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一种枯草芽孢杆菌DJ6菌株及在葡萄病害防治上的用途.pdf

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文档编号：4860423

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1、(10)申请公布号 CN 102876605 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102876605 A *CN102876605A* (21)申请号 201210354630.X (22)申请日 2012.09.23 CGMCC No. 6314 2012.07.02 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (71)申请人江苏丘陵地区镇江农业科学研究所地址 212400 江苏省镇江市句容市宁杭路 112 号 (72)发明人杨敬辉吉沐祥姚克兵庄义庆 (。

2、54) 发明名称一种枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株及在葡萄病害防治上的用途 (57) 摘要本发明为一种枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株（其在 CGMCC 的保藏编号为 CGMCC No.6314）及发酵液制备成悬浮剂的方法。该制剂能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 6 页 1/2 页 2 1. 一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） DJ-。

3、6 菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为： CGMCC No. 6314。 2. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株，其特征在于该菌株的 16S rRNA 基因序列为： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTT。

4、ACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGTGC。

5、CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTA。

6、AACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA。

7、ACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTC。

8、ACACCACGAGAGTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。 3. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株，其特征在于该菌株的 gyrB 基因序列为： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGT。

9、GCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACG ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGG。

10、GCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 4. 权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、。

11、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病方面的应用。 5. 一种用权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株发酵液制备而成的悬浮剂。 6. 一种制备权利要求 4 所述的悬浮剂的方法，其特征在于包括以下步骤：权利要求书 CN 102876605 A 2 2/2 页 3 （A）菌液的获得用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培养液的容积为 1000。

12、 mL 的三角瓶中， 200 rpm、 30条件下振荡培养 16 h ；把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培养液的容积为 30L 的发酵罐（镇江东方 GUS-30）， 20L 发酵培养液中固容物含量为：豆粕 100 g、马铃薯淀粉 200 g、蔗糖 25 g、酵母粉 25 g、碳酸钙 20 g、 MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧 100%，搅拌速度为 350 rpm，发酵温度 30 ，发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2 ；（B）菌剂加工工艺将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：（1）将发酵液离心（8000 r。

13、pm）后用 20% 丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用 20% 丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为 100 亿活芽孢 /mL。 7. 根据权利要求 5 所述的制备悬浮剂的方法，其特征在于步骤（B）中所述的悬浮剂中的添加剂为：丙三醇和和黄原胶。权利要求书 CN 102876605 A 3 1。

14、/6 页 4 一种枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株及在葡萄病害防治上的用途发明领域 0001 本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） DJ-6 菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领域。背景技术 0002 由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌（Physalospora baccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternaria viticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡。

15、萄白腐病、单轴霉属（Plasmopara viticola）侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinae ampelina) 侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。 0003 葡萄病害当前主要通过化学防治来防控，常用以下化学药剂防治：甲基硫菌灵 (thiophanate-methyl)、波尔多液（bordeaux mixture）、五氯酚钠（sodium pentachlorophenol）、乙酸铜（cupric acetate）、嘧菌酯（azoxys。

16、trobin）、醚菌酯 (kresoxim-methyl)、嘧霉胺 (pyrimethanil)、苯醚甲环唑 (difenoconazole)、烯肟菌酯 (enestroburin)、氟吗啉（flumorph）、啶酰菌胺（boscalid）、甲霜灵（metalaxyl）、霜霉威（propamocarb）、多菌灵 (carbendazim)、咪鲜胺（prochloraz）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰吗啉（dimethomorph）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造。

17、成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。 0004 目前成功用于防治葡萄病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制葡萄病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆。

18、菌 (Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；（3）单格孢菌( Ulocladium atrum) ；（4）链霉菌属细菌（Streptomycesspp.）中的灰绿链霉菌( Streptomyces griseovirides)、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、金色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes）和链霉菌（Str。

19、eptomyces kitasazwaensis）；（5）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的洋葱假单胞菌( Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；（6）酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）等。 0005 本发明提供的可同时兼治葡萄多种病害的颉颃细菌枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株，在现有技术中没有提及和公开。说明书。

20、CN 102876605 A 4 2/6 页 5 发明内容 0006 本发明解决现有技术存在的不足，提供一株分离自黄杜鹃花的内生芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） DJ-6 菌株，该菌株可用于防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。同时本发明还提供用该枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株加工成悬浮剂的制备方法。 0007 本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为 Bacillus subtilis） DJ-6 菌株，已于 2012 年 7 月 2 日在中国微生物菌种保藏管理委员会。

