝着定形内胚层分化中类似。也表明，从高纯度视网膜色素上皮细胞细胞(RPE)的hpSC衍生表达适当的RPE标记物并且表现吞噬功能活性。该工作结合本公开对肝细胞样细胞衍生的结果，表明人孤雌生殖干细胞可能的确是朝着高纯度、有功能的细胞类型分化。总之，本公开提供新的方法和分化设备，其通过将细胞迁移能力和3D胞外基质并入分化过程而提高得到的细胞的纯度。这些方法和设备从大量人多能干细胞系产生高纯度的定形内胚层和肝细胞样细胞。利用该设备的结果提供人孤雌生殖干细胞分化能力的证据。另外，这里测试的技术可用于大量涉及原代细胞类型的细胞分化和分离的应用。例如，最近表明hpSC分化成高纯度视网膜色素上皮细胞(RPE)，其表达适当的RPE标记物并且是吞噬性的。RPE分化结合在该报道中的结果指示，hpSC可的确分化成高纯度、有功能的细胞类型。
下述实施例打算是示例性的而不限制本发明。
实施例
实施例1：细胞培养和分化
未分化的hpSC和hESC生长在敲除（KnockOut）‑DMEM/F12中的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层中，所述敲除（KnockOut）‑DMEM/F12补充有15%KnockOut血清替代品、0.05mM非必需氨基酸、2mM Glutamax‑I、青霉素/链霉素，55uM 2‑巯基乙醇(都来自Invitrogen)；补充5ng/ml重组人FGF‑碱性(PeproTech)和20ng/ml重组人激活素A(rh‑激活素A；R&D系统)。培养物以1:4‑1:6的比每5‑7天人工传代和分开。HepG2细胞(ATCC)培养在如下述用PureColTM(Advanced BioMatrix)制备的三维ECM中，在补充10%胎牛血清(HyClone)的DMEM(Invitrogen)中。
对于分化过程，hpSC或hESC以高密度铺在分化设备膜的顶部(图1B)。对照培养物铺在用具有10%胎牛血清(FBS)(HyClone)的DMEM(Invitrogen)预处理的塑料平皿上(细胞培养处理的；Corning)，并且在上述生长培养基中进一步培养2‑5天直到开始分化过程。分化设备基于具有含有8urn孔(Whatman)合成膜的25mm组织培养插入物(Nunc)。对于大部分实验，三维ECM层施用于多孔膜下侧。
根据制造商的说明在冰上从PureColTM与10×细胞培养基的混合物制备ECM，添加或不添加人纤连蛋白(Sigma)至最终浓度为100ug纤连蛋白/ml ECM。(具有纤连蛋白的ECM仅仅用于细胞迁移试验)。为制造三维ECM薄层，200pi冰冷的ECM混合物均匀分散在组织培养插入物膜的下侧并且在37℃温育60min以诱导凝胶化。在细胞接种之前，将细胞培养基添加(过夜)至含有三维ECM的每个插入物。
按照公开的方案，在补充有Glutamax‑I、青霉素/链霉素和0.5mg/ml人血清白蛋白(Sigma)的RPMI1640(Invitrogen)中进行分化成DE。对于第一个24小时，该培养基补充100ng/ml rh‑激活素A和75ng/ml重组小鼠Wnt3a(R&D系统)。对于接下来的48小时，培养基补充0.2%人AB血清(Fisher BioReagents)和100ng/ml rh‑激活素A。Wnt3a结合激活素A增加中内胚层——DE和中胚层的双潜能前体的特化效率，并且提高hESC(12)和hpSC(55)经历DE形成的同步性。
为得到HLC，位于分化设备三维ECM中的DE培养物在补充20%KnockOut血清替代品、30ng/ml FGF4(PeproTech)和20ng/ml BMP2(PeproTech)的KnockOut‑DMEM/F12中培养3或5天。接着，细胞在补充20%KnockOut血清替代品和20ng/ml HGF(PeproTech)(代替FGF4和BMP2)的KnockOut‑DMEM/F12中培养3或5天。最终，细胞在补充SingleQuots(Lonza)、20ng/ml制瘤素M(R&D系统)和0.1uM地塞米松(Sigma)的HCM培养基(Lonza)中培养5天。所有的分化实验进行至少三次。图形数据误差条都表示标准偏差。
