RHOA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102743764 A (43)申请公布日 2012.10.24 CN 102743764 A *CN102743764A* (21)申请号 201210106296.6 (22)申请日 2012.04.11 A61K 48/00(2006.01) A61P 27/06(2006.01) (71)申请人 中山大学中山眼科中心 地址 510060 广东省广州市越秀区先烈南路 54 号 (72)发明人 余敏斌 刘茜 吴开力 (74)专利代理机构 广州科粤专利商标代理有限 公司 44001 代理人 刘明星 (54) 发明名称 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列在制备治疗青光。

2、眼 药物中的应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 RhoA 的 RNA 干 扰 靶 点 序 列 在 制 备 治 疗 青 光 眼 药 物 中 的 应 用。根据本发明的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 制备的 RhoA siRNA 能有效的降低 RhoA mRNA 的表达水平， 高效下调 前房组织中 RhoA 基因的表达量， 影响应力纤维的 形成， 进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构 和分布的改变， 从而引起小梁细胞通道构型的变 化， 改变房水排出阻力， 进而影响眼压， 从而达到 治疗青光眼的目的。 (51)Int.Cl. 权。

3、利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 4 页 1/1 页 2 1.RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用， 所述的RhoA的RNA干扰 靶点序列的核苷酸序列为 ： 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 根据所述的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列设 计的RNA干扰序列RhoA siRNA， 其正义链为5GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3， 反义链为。

4、 3dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5， 所述的治疗青光眼的药物是通过以下方法制备的 ： 用 PBS 将 RhoA siRNA 稀释成 2g/l， 再按体积比 3.5 1.5 与转染试剂 LipofectamineTM RNAiMAX 混合反应得到治疗青光眼的药物。 权 利 要 求 书 CN 102743764 A 2 1/5 页 3 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用 技术领域 ： 0001 本发明属于生物化学与分子生物学领域， 具体涉及RhoA的RNA干扰靶点序列在制 备治疗青光眼药物中的应用。 背景技术 ： 0002 青光眼是目前全球第二位不。

5、可逆性致盲性眼病， 它是一组以眼压升高或其他多种 因素引起视神经损害， 表现为视野损害、 视盘凹陷扩大、 视网膜神经纤维层萎缩的眼病。青 光眼发生和发展的主要危险因素是高眼压的存在。 0003 青光眼的发病机制尚未完全阐明， 小梁网部位房水外流阻力增大造成的病理性眼 压升高是引起原发性开角型青光眼的主要原因。 小梁网细胞的生物学功能和构型依赖于肌 动蛋白纤维及其结合蛋白组成的细胞骨架。Rho GTP 酶是细胞骨架肌动蛋白微丝组建的重 要调控因子， 在肌动蛋白细胞骨架的调节中起核心作用。在哺乳动物中 Rho 亚家族按照其 序列同源性分为 6 大类， 其中以 RhoA 研究的最早也最为广泛。 00。

6、04 目前， 抗青光眼的治疗包括使用房水形成抑制剂或增强巩膜葡萄膜流出的药物降 低眼压， 及改善滤过目的的手术治疗。而药物抗青光眼的方法已经显示出多种全身的和局 部的毒副作用。目前， 降低眼压的药物治疗主要有缩瞳药， 肾上腺能受体激动剂， - 阻断 剂， 碳酸酐酶抑制剂， 前列腺素衍生物等。例如， 缩瞳药毛果芸香碱可以起视力模糊和其他 不利的视觉副作用 ； 碳酸酐酶抑制剂可引起恶心， 消化不良， 疲劳和代谢性酸中毒等全身毒 副作用 ； - 阻断剂对心脏兴奋和对支气管、 骨骼肌血管的具有抑制作用。此类副作用可以 导致患者适从性降低或终止治疗。鉴于青光眼的重要性及目前传统药物治疗的不当， 针对 青。

