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1、(10)申请公布号 CN 102870954 A (43)申请公布日 2013.01.16 CN 102870954 A *CN102870954A* (21)申请号 201210414641.2 (22)申请日 2012.10.25 A23J 3/34(2006.01) A23J 3/04(2006.01) A23J 1/04(2006.01) (71)申请人 浙江万里学院 地址 315100 浙江省宁波市鄞州区钱湖南路 8 号浙江万里学院 (72)发明人 张慧恩 杨华 王彩霞 (74)专利代理机构 宁波诚源专利事务所有限公 司 33102 代理人 胡志萍 (54) 发明名称 一种抗氧化肽的。
2、制备方法 (57) 摘要 本发明涉及到一种抗氧化肽的制备方法， 其 特征在于包括下述步骤 ： 将花蛤肉在真空烘干后 过 50-100 目筛， 得到的初级花蛤肉粉末放入石油 醚中脱脂， 去除石油醚， 得到的中级花蛤肉粉末与 蒸馏水混合， 配制悬浮液， 加入蛋白酶酶解， 将得 到的酶解液在离心后的上清液超滤除去大分子， 透过液浓缩后加入葡萄糖反应， 得到的反应产物 纯化后即为抗氧化肽。 与现有技术相比， 本发明所 提供的抗氧化肽的制备方法酶解条件简单可控， 反应条件温和， 且避免了酸水解对产品的污染， 酶 解产物的种类和含量更加稳定， 抗氧化肽得率高， 功能性强， 易于工业化生产， 为花蛤的深加工。
3、利用 开辟了新途径。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 1/1 页 2 1. 一种抗氧化肽的制备方法， 其特征在于包括下述步骤 ： 将新鲜花蛤煮至壳开， 去壳， 将花蛤肉在 35-50真空烘干 ； 将烘干的花蛤肉粉碎， 过 50-100 目筛， 得到初级花蛤肉粉末 ； 将所述的花蛤肉粉末按照 1g 粉末， 10-20mL 石油醚的比例放入， 振荡， 常温静置 1 小 时， 过滤， 将滤渣重复上述操作 2-3 次进行脱脂 ； 将上述脱脂后的花蛤肉粉末置于 50-70真空干燥箱。
4、中， 去除石油醚， 得到中级花蛤 肉粉末 ； 用蒸馏水与中级花蛤肉粉末混合， 配制成质量浓度为 5-30% 的悬浮液 ； 调节悬浮液 的 pH 值为 4.5-9.0， 加入中级花蛤肉粉末质量 0.1-5.0% 的 Alcalase 蛋白酶， 于 45-75下 酶解 1-3 小时， 然后再于 95-100下灭酶 5-10min ； 将得到的酶解液在 3000-12000rpm 离 心， 得到的上清液即为花蛤蛋白水解液 ； 对上述花蛤蛋白水解液进行超滤除去大分子， 过分子量 10-50KDa 的超滤膜， 收集透 过液 ； 将上述透过液真空浓缩至固形物含量为 15-50%， 加入葡萄糖， 葡萄糖在浓。
5、缩后的透 过液中的浓度为 1.0-10%， 在 110-120下反应 30-90min， 得到反应产物 ； 将上述反应产物用Sephadex G-25凝胶层析， 以纯水为洗脱剂， 洗脱液在420nm下检 测， 收集洗脱液组分 ； 将上述洗脱液组分真空冷冻干燥至水分含量在 1-5%， 即得到黄色粉末状抗氧化肽。 权 利 要 求 书 CN 102870954 A 2 1/3 页 3 一种抗氧化肽的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及到食品加工领域， 具体指一种抗氧化肽的制备方法。 背景技术 0002 花蛤， 学名菲律宾蛤仔 (Ruditapes philippinarum)， 是帘蛤科双壳贝类。