实施例2：细胞迁移试验
将hpSC和hESC平铺在分化设备的膜的顶部，并且进行上述分化方案。在分化过程的0、1和2天收获细胞。在PBS中轻轻洗涤插入物并且使用干棉签从插入物(在膜的顶部)中去除细胞随后在PBS中洗涤两次。为了分离包埋在三维ECM(或在插入物可被使用而没有三维ECM的情况下在膜的下侧)中的完整细胞，用PBS洗涤设备两次并且在1000U/ml胶原酶溶液(Invitrogen)中37℃下温育30分钟。在胶原酶溶液中温育之后，小心地从膜的底部收集细胞块的悬浮液并且离心。为了获得单细胞悬浮液，使用0.05%胰蛋白酶(Invitrogen)在37℃下进一步分离沉淀物1‑2分钟，接着离心，重新悬浮在具有3%FBS的PBS中，并且用血球计计数。
实施例3：免疫染色和形态学染色
将培养物在PBS的4%低聚甲醛中室温下固定25分钟，并且在PBS的0.1%TritonX‑100中渗透化处理40分钟。在免疫染色之前，具有附着的三维ECM和包埋的目标细胞的膜从组织培养插入物中手动拆除。在这些研究中使用的抗体和稀释倍数总结在表1。载玻片(slide)安装在含有DAPI的Vectashield安装培养基中(VectorLaboratories)。
表1

为了测定迁移细胞的组织学和表型特点，完整切割包被ECM的组织培插入物的滤膜，固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，并且切片(5‑μm)。随着脱石蜡和再水化，用苏木素和伊红红(H&E)染色切片。对于膜上的原位免疫组织化学，可用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)进行抗原修复。用抗‑Oct4和抗‑Sox17共染色切片，以将未分化的hpSC与DE区分开。在用适当的第二抗体标记并且用DAPI复染色细胞核之后，使用Zeiss荧光显微镜捕获切片。
实施例4：实时定量PCR(RT‑qPCR)
根据制造商的说明(Qiagen)，使用QIAsymphony自动化纯化系统分离总RNA。100‑500ng总RNA可用于利用iScript cDNA合成试剂盒(Bio‑Rad)进行逆转录。使用每个反应1/40‑th的cDNA和400nM正向和反向引物或QuantiTectPrimer Assay，与Quantitest SYBRGreen master混合物(Qiagen)一起进行PCR反应，一式两份。实时PCR可使用Rotor‑Gene Q(Qiagen)进行。针对标准曲线可进行相对定量，并且量化的值用由下述看家基因之一测定的输入信息标准化：CYCG、GUSB或TBP。在标准化之后，相对于在数据组中的第一样品绘制样品的图并且计算表达测定的标准偏差。引物序列报告在表2中。分离自冷藏的原代人肝细胞(Invitrogen)的RNA可用作HLC基因表达的比较。
表2



实施例5：流式细胞术
使用TrypLE(Invitrogen)解离细胞5分钟，接着制成小球并在具有3%FBS的PBS中再悬浮。用CXCR4‑PE (BD Biosciences)进行标记，10ul每1×106细胞在室温下30分钟。同种型对照是lgG2a，克隆G155‑178(BD Biosciences)。在缓冲液中洗涤细胞并且在1%低聚甲醛中重新悬浮。在Becton‑Dickinson FACS Calibur 4色流式细胞计数器上获得样品，并且使用Becton‑Dickinson CellQuest软件分析。数据使用前向对侧分散(forward vs.side scatter)门控数据以消除碎片和绘制所得柱状图以反映CXCR‑4对lgG2a同种型对照的平均荧光强度。
对于OCT4、AFP和AAT染色，将细胞在室温下固定在PBS中的1%PFA中1小时。可在室温下在可渗透化/洗涤缓冲液(R&D系统)中进行可渗透化作用30分钟。抗体在室温下温育30分钟。用抗‑a‑抗胰蛋白酶(Invitrogen)、抗‑α‑1‑甲胎蛋白(DakoCytomation)或抗‑Oct‑4488结合物(Millipore)进行标记。
实施例6：吲哚菁绿(ICG)的细胞摄取和释放