7、光眼发展基础性原因的基因靶向治疗越来越受到重视 ； 然而， 作为基因靶向性治疗手段 之一的基因转染， 其载体病毒载体的安全性及伦理性成为限制其临床应用的主要原因。例 如， 现在广泛使用的高效转染载体慢病毒载体， 是人类免疫缺陷病毒 -1(HIV-1) 来源的一 种病毒载体。由于 HIV 复杂的生物学特性， 其安全性尚未得到很好的解决。 0005 RNA 干扰是指生物中双链 RNA 诱导产生的一种特异的基因沉默现象。近几年来 RNAi 的研究取得了很大进展， 使得这一技术迅速应用到多个研究领域， 加速了对基因功能、 遗传规律、 信号转到机理的研究， 并已将这一技术应用于癌症和病毒性疾病的基因治疗。

8、中， 在眼科的应用研究也日益深入。Tolentino 采用激光击破 Brch 膜建立脉络膜新生血管 (choroidal neovascularization， CNV) 动物模型， 采用玻璃体腔注射 VEGF-siRNA 后， 观察 血管生成情况及新生血管的渗漏， 结果发现 VEGF-siRNA 能显著抑制 CNV 的生成， 明显减少 CNV 的渗漏， 且未观察到出血、 炎症、 毒性反应 ； Nakamra 等采用结膜下注射磷酸盐缓冲盐 水制作的眼内炎症和纤维化的大鼠模型中， 发现大鼠模型中 TGF-siRNA 明显减少炎症反应 和基质沉着。然而 RNA 干扰在眼部直接降低眼压治疗青光眼的应。

9、用及 siRNA 前房注射后的 分布情况却罕有研究。 发明内容 ： 说 明 书 CN 102743764 A 3 2/5 页 4 0006 本发明的目的是提供RhoA的RNA干扰靶点序列在制备治疗青光眼药物中的应用， 所述的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列的核苷酸序列为 ： 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 。 0007 本发明提出的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 -RhoA siRNA 选择有效靶序列的依据 ： 1、 用 RNA structre 软件预测 RhoA mRNA 的二级结构， 选择其中不形成发夹的片段， 或者 保证有十几个剪辑不形成发夹。2、 片段 1。

10、9 个碱基， 有两个 dT 悬垂， 同时 GC 含量在 30 55， 尽量避免 GGG 或 CCC。3、 检查序列的保守性， 选择保守性高的。 0008 本发明的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列， 其核苷酸序列如下 ： 0009 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 。 0010 根据 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列设计的 RNA 干扰序列 RhoA siRNA， 其正义链为 5 GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3， 反义链为 3 dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5 。 0011 本发明以上述 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 5 -G。

11、AAGTCAAGCATTTCTGTC-3获得的 RhoA siRNA， 将该 RhoA siRNA 转染人小梁网细胞 (Human trabeclar meshwork) 和小鼠 成纤维细胞 NIH/3T3 并检测其干扰效率， 结果发现， 如图 1 所示， RhoA siRNA 能降低体外人 小梁网细胞 (Human trabeclar meshwork) 和小鼠成纤维细胞 NIH/3T3 中 RhoA 基因的 mRNA 的表达， 干扰效率可高达 80左右。将非特异性 cy3labeled siRNA 与转染试剂混合 再注入前房， 妥布霉素眼膏涂眼， 用免疫荧光观察 cy3labeled si。

12、RNA 在前房组织中分布情 况， 结果发现， 如图 2 和图 3A 所示， 绝大部分 cy3labeled siRNA( 图 2 中红色标记 ) 存在于 前房角的小梁组织中， 而角膜内皮和虹膜组织中却未发现 cy3labeled siRNA 的分布， 为进 一步特异性基因治疗提供了实验基础。前房注射 RhoA siRNA 后 1d、 7d 眼前节照相系统记 录眼部角膜混浊， 虹膜充血等情况， 晶体透明度等情况， 对于组织学观察， 用石蜡切片 HE 染 色观察角膜内皮形态， 结果发现， 如图 3 所示， RhoA siRNA 在眼部未见明显的毒性反应， 手 术临床观察未见角膜浑浊， 水肿， 未见。

