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1、(10)申请公布号 CN 102972211 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102972211 A *CN102972211A* (21)申请号 201210560884.7 (22)申请日 2012.12.21 A01G 1/04(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C05G 3/00(2006.01) (71)申请人 徐州工程学院 地址 221111 江苏省徐州市新城区富春路 1 号 (72)发明人 苗敬芝 董玉玮 陈尚龙 李勇 (74)专利代理机构 徐州市淮海专利事务所 32205 代理人 华德明 (54) 发明名称 一种提高灵芝菌丝生长速度和。
2、液体发酵生物 量的方法 (57) 摘要 一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物 量的方法， 属于微生物遗传育种方法。该方法包 括步骤 ：（1） 灵芝原生质体制备 ；（2） 亚硝酸诱变 灵芝原生质体、 原生质体再生 ；（3） 接种花生粕斜 面培养基培养， 该培养基由玉米、 花生粕、 KH2PO4、 MgSO47H2O、 VB2组成 ；（4） 接种花生粕液体发酵 培养基培养， 该培养基由玉米、 花生粕、 蛋白胨、 葡 萄糖、 酵母膏、 KH2PO4、 MgSO47H2O 组成 ；（5） 获得 生物量和多糖、 三萜类化合物等活性产物。优点 ： （1） 本发明首次经诱变获得了菌丝生长速度快、 生 物量。
3、高的灵芝菌株 ；（2） 采用的花生粕斜面培养 基较马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基更有利于灵芝 菌丝快速生长 ；（3） 采用的花生粕液体发酵培养 基更有利于获得较高的生物量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法， 其特征是 ： 采用灵芝为菌 种， 经马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化、 液体摇瓶培养后， 利用复合酶液水解灵芝菌丝体， 在 2832下振荡 1.54h， 制备原生质体， 采用亚硝酸作为诱变剂， 诱变灵芝原生质。
4、体， 选择生 长速度快、 菌丝雪白的再生菌落经花生粕斜面培养基、 花生粕液体发酵培养基培养， 获得生 物量和多糖、 三萜类化合物 ； 具体步骤如下 ： （1） 配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基 ： 按照 GB4789.152010 食品卫生微生物学检 验 霉菌和酵母计数 配制， 用于菌种的复苏及保存 ； （2） 菌种活化 ： 取灵芝 No. 5.786 菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化 12 次 ； （3） 取液体培养的菌丝， 过滤收集菌丝球， 用无菌水冲洗 23 次， 再用甘露醇冲洗 23 次， 转入巯基乙醇中， 恒温摇床振荡 3060min， 过滤收集菌丝球， 用甘露醇冲洗 23 。
5、次， 离心 分离取沉淀为菌丝体， 取菌丝体以 1:1020 的比例加入复合酶液， 恒温下振荡酶解 24h， 过 滤后滤液于 5001000r/min 离心 35min， 取上清液于 30004000 r/min， 离心 510 min， 沉 淀即为原生质体， 用甘露醇冲洗并用 0.9生理盐水把原生质体稀释 1015 倍 ； （4） 向原生质体稀释液中加入等量的 0.06mol/LNaNO2和 1mol/L 醋酸缓冲液， 27恒处 理 525min， 再加入两倍于醋酸缓冲液体积的 0.7mol/L pH 8.6 的 Na2HPO4溶液终止诱变 ； 将诱变后的原生质体分别涂在再生培养基上， 27培。