21、普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所，保藏号为： CGMCC No. 6314。本发明的菌种具有如下特征：（1） DJ-6 菌株的细胞形态及生理生化特征（见表 1）表 1、 DJ-6 菌株细胞形态及理化特征实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性碳水化合物产酸细胞形状杆状葡萄糖+ 细胞直径 1um-木糖+ 形成芽孢+L- 阿拉伯糖+ 芽孢膨大-甘露醇+ 芽孢圆形-乳糖- 伴孢晶体-发酵葡萄糖产气- 接触酶+利用柠檬酸盐+ 氧化酶+50生长+ 厌氧生长-pH5.7 生长+ VP 试验+7%NaCl 生长+ V。

22、PpH7-分解酪素+ 硝酸盐还原+水解明胶+ （2）本发明的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 16S rRNA 基因序列为： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGC。

23、AACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAA。

24、AGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGC。

25、ATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGT。

26、GACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG 说明书 CN 102876605 A 5 3/6 页 6 TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT AACACC。

27、CGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA ；（3）本发明的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 gyrB 基因序列为： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACG 。

28、ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGG。

29、CTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 0008 用本发明的防治葡萄病害的菌株 DJ-6 制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：（A）菌液的获得用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑。

30、，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培养液的容积为 1000 mL 的三角瓶中， 200 rpm、 30条件下振荡培养 16 h ；把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培养液的容积为 30L 的发酵罐（镇江东方 GUS-30）， 20L 发酵培养液中固容物含量为：豆粕 100 g、马铃薯淀粉 200 g、蔗糖 25 g、酵母粉 25 g、 CaCO3 20 g、 MnSO4 1.0 g，设置发酵条。

31、件为：溶氧 100%，搅拌速度为 350 rpm，发酵温度 30 ，发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2 ；（B）菌剂加工工艺将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用 20% 丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用 20% 丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬。

32、浮剂的浓度为 100 亿活芽孢 /mL。 0009 本发明的有益效果是：（1）本发明提供一株新的生防芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株，由该菌株发酵而制得的悬浮剂，能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病；（2）菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。具体实施方式说明书 CN 102876605 A 6 4/6 页 7 实施例 0010 本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis） DJ-6 菌株，已于 2012 年 7 月 2 日在中国微生物菌。

33、种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为： CGMCC No. 6314。本发明的菌株的细胞形态及生理生化特征见表 1。 0011 本实施例的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 16S rRNA 基因序列为： TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACC。

34、CGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCA CCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAG CCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCG。

35、GTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGG CTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTG AGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGG CGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGATGAGTG。

36、CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCT GGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCA GAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCT TGATC。

37、TTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACG TCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAG GTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGA。

38、GTTTGT AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。 0012 本实施例的枯草芽孢杆菌 DJ-6 菌株的 gyrB 基因序列为： GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGA CCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAA CAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGG。

39、CGTAAACATCACG ATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTA TTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAG TGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGT ACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACG。

40、CCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGA AAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGC AGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCG ATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。 0013 用本发明的防治葡萄病害的 DJ-6 菌株制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：（A）菌液的获得说明书 CN 102876605 A 。

41、7 5/6 页 8 用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ-6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 、 200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液 5 mL 全部接种于装有 400 mL PDA 培养液的容积为 1000 mL 的三角瓶中， 200 rpm、 30条件下振荡培养 16 h ；把所得的 400mL 培养液接种于装有 20 L 培养液的容积为 30L 的发酵罐（镇江东方 GUS-30）， 20L 发酵培养液中固容物含量为：豆粕 100 g、马铃薯淀粉 200 g、蔗糖 2。

42、5 g、酵母粉 25 g、 CaCO3 20 g、 MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧 100%，搅拌速度为 350 rpm，发酵温度 30 ，发酵时间 36 h， pH 7.0-7.2。 0014 （B）菌剂加工工艺将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用 20% 丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用 20% 丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为 1.01010 cfu/mL（即每毫升含 100 亿个活芽孢）；（。