6、， 其肉质 细嫩， 滋味鲜美， 营养丰富， 是我国传统的养殖贝类。但是， 随着花蛤养殖产业的快速发展， 产量迅速增加， 已出现供过于求的趋势。因此， 如何充分高效地利用花蛤资源， 开发花蛤加 工利用的新途径具有重大意义。花蛤蛋白质含量高， 游离氨基酸种类丰富， 是优质的蛋白 源。 0003 CN1768765A 公开了一种利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解牡蛎蛋白获得抗氧化 肽的方法。以上公开的这些方法都是通过酶解天然蛋白质， 得到抗氧化多肽。但是， 蛋白质 在酶解过程中， 受到许多因素的影响， 酶解工艺条件严格， 酶解反应进程难以控制， 酶解产 物种类及活性成分含量不稳定， 难以规模化生产。 发。
7、明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种反应进程易于控制 且产物活性好的抗氧化肽的制备方法。 0005 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为 ： 该抗氧化肽的制备方法， 其特征 在于包括下述步骤 ： 0006 将新鲜花蛤煮至壳开， 去壳， 将花蛤肉在 35-50真空烘干 ； 0007 将烘干的花蛤肉粉碎， 过 50-100 目筛， 得到初级花蛤肉粉末 ； 0008 将所述的花蛤肉粉末按照 1g 粉末， 10-20mL 石油醚的比例放入， 振荡， 常温静置 1 小时， 过滤， 将滤渣重复上述操作 2-3 次进行脱脂 ； 0009 将上述脱脂后的花蛤肉粉末置于 5。
8、0-70真空干燥箱中， 去除石油醚， 得到中级 花蛤肉粉末 ； 0010 用蒸馏水与中级花蛤肉粉末混合， 配制成质量浓度为 5-30% 的悬浮液 ； 调节悬 浮液的 pH 为 4.5-9.0， 加入中级花蛤肉粉末质量 0.5-5.0% 的 Alcalase 蛋白酶， 于 45-75 下酶解1-3小时， 然后再在95-100下灭酶5-10min ； 将得到的酶解液在3000-12000rpm下 离心， 得到的上清液即为花蛤蛋白水解液 ； 0011 对上述花蛤蛋白水解液进行超滤除去大分子， 过分子量 10-50KDa 的超滤膜， 收 集透过液 ； 0012 将上述透过液真空浓缩至固形物含量为 15。
9、-50%， 加入葡萄糖， 葡萄糖在浓缩后 的透过液中的浓度为 1.0-10%， 在 110-120下反应 30-90min， 得到反应产物 ； 0013 将上述反应产物用 Sephadex G-25 凝胶层析， 以纯水为洗脱剂， 洗脱液在 420nm 下检测， 收集洗脱液组分 ； 0014 将上述洗脱液组分真空冷冻干燥至水分含量为 1-5%， 即得到黄色粉末状的抗氧 说 明 书 CN 102870954 A 3 2/3 页 4 化肽。 0015 与现有技术相比， 本发明所提供的抗氧化肽的制备方法使用生物酶制剂对花蛤蛋 白进行水解， 酶解条件相比控制水解更加简单可控， 反应条件温和， 且避免了酸。
10、水解对产品 的污染， 酶解产物的种类和含量更加稳定， 抗氧化肽得率高， 且利用真空干燥技术， 在干燥 过程中最大限度的保证了抗氧化肽的活性， 使其抗氧化功能大大增加， 制成的花蛤抗氧化 肽粉， 功能性强， 易保存 ； 且生产工艺简单、 易于工业化生产， 也为花蛤的深加工利用开辟了 新途径。 具体实施方式 0016 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0017 本实施例中抗氧化肽的制备方法包括下述步骤 ： 0018 将新鲜花蛤煮至壳开， 去壳， 将花蛤肉在 50下真空烘干 ； 0019 将烘干的花蛤肉粉碎， 过 80 目筛， 得到初级花蛤肉粉末 ； 0020 将所述的花蛤肉粉末按照1g粉末。