13、晶状体混浊。 HE染色角膜内皮亦未见异常。 在慢性高 眼压小鼠动物模型的前房注射RhoA siRNA， 检测术眼眼压变化情况和RhoA mRNA的水平， 结 果如图 4 和 5 所示， 地塞米松局部点眼后， 眼压逐渐升高， 至第 28 天眼压升高约 7mmHg， 在 RhoA siRNA 注射后第 5 天， 眼压降至正常基线水平。地塞米松引起的慢性高眼压小鼠动物 模型的前房组织中的 RhoAmRNA 升高， 在注射 RhoA siRNA 后， RhoAmRNA 水平下降了约 50， 在体内具有良好的转染效率。由此可见， 体内注射特异性片段 RhoA siRNA 能高效下调前房 组织中 RhoA。

14、 基因和基因的表达量， 影响应力纤维的形成， 进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞 骨架结构和分布的改变， 从而引起小梁细胞通道构型的变化， 改变房水排出阻力， 进而影响 眼压， 从而达到治疗青光眼的目的。 0012 因此， 本发明的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 可应用于 制备治疗青光眼药物中。 0013 优选， 根据所述的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列设计的 RNA 干扰序列 RhoA siRNA， 其 正义链为 5 GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3， 反义链为 3 dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 。

15、5， 所述的治疗青光眼的药物是通过以下方法制备的 ： 用 PBS 将 RhoA siRNA 稀释成 2g/ l， 再按体积比 3.5 1.5 与转染试剂 LipofectamineTM RNAiMAX 混合反应得到治疗青光 眼的药物。 0014 根据本发明的 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3制备的 RhoA siRNA 能有效的降低 RhoA mRNA 的表达水平， 高效下调前房组织中 RhoA 蛋白的表达 说 明 书 CN 102743764 A 4 3/5 页 5 量， 影响应力纤维的形成， 进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的改。

16、变， 从而引 起小梁细胞通道构型的变化， 改变房水排出阻力， 进而影响眼压， 从而达到治疗青光眼的目 的。 附图说明 ： 0015 图 1 是 siRhoA 的瞬时转染对人小梁网细胞和小鼠 3T3 细胞 RhoA 表达的影响， 其中图 1A 表示对 RhoA 基因表达影响， 图 1B 表示对 RhoA 蛋白表达影响， 其中图 1B 中上 两幅图表示对人小梁网细胞的 RhoA 蛋白表达的影响， 而图 1B 中下两幅图表示对小鼠 3T3 细胞的 RhoA 蛋白表达的影响， 对照表示的是 PBS 组， 转染试剂表示的是单纯用转染试剂 组， 阴性对照表示的是阴性对照 siRNA 组， siRhoA 表。

17、示 RhoA siRNA(siRhoA) 和转染试剂 LipofectamineTM RNAiMAX 的混合液 ( 以下同 ) ； 0016 图 2 是 cy3labeled siRNA 在前房的高密度分布及其在眼前段其他组织的分布情 况。图 2A 和 2B 表示的是前房注射 7g cy3labeled siRNA 后 24 小时 siRNA 眼前段的分 布情况。其中红色代表的是 cy3labeled siRNA， 蓝色代表的是细胞核染色。 0017 图 3 是 siRhoA 体内转染后第一天和第七天眼前段照相 ( 图 3B) 和组织学 HE 染色 情况 ( 图 3C)。图 3A(a)， (b。