6、养 5 天 ； （5） 将生长速度快、 菌丝雪白的菌落接种在花生粕斜面培养基上， 该培养基组成为玉米 1030g/L， 花生粕 25g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， VB2 0.30.8g/L， 琼 脂 20g/L。 2.27培养 67 天得第一代诱变菌株， 将其接种新的花生粕斜面培养基上 ； 27培养 67 天得第二代诱变菌株， 按同样方法获得第三代 第九代菌株 ； （6） 接种第一、 三、 五、 七、 九代菌块于花生粕液体发酵培养基中， 该培养基组成为玉米 1030 g/L， 花生粕25 g/L， 蛋白胨13 g/L， 葡萄糖1030 g/。
7、L， 酵母膏13 g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， pH 6.5， 27摇床培养 57 天 ； （7） 分离生物量 ： 发酵液过滤收集菌丝， 60烘干至质量恒定并称质量 ； （8） 胞内粗多糖的提取 ： 取干菌丝体1g， 加入10倍体积蒸馏水， 90水浴23h， 4000 r/ min 离心 510min， 收集上清液， 沉淀再重复浸提 2 次， 合并 3 次的上清液， 8090 水浴浓 缩成原体积的 0.20.25 倍， 加入 45 倍体积 95% 乙醇， 4静置， 浓缩液离心， 用无水乙醇洗 涤沉淀两次， 烘干至恒重， 得胞内粗多糖 ； （。
8、9） 胞内三萜类化合物的提取 ： 取干菌丝体 1g 加 50 mL 甲醇静置过夜后过滤， 蒸干后 加 4 mL 95% 乙醇溶解 ； （10） 诱变菌株放置石蜡油或砂土管中， 4保存， 每一年传代一次。 权 利 要 求 书 CN 102972211 A 2 1/3 页 3 一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物遗传育种方法， 特别是一种提高灵芝菌丝生长速度和液体 发酵生物量的方法。 背景技术 0002 含有灵芝多糖、 三萜类、 灵芝多肽等十多种有效成分， 试验证明灵芝具有抗炎、 镇 痛、 镇静、 抗衰老、 抗肿瘤、 抗缺氧、 提高免疫力等作用。。
9、液体深层发酵技术是获得灵芝主要 药理活性物质的重要途径， 但是一方面灵芝菌丝生长速度较慢， 与灵芝菌种的大量需求不 相符， 另一方面发酵后产生的生物量较少， 影响菌丝体中的活性物质产量。 因此选育菌丝生 长速度快且生物量高的灵芝菌种是解决问题的关键。 原生质体诱变技术是一种行之有效的 微生物育种新方法。目前已有灵芝原生质体诱变育种相关报道， 但都已获得较高活性物质 产量为根本目的， 缺少选育菌丝生长速度快、 生物量高方面的研究。 发明内容 0003 本发明的目的是要提供一种提高灵芝菌丝生长速度和液体发酵生物量的方法， 解 决现有技术中选育菌丝生长速度慢、 生物量低的问题。 0004 本发明的目。
10、的是这样实现的 ： 该方法采用灵芝为菌种， 经马铃薯葡萄糖琼脂培养 基活化、 液体摇瓶培养后， 利用复合酶液水解灵芝菌丝体， 在 2832下振荡 1.54h， 制备 原生质体， 采用亚硝酸作为诱变剂， 诱变灵芝原生质体， 选择生长速度快、 菌丝雪白的再生 菌落经花生粕斜面培养基、 花生粕液体发酵培养基培养， 获得生物量、 多糖及三萜类化合 物 ； 具体步骤如下 ： （1） 配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基 ： 按照 GB4789.152010 食品卫生微生物学检 验 霉菌和酵母计数 配制， 用于菌种的复苏及保存 ； （2） 菌种活化 ： 取灵芝 No. 5.786 菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面。