43、2）在上述调节好的悬浮液中按 5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为 100 亿活芽孢 /mL。 0015 实施效果 DJ-6 悬浮剂对葡萄病害的田间防治试验试验处理方法：在江苏省万山红遍农业科技示范园（江苏省句容市后白镇） , 葡萄品种为巨峰 , 试验园面积约 8.6 亩。采用水平棚架式栽植 , 树龄 6 年生。试验时间 2011 年 6 9 月。药剂处理为枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂（100 亿活芽孢 /mL） 1000 倍液，对照药剂 50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液，空白对照为不防治, 每小区6棵树，喷雾用水量为3 kg。

44、/ 棵，实验 4 重复，小区随机区组排列。试验于 2011 年 6 月 15 日第 1 次喷药 , 每隔 10 天（遇到下雨天时调整喷药日期）共防治 5 次，最后 1 次防治日期为 8 月 8 日。于最后 1 次施药后 14 天 ( 8 月 22 日 ) 调查防效。调查时在每个小区中间随机选 4 株葡萄，在上、中、下、左、右 5 个方位分别取 1 个果穗，共 20 个果穗 , 记载每个果穗轴、果粒和果柄中各种病害的发病率 , 计算出病指和防治效果。 0016 结果与分析：第5次喷药后14天, 枯草芽孢杆菌DJ-6悬浮剂（100亿活芽孢/mL） 1000 倍液对。

45、葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为 89.40%、 91.19%、 90.51%、 94.16%、 84.99% 和 94.63% （表 2），而对照药剂 50% 多菌灵可湿性粉剂 1000 倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为 76.93%、 73.37%、 77.30%、 82.13%、 63.28% 和 64.43%（表 2）。 0017 以上结果表明，枯草芽孢杆菌 DJ-6 悬浮剂的田间防治效果显著高于对照药剂，且兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明制剂对施用作物安全。 0018 表 2 NF0919 菌株发酵液的提取物对葡萄病害的田间防治试验结果说明书 CN 102876605 A 8 6/6 页 9 注：不同大写字母表示 P 0.01。说明书 CN 102876605 A 9 。

摘要
申请专利号：	CN201210354630.X	申请日：	2012.09.23
公开号：	CN102876605A	公开日：	2013.01.16
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20120923授权公告日:20140219终止日期:20140923\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 1/20申请日:20120923\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N1/20; A01N63/00; A01P3/00; C12R1/125(2006.01)N	主分类号：	C12N1/20
申请人：	江苏丘陵地区镇江农业科学研究所
发明人：	杨敬辉; 吉沐祥; 姚克兵; 庄义庆
地址：	212400 江苏省镇江市句容市宁杭路112号
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内容摘要

本发明为一种枯草芽孢杆菌DJ-6菌株（其在CGMCC的保藏编号为CGMCC？No.6314）及发酵液制备成悬浮剂的方法。该制剂能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。

权利要求书

权利要求书一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DJ‑6菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No. 6314。
根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株，其特征在于该菌株的16S rRNA基因序列为：
TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。
根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株，其特征在于该菌株的gyrB基因序列为：
GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。
权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株在防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病方面的应用。
一种用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株发酵液制备而成的悬浮剂。
一种制备权利要求4所述的悬浮剂的方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）菌液的获得
用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ‑6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐（镇江东方GUS‑30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、碳酸钙20 g、MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0‑7.2；
（B）菌剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：
（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×1010 cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
根据权利要求5所述的制备悬浮剂的方法，其特征在于步骤（B）中所述的悬浮剂中的添加剂为：丙三醇和和黄原胶。