从循环中排泄各种化合物的至关重要的肝脏细胞功能包括肝细胞摄取、结合和随后释放化合物。吲哚菁绿(ICG)是非毒性有机阴离子，其被成熟的肝细胞专有排除并且临床上用于测试肝功能。ICG的摄取和释放可用于鉴定胚胎干细胞分化模型中的肝细胞，因此该测试用于分化培养物的有功能特征细胞。在添加培养基ICG之后，位于3D‑胞外基质中的大量细胞摄取该化合物并且染绿色；6小时后我们观察到分化细胞成功排除吸收的ICG并且丢失绿色。
ICG被肝细胞专一地消除，所以摄取和消除研究用作肝细胞成熟的标记物。DMEM中1mg/ml的ICG(Sigma)添加至细胞培养物(在稍后阶段分化)并且在37℃下温育30分钟。在洗涤之后，使用光显微术记录ICG的细胞摄取。细胞接着返回培养基并且温育6小时。在其添加至培养物之后6.5小时细胞内侧ICG是不可检测的。
实施例7：糖原的过碘酸‑希夫(PAS)染色
位于三维ECM中的分化细胞培养物在固定4%低聚甲醛(或卡诺依氏液)中并且根据制造商的说明使用商业PAS染色系统(Sigma)染色。在PAS染色之前用0.5%淀粉酶(Sigma)处理的细胞培养物用作对照。
实施例8：戊氧基9‑羟基异吩噻唑O‑脱烷基酶(PROD)试验
戊氧基9‑羟基异吩噻唑o‑脱烷基酶(PROD)试验是对细胞色素CYP2B活性的测量。位于三维ECM中分化细胞的培养物用最终浓度为1mM的苯巴比妥钠(Sigma)处理72小时。接着洗掉苯巴比妥，并且置换为含有浓度为10uM的CYP2B底物戊氧烷基9‑羟基异吩噻唑(Sigma)的培养基。20分钟之后，使用荧光显微镜分析活的细胞培养物(24)。
实施例9：细胞迁移试验
将细胞铺在分化设备的膜顶部或在用于产生分化设备的相同组织培养插入物的膜顶部(没有添加3D‑胞外基质)并且接着经历分化过程，如在“细胞培养”部分所述。在分化过程的0天、1天和2天收获细胞。在PBS中轻轻洗涤插入物，并且从插入物(膜顶部)中使用干棉签去除细胞，随后在PBS中洗涤两次。在3D‑胞外基质中或膜下侧(当没有3D‑胞外基质使用插入物的情况下)存在的细胞、迁移的细胞通过胶原酶/胰蛋白酶处理分离和解离，接着通过离心收集并且在血球计中计数。
实施例10：小鼠中的HLC植入
通过Explora Labs，San Diego CA按照制度和NIH指导进行动物研究。源自hpSC系phESC‑3的HLC分离自三维ECM，如本文所使用并且根据制造商的说明使用细胞示踪CFSE细胞增殖试剂盒(Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit)(Invitrogen)用羧基荧光素双醋酸盐、丁二酰亚胺酯(CFSE)染色。用HCM以1:1稀释(或没有细胞的稀释基质胶（matrigel）)的50μl基质胶的约2百万细胞注入4‑6周龄严重联合免疫缺陷(SCID)‑浅褐色(Bg)雌性小鼠(Charles River)的脾。标记的细胞注入实验小鼠(n=5)并且来自对照组的3个动物仅仅接收基质胶的注入。42天后小鼠被安乐死并且收获肝脏用于组织切片或灌注，以分离肝细胞。肝脏切片包埋在OCT化合物(组织‑TEK)和立即冷冻直到冷冻切片。未固定的组织切片进一步使用荧光显微镜分析CFSE‑阳性细胞的存在或固定在4%低聚甲醛中并且使用免疫组织化学分析人白蛋白表达，如在表1中提供(在免疫细胞化学中使用的抗体来源)。
为从移植的动物中收集得自hpSC的HLC，用克他命/甲苯噻嗪麻痹动物并且用24G导管(B Braun，Germany)插入门静脉。肝脏用补充有乙二醇四乙酸(EGTA)(Sigma)的Hanks平衡盐溶液(Sigma)灌注3‑4分钟，随后胶原酶IV溶液(Sigma)灌注5‑6分钟。灌注的肝脏进一步用针梳理开，再悬浮在补充有10%FBS(Hyclone)的Leibovitz(L‑15)培养基(Sigma)中并且过滤通过100μm细胞滤网(BD)。分离的肝细胞在冰冷的补充有10%FBS的L‑15培养基中洗涤2次并且通过流式细胞术分析。
尽管已经参考上面的实施例描述了本发明，但是应当理解本发明的精神和范围包括修饰和改变。因此，本发明仅仅由所附的权利要求书限制。