11、培养基上活化 12 次 ； （3） 取液体培养的菌丝， 过滤收集菌丝球， 用无菌水冲洗 23 次， 再用甘露醇冲洗 23 次， 转入巯基乙醇中， 恒温摇床振荡 3060min， 过滤收集菌丝球， 用甘露醇冲洗 23 次， 离心 分离取沉淀为菌丝体， 取菌丝体以 1:1020 的比例加入复合酶液， 恒温下振荡酶解 24h， 过 滤后滤液于 5001000r/min 离心 35min， 取上清液于 30004000 r/min， 离心 510 min， 沉 淀即为原生质体， 用甘露醇冲洗并用 0.9生理盐水把原生质体稀释 10 倍 ； （4） 向原生质体稀释液中加入等量的 0.06mol/LNaN。
12、O2和 1mol/L 醋酸缓冲液， 27恒温 处理525min， 再加入两倍于醋酸缓冲液体积的0.7mol/L pH 8.6的Na2HPO4溶液终止诱变 ； 将诱变后的原生质体分别涂在再生培养基上， 27培养 5 天 ； （5） 将生长速度快、 菌丝雪白的菌落接种在花生粕斜面培养基上， 该培养基组成为玉米 1030g/L， 花生粕 25g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， VB2 0.30.8g/L， 琼 说 明 书 CN 102972211 A 3 2/3 页 4 脂 20g/L。27培养 67 天得第一代诱变菌株， 将其接种新的花生粕斜面培养基。
13、上， 27培 养 67 天得第二代诱变菌株， 按同样方法获得第三代 第九代菌株 ； （6） 接种第一、 三、 五、 七、 九代菌块于花生粕液体发酵培养基中， 该培养基组成为玉米 1030 g/L， 花生粕25 g/L， 蛋白胨13 g/L， 葡萄糖1030 g/L， 酵母膏13 g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， pH 6.5， 27摇床培养 57 天 ； （7） 分离生物量 ： 发酵液过滤收集菌丝， 60烘干至质量恒定并称质量 ； （8） 胞内粗多糖的提取 ： 取干菌丝体1g， 加入10倍体积蒸馏水， 90水浴23h， 4000 r/ min 。
14、离心 510min， 收集上清液， 沉淀再重复浸提 2 次， 合并 3 次的上清液， 8090 水浴浓 缩成原体积的 0.20.25 倍， 加入 45 倍体积 95% 乙醇， 4静置， 浓缩液离心， 用无水乙醇洗 涤沉淀两次， 烘干至恒重， 得胞内粗多糖 ； （9） 胞内三萜类化合物的提取 ： 取干菌丝体 1g 加 50 mL 甲醇静置过夜后过滤， 蒸干后 加 4 mL 95% 乙醇溶解 ； （10） 诱变菌株放置石蜡油或砂土管中， 4保存， 每一年传代一次。 0005 有益效果， 由于采用上述方案， 本发明采用的原生质体诱变技术是一种行之有效 的微生物育种新方法， 原生质体由于去除了细胞壁，。
15、 对诱变剂敏感性增强， 正突变率较高， 更容易获得具有优良性状的菌株， 灵芝原生质体经亚硝酸诱变后， 菌丝生长速度增快且发 酵后生物量增加。 与其它灵芝诱变菌株相比， 本发明诱变获得的灵芝菌株菌丝生长速度快， 经液体发酵后生物量高， 遗传性状稳定。 解决了现有技术中选育菌丝生长速度慢、 生物量低 的问题， 达到了本发明的目的。 0006 优点 ： （1） 本发明首次经诱变获得了菌丝生长速度快、 生物量高的灵芝菌株 ； （2） 采用的花生粕斜面培养基较马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基更有利于灵芝菌丝快速 生长 ； （3） 采用的花生粕液体发酵培养基更有利于获得较高的生物量。 具体实施方式 0007 下。
16、面结合实施例对本发明作进一步详细说明 ： 实施例 1 ： 1、 菌种 ： 灵芝 （Ganoderma lucidum） ： 购自中国普通微生物菌种保藏管理中心， 编号为 5.786。 0008 2、 培养基 ： 花生粕斜面培养基和花生粕液体发酵培养基所需粮食原料包括玉米、 花生粕， 购自超市， 玉米、 花生粕碎至颗粒大小为 100m。 0009 花生粕斜面培养基组成为玉米 1030g/L， 花生粕 25g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， VB2 0.30.8g/L， 琼脂 20g/L。 0010 花生粕液体发酵培养基组成为玉米 1030 g/L，。