说明书

说明书一种枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株及在葡萄病害防治上的用途
发明领域
本发明涉及一种微生物及用途，更具体地说涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DJ‑6菌株、用途及其制剂的制备方法，属于生物农药技术领域。
背景技术
由植物病原真菌围小丛壳菌（Glomerella cingulata）侵染引发的葡萄炭疽病、囊孢壳菌（Physalospora baccae）侵染引发的葡萄房枯病、链格孢菌（Alternaria viticola）引发的葡萄穗轴褐腐（枯）病、Coniothyrium dlodiella侵染引发的葡萄白腐病、单轴霉属（Plasmopara viticola）侵染引发的葡萄霜霉病、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引发的葡萄灰霉病和痂囊腔菌（Elsinae ampelina) 侵染引发的葡萄黑痘病是我国葡萄上发生的主要病害。
葡萄病害当前主要通过化学防治来防控，常用以下化学药剂防治：甲基硫菌灵(thiophanate‑methyl)、波尔多液（bordeaux mixture）、五氯酚钠（sodium pentachlorophenol）、乙酸铜（cupric acetate）、嘧菌酯（azoxystrobin）、醚菌酯(kresoxim‑methyl)、嘧霉胺(pyrimethanil)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯肟菌酯(enestroburin)、氟吗啉（flumorph）、啶酰菌胺（boscalid）、甲霜灵（metalaxyl）、霜霉威（propamocarb）、多菌灵(carbendazim)、咪鲜胺（prochloraz）、吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）和烯酰吗啉（dimethomorph）等。长期以来，由于多频次、多剂量施用化学药剂，造成葡萄病原菌对常用化学药剂都产生了不同程度的抗（耐）药性，生产上屡屡出现防治失败的事例。
目前成功用于防治葡萄病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制葡萄病害的生防菌属（种）主要有（1）木霉菌属真菌（Trichoderma spp.）中的绿色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（Trichoderma harzianum）和长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）；（2）芽孢杆菌属细菌（Bacillus spp.）中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)、多粘芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）；（3）单格孢菌( Ulocladium atrum)；（4）链霉菌属细菌（Streptomycesspp.）中的灰绿链霉菌( Streptomyces griseovirides)、吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）、金色链霉菌（Streptomyces aureochromogenes）和链霉菌（Streptomyces kitasazwaensis）；（5）假单胞菌属细菌（Pseudomonas spp.）中的洋葱假单胞菌( Pseudomonas cepacia)、荧光假单胞细菌（Pseudomonas fluorescens）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）；（6）酵母菌中的季也蒙毕赤氏酵母（Pichia guilliermondii）和罗伦隐球酵母（Cryptococcus laurentii）等。
本发明提供的可同时兼治葡萄多种病害的颉颃细菌枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株，在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
本发明解决现有技术存在的不足，提供一株分离自黄杜鹃花的内生芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DJ‑6菌株，该菌株可用于防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病。同时本发明还提供用该枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株加工成悬浮剂的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis）DJ‑6菌株，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为：CGMCC No. 6314。本发明的菌种具有如下特征：
（1）DJ‑6菌株的细胞形态及生理生化特征（见表1）
表1、DJ‑6菌株细胞形态及理化特征实验项目结果实验项目结果革兰氏染色阳性碳水化合物产酸细胞形状杆状葡萄糖+细胞直径>1um‑木糖+形成芽孢+L‑阿拉伯糖+芽孢膨大‑甘露醇+芽孢圆形‑乳糖‑伴孢晶体‑发酵葡萄糖产气‑接触酶+利用柠檬酸盐+氧化酶+50℃生长+厌氧生长‑pH5.7生长+VP试验+7%NaCl生长+VP<pH6+淀粉水解+VP>pH7‑分解酪素+硝酸盐还原+水解明胶+
（2）本发明的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株的16S rRNA基因序列为：
TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA；
（3）本发明的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株的gyrB基因序列为：
GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。
用本发明的防治葡萄病害的菌株DJ‑6制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：
（A）菌液的获得
用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ‑6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐（镇江东方GUS‑30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO3 20 g、MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0‑7.2；