18、) 分别表示前房注射 7g cy3labeled siRNA 在角膜内皮和虹 膜的分布情况。红色表示的是 cy3labeled siRNA， 蓝色代表细胞核染色。图 3B(a， b， c) 分 别代表注射 PBS， 阴性对照 siRNA， siRhoA 后 24 小时眼前段照相 ； 图 3B(d， e， f) 分别代表 注射 PBS， 阴性对照 siRNA， siRhoA 7 天后眼前段照相。图 3C(a， b， c) 分别代表注射 PBS， 阴性对照 siRNA， siRhoA 后 24HE 染色 ； 图 3C(d， e， f) 分别代表注射 PBS， 阴性对照 siRNA， siRhoA 。

19、7 天后 HE 染色。 0018 图 4 是 siRhoA 小鼠前房注射前后眼压变化的情况。 0019 图 5 是 siRhoA 小鼠体内转染效率检测。 具体实施方式 ： 0020 以下是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。 0021 实施例 1 ： 0022 1、 RhoA siRNA 设计 ： 根据已有文献报道及实验经验， 利用生物软件， 依照 GenBank 发表的 RhoA 基因序列， 设计并选择了软件评分最高的序列。最后采用 NCBI GenBank ( 美 国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写 ) 提供的 BLAST 软件， 对选择的靶序列进行 同源分析， 排除 si。

20、RNA 非特异性地抑制小鼠和人的其他基因片段的可能。被委托设计序列 和合成序列的公司为广州锐博生物有限公司。 0023 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 ： 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 0024 由 此 根 据 RhoA 的 RNA 干 扰 靶 点 序 列 ： 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3设 计 的 RhoAsiRNA( 双链 ) 的核苷酸序列为 ： 0025 正义链 ： 5 GAAGUCAAGCAUUUCUGUC dTdT 3 0026 反义链 ： 3 dTdT CUUCAGUUCGUAAAGACAG 5， 命名为 siRhoA。 0027 2、 。

21、RhoA siRNA(siRhoA) 转染人小梁网细胞 (Human trabecular meshwork) 和小 鼠成纤维细胞 NIH/3T3 并检测其干扰效率。 说 明 书 CN 102743764 A 5 4/5 页 6 0028 转染前一天， 将长势良好的人小梁网细胞 (Human trabecular meshwork) 和小鼠 成纤维细胞NIH/3T3用胰酶消化， 以每孔1105个细胞接种到12孔板中Human trabecular meshwork 细胞的培养液为 15胎牛血清的 DMEM/F12 培养基， NIH/3T3 的细胞培养液为 10胎牛血清的 DMEM 培养基 )，。

22、 待细胞长至融合度为 60 80左右时即可用作转染。 用不含胎牛血清的 DMEM 培养基稀释 RhoA siRNA(siRhoA) 至 2.8g， 再将 5l 转染试 剂 LipofectamineTM RNA iMAX(Invitrogen) 加至 2ml 上述稀释的含 RhoA siRNA(siRhoA) 的不含胎牛血清的 DMEM 培养基中。将稀释后的 RhoA siRNA(siRhoA) 和转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX(Invitrogen)轻轻混匀， 室温反应30min。 将培养板中的培养液 吸出， 用无血清的 DMEM 洗涤 2 次并吸干。再将上述制备。

23、的 RhoA siRNA(siRhoA) 和转染试 剂 LipofectamineTM RNA iMAX 的混合液加入到培养板中， 每孔 1ml。置于 37， 5 CO2培 养箱中培养 4h 后吸弃培养液， 用 PBS 轻轻洗两遍， 加入含有胎牛血清的 DMEM 培养液继续培 养， 24h后用Real Time PCR检测细胞的RhoA基因表达变化， 48h后检测细胞的RhoA蛋白表 达变化。以 PBS 空白对照、 转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX 和 Negative control(NC) 分别作为对照组， 转染试剂组和阴性对照组。 0029 结果如图 1 所示，。