17、 花生粕 25 g/L， 蛋白胨 13 g/L， 葡萄糖 1030 g/L， 酵母膏 13 g/L， KH2PO4 13 g/L， MgSO47H2O 0.51.5 g/L， pH 6.5。 0011 3、 亚硝酸诱变灵芝原生质体 灵芝菌株在 28下保温培养活化菌种 7 天， 取活化后的菌块接种于三角瓶的液体培养 基中， 28温度下在摇床上培养 5 天， 过滤收集菌丝体， 用甘露醇冲洗后， 转入 0.3% 巯基乙 说 明 书 CN 102972211 A 4 3/3 页 5 醇中， 振荡 40min， 过滤收集菌丝体， 用甘露醇冲洗过滤， 1200r/min 离心 8min。取 0.5g 菌 。
18、丝体以 1:15 的比例加入复合酶液， 28振荡酶解菌丝体 3h， 滤液 1000r/min 离心 3min， 2 次。上清液采用 3000 r/min 离心 10min 制得原生质体。向原生质体稀释液中加入 0.25mL 的 0.06mol/LNaNO2和 0.25mL 1mol/L 醋酸缓冲液， 27恒处理 20min， 再加入 1mL 0.7mol/ L pH 8.6的Na2HPO4溶液终止诱变。 将诱变后的原生质体分别涂在再生培养基上， 27培养 5 天 ； 将生长速度快、 菌丝雪白的菌落接在花生粕斜面培养基上， 27培养 67 天， 测定生长 速度， 取斜面菌块接种于花生粕液体发酵培。
19、养基中， 27摇床培养 57 天， 或 10L 发酵罐培 养 46 天， 发酵液过滤后， 菌丝烘干至恒重得生物量。 0012 结果表明， 灵芝诱变菌株经花生粕斜面培养基培养， 3.54.5 天可铺满试管斜面， 较采用相同培养基培养的原发菌株提前 12 天， 生长速度提高， 较采用马铃薯葡萄糖琼脂 培养基培养的原发菌株提前 1.52.5 天， 生长速度提高， 且菌丝雪白、 致密， 生长旺盛。灵 芝诱变菌株经花生粕液体发酵培养基培养， 获得生物量为 4.26.5（干 g/100mL） ， 较采用 相同培养基培养的原发菌株提高 8%21%， 较采用普通液体发酵培养基培养的原发菌株提高 14%32%。。
20、 0013 4、 活性产物检测 （1） 胞内多糖的提取 取干菌丝体 1g， 加入 10 倍体积蒸馏水， 90水浴 3h， 4000 r/min 离心 10min， 收集上清 液， 沉淀再重复浸提 2 次， 合并 3 次的上清液， 8090 水浴浓缩成原体积的 0.20.25 倍， 加入45倍体积95%乙醇， 4静置， 浓缩液离心， 用无水乙醇洗涤沉淀两次， 烘干至恒重， 得 胞内粗多糖 ； （2） 胞内三萜类化合物的提取 取干菌丝体 1g 加 50 mL 甲醇静置 12h 后过滤， 蒸干后加 4 mL 95% 乙醇溶解。 0014 5、 活性成分积累 （1） 胞内多糖的积累 胞内多糖 （mg/。
21、 干 g） ： 诱变菌株 ： 1215 ； 原发菌株 1015 ： （2） 三萜类化合物的积累 胞内三萜类化合物产量 （10-2 mg/g） ： 诱变菌株 ： 7278 ； 原发菌株 ： 6468。 0015 结果表明， 诱变菌株生物量较原发菌株增加的同时， 胞内多糖、 三萜类化合物产量 保持稳定或有一定的提高。 0016 6、 遗传性状稳定性检测 测定诱变菌株第三、 五、 七、 九代在花生粕斜面培养基上的生长速度、 生物量、 胞内多糖 和胞内三萜类化合物产量。 0017 结果表明， 与第一代相比， 诱变菌株第三、 五、 七、 九代菌丝生长速度、 生物量保持 稳定， 除第九代胞内多糖、 三萜类化合物产量降低 3%10% 外， 其余几代活性物质产量均保 持稳定。 说 明 书 CN 102972211 A 5 。