11、， 10mL石油醚的比例加入， 振荡， 常温静置1小 时， 过滤， 将滤渣重复上述操作 3 次进行脱脂 ； 0021 将上述脱脂后的花蛤肉粉末置于 50真空干燥箱中， 去除石油醚， 得到中级花 蛤肉粉末 ； 0022 用蒸馏水与中级花蛤肉粉末混合， 配制成质量浓度为 10% 的悬浮液 ； 调节悬浮 液的 pH 为 8.0， 加入中级花蛤肉粉末质量 1% 的 Alcalase 蛋白酶， 65下酶解 3 小时， 然后 再 95下灭酶 10min ； 将得到的酶解液在 3000rpm 离心， 得到的上清液即为花蛤蛋白水解 液 ； 0023 对上述花蛤蛋白水解液进行超滤除去大分子， 过分子量 10-5。
12、0KDa 的超滤膜， 收 集透过液 ； 0024 将上述透过液真空浓缩至固形物含量为 15%， 加入葡萄糖， 葡萄糖在浓缩后的透 过液中的浓度为 6.0%， 在 120下反应 60min， 得到反应产物 ； 0025 将上述反应产物用 Sephadex G-25 凝胶层析， 以纯水为洗脱剂， 洗脱液在 420nm 下检测， 收集洗脱液组分。采用葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 层析， 主要作用是除去杂质， 收 集抗氧化组分。 0026 将上述洗脱液组分真空冷冻干燥至水分含量在 3%， 即得到黄色粉末状抗氧化 肽。 0027 将得到的抗氧化肽配制成 5mg/mL 的溶液， 取 1mL。加入。
13、 1mL 磷酸缓冲液 (0.2mol/ L， pH6.6)及1mL质量浓度为1%的铁氰化钾溶液， 混匀， 50下水浴反应20min后在2min内 冷却至室温， 然后加入 1mL 质量浓度为 10% 的三氯乙酸终止反应， 混匀后在 3000rpm 下离心 10min ； 取 1mL 上清液， 依次加入 3mL 蒸馏水及 0.2mL 质量浓度为 0.1% 的三氯化铁， 混合均 匀， 于 700nm 处测定吸光度。以水代替质量浓度为 5mg/mL 抗氧化肽溶液， 重复上述实验作 为空白对照， 吸光值越大， 表示还原力越强。本实施例抗氧化肽的还原力如表 1 所示。 0028 将得到的抗氧化肽配制成 5。
14、mg/mL 的溶液， 取 0.1mL 试样溶液， 加 0.2mmol/L DPPH甲醇溶液 3.9mL， 室温下避光反应 30min。以甲醇做参比， 517nm 波长下测其吸光值。 0029 用下式计算清除率 ： 说 明 书 CN 102870954 A 4 3/3 页 5 0030 0031 式中 ： 0032 A1为加试样反应 30min 后 DPPH溶液的吸光度 ； 0033 A2为试样溶液的吸光度 ； 0034 A0为未加试样时 DPPH溶液吸光度。 0035 本实施例抗氧化肽的 DPPH自由基清除率为 78.6%。 0036 将得到的抗氧化肽配制成 5mg/mL 的溶液， 取 0.1。
15、mL， 加入 2.8mL， Tris-HCl 缓冲液 （50mmol/L， pH2.8） ， 于25保温10min， 然后加入0.1mL 60mmol/L邻苯三酚 （空白加入等量 10mmol/L 的 HCl） ， 总体积 3.0mL， 迅速摇匀， 在 420nm 处， 每个半分钟测定一次吸光度。 0037 对 O2-的清除率的计算方法如下 ： 0038 0039 邻苯三酚自氧化速率 ； 0040 A420/T（V） ： 添加 MRPs 试样的氧化速率。 0041 本实施例抗氧化肽的超氧阴离子清除率为 68.6%。 0042 将本实施例中的抗氧化肽与现有技术中的丁基羟基茴香醚、 2,6- 二叔丁基对甲苯 酚和 Vc 进行比较， 比较结果如表 1 所示。 0043 表 1 0044 0045 由表 1 可以看出， 本实施例中所制备的 5mg/mL 抗氧化肽的抗氧化能力相当于 0.2mg/ml 的 BHA、 0.2mg/ml 的 BHT 和 0.5mg/ml 的 Vc。 说 明 书 CN 102870954 A 5 。