（B）菌剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：
（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×1010 cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
本发明的有益效果是：
（1）本发明提供一株新的生防芽孢杆菌——枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株，由该菌株发酵而制得的悬浮剂，能有效防治葡萄炭疽病、葡萄房枯病、葡萄穗轴褐腐病、葡萄灰霉病、葡萄黑痘病和葡萄白腐病；
（2）菌剂贮藏性质稳定，防治效果好，大规模生产的发酵工艺简单、生产成本低廉。
具体实施方式
实施例
本发明的枯草芽孢杆菌（拉丁文学名为Bacillus subtilis）DJ‑6菌株，已于2012年7月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No. 6314。本发明的菌株的细胞形态及生理生化特征见表1。
本实施例的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株的16S rRNA基因序列为：
TATCATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCYYGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCA。
本实施例的枯草芽孢杆菌DJ‑6菌株的gyrB基因序列为：
GCTTGATGTGACGGTTCACCGTGACGGTAAAATTCACCGCCAAACCTATAAACGCGGAGTTCCGGTTACAGACCTTGAAATCATTGGCGAAACGGATCATACAGGAACGACGACACATTTTGTCCCGGACCCTGAAATTTTCTCAGAAACAACCGAGTATGATTACGATCTGCTTGCCAACCGCGTGCGTGAATTAGCCTTTTTAACAAAGGGCGTAAACATCACGATTGAAGATAAACGTGAAGGACAAGAGCGCAAAAATGAATACCATTACGAAGGCGGAATTAAAAGTTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCTAAAGAGGTTGTCCATGAAGAGCCGATTTACATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTGGCTTTGCAATACAATGACAGCTACACAAGCAACATTTACTCGTTTACAAACAACATTAACACGTACGAAGGCGGTACCCATGAAGCTGGCTTCAAAACGGGCCTGACTCGTGTTATCAACGATTACGCCAGAAAAAAAGGGCTTATTAAAGAAAATGATCCAAACCTAAGCGGAGATGACGTAAGGGAAGGGCTGACAGCGATTATTTCAATCAAACACCCTGATCCGCAGTTTGAGGGCCAAACGAAAACAAAGCTGGGCAACTCAGAAGCACGGACGATCACCGATACGTTATTTTCTACGGCGATGGAAACATTTATGCTGGAAAATCCAGATGCAGCC。
用本发明的防治葡萄病害的DJ‑6菌株制备的生防菌剂，其制备方法包括以下步骤：
（A）菌液的获得
用无菌芽签挑取事先在PDA固体培养基上划线培养好的DJ‑6菌株单菌落斑，接种于装有5 mL PDA液体培养液的容积为20 mL的三角瓶中，于30 ℃、200 rpm条件下振荡培养16 h，过夜，将上步所得培养液5 mL全部接种于装有400 mL PDA培养液的容积为1000 mL的三角瓶中，200 rpm、30℃条件下振荡培养16 h；把所得的400mL培养液接种于装有20 L培养液的容积为30L的发酵罐（镇江东方GUS‑30），20L发酵培养液中固容物含量为：豆粕100 g、马铃薯淀粉200 g、蔗糖25 g、酵母粉25 g、CaCO3 20 g、MnSO4 1.0 g，设置发酵条件为：溶氧100%，搅拌速度为350 rpm，发酵温度30 ℃，发酵时间36 h，pH 7.0‑7.2。
（B）菌剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成悬浮剂：
（1）将发酵液离心（8000 rpm）后用20%丙三醇溶液（V/V）（溶液用无菌水配制）重新悬浮，测定悬浮液的活芽孢含量，根据测定结果用20%丙三醇溶液（V/V）调节悬浮液的活芽孢数，终含量调节成芽孢含量为1.0×1010 cfu/mL（即每毫升含100亿个活芽孢）；（2）在上述调节好的悬浮液中按5 g/L（W/V）的用量加入黄原胶，并搅拌均匀，得成品悬浮剂的浓度为100亿活芽孢/mL。
实施效果
DJ‑6悬浮剂对葡萄病害的田间防治试验
试验处理方法：在江苏省万山红遍农业科技示范园（江苏省句容市后白镇）, 葡萄品种为巨峰, 试验园面积约8.6亩。采用水平棚架式栽植, 树龄6年生。试验时间2011年6～9月。药剂处理为枯草芽孢杆菌DJ‑6悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液，对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液，空白对照为不防治, 每小区6棵树，喷雾用水量为3 kg/棵，实验4重复，小区随机区组排列。试验于2011年6月15日第1次喷药, 每隔10天（遇到下雨天时调整喷药日期）共防治5次，最后1次防治日期为8月8日。于最后1次施药后14天( 8月22日) 调查防效。调查时在每个小区中间随机选4株葡萄，在上、中、下、左、右5个方位分别取1个果穗，共20个果穗, 记载每个果穗轴、果粒和果柄中各种病害的发病率, 计算出病指和防治效果。
结果与分析：第5次喷药后14天, 枯草芽孢杆菌DJ‑6悬浮剂（100亿活芽孢/mL）1000倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为89.40%、91.19%、90.51%、94.16%、84.99%和94.63%（表2），而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液对葡萄炭疽病，葡萄房枯病，葡萄穗轴褐腐，葡萄灰霉病，葡萄黑痘病和白腐病的防治效果分别为76.93%、73.37%、77.30%、82.13%、63.28%和64.43%（表2）。
以上结果表明，枯草芽孢杆菌DJ‑6悬浮剂的田间防治效果显著高于对照药剂，且兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明制剂对施用作物安全。
表2 NF0919菌株发酵液的提取物对葡萄病害的田间防治试验结果

注：不同大写字母表示 P < 0.01。