24、 从图 1(A， B) 可以看出， RhoA siRNA 能降低体外人小梁网细胞 (Humantrabeclar meshwork) 和小鼠成纤维细胞 NIH/3T3 中的 RhoA mRNA 的表达和 RhoA 蛋白的表达量， 干扰效率为 80左右， 并且其干扰效率在小鼠成纤维细胞 NIH/3T3 中最高。 0030 3、 非特异性 cy3labeled siRNA 在前房组织中分布情况的观察。 0031 用 PBS 稀释非特异性 cy3labeled siRNA( 产品名称为 ： Cy3-NControl_05815(2-OMe)， 货物编号为 ： siB10112100751， 生产商 。

25、： 广州锐博生物科技 有限公司)至2g/l， 取3.5l cy3labeled siRNA与1.5l转染试剂LipofectamineTM RNA iMAX(Invitrogen) 混合， 室温反应 30min 备用。取成年小鼠准确称重， 随机分组， 用 4.3水合氯醛按 0.20-0.33ml/kg 标准进行腹腔麻醉。常规消毒后， 开睑， 滴丁卡因滴眼液 2次角膜表面麻醉。 在手术显微镜下用33G微量注射器抽取事先准备的cy3 labeled siRNA 与转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX 的混合物由角巩膜缘前约 0.3mm 处进入前房， 小心 不要伤及晶体， 并缓。

26、缓将混合物注入前房， 注射后 5 秒钟再缓缓将注射针头抽出， 每个前房 5l 体积的混合物。妥布霉素眼膏涂眼。用免疫荧光观察 cy3 labeled siRNA 在前房组织 中分布情况。 0032 结果如图 2 和图 3A 所示， 由图 2 可以看出， 绝大部分 cy3 labeled siRNA( 图 2 中的红色荧光 ) 存在于前房角的小梁组织中， 而角膜内皮和虹膜组织中却未发现大量 cy3 labeledsiRNA 的分布 ( 图 3A)， 为进一步特异性基因治疗提供了实验基础。 0033 4、 RhoA siRNA 眼内毒性的研究 0034 用 PBS 稀释 RhoA siRNA 至 。

27、2g/l， 取 3.5l 再与转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX(Invitrogen)1.5l 混合， 室温反应 30min 备用。在手术显微镜下用 33G 微量注 射器抽取事先准备的 RhoA siRNA 与转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX 的混合物由成年 小鼠的角巩膜缘前约 0.3mm 处进入前房， 小心不要伤及晶体， 并缓缓将混合物注入前房， 注 射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出， 每个前房5l体积的混合物， 1d， 7d后眼前节照相系统 记录眼部角膜混浊， 虹膜充血等情况， 晶体透明度等情况。对于组织学观察， 用石蜡切片 HE 染色观察。

28、角膜内皮形态。其结果如图 3(B， C) 所示， 从图 3 可以看出， RhoA siRNA(siRhoA) 说 明 书 CN 102743764 A 6 5/5 页 7 在眼部未见明显的毒性反应， 手术临床观察未见角膜浑浊， 水肿， 未见晶状体混浊。HE 染色 角膜内皮亦未见异常。 0035 5、 制备慢性高眼压小鼠动物模型及检测前房注射 RhoA siRNA(siRhoA) 前后眼压 变化曲线。 0036 取 6 周成年小鼠准确称重， 随机分为 5 组。其中一组用 PBS 眼水点左眼， 另外其 他四组用 1地塞米松眼水点眼， 每日四次， 共 28 天。期间用 TONO-PEN AVIA 压。

29、平眼压计 每 7 天检测一次眼压， 并记录及描绘眼压曲线图。用 PBS 稀释 RhoA siRNA 至 2g/l， 取 3.5l 再与转染试剂 LipofectamineTM RNA iMAX(Invitrogen)1.5l 混合， 室温反应 30min 备用。在手术显微镜下用 33G 微量注射器抽取事先准备的 RhoA siRNA 与转染试剂 LipofectamineTM RNAiMAX 的混合物由角巩膜缘前约 0.3mm 处进入前房， 小心不要伤及晶 体， 并缓缓将混合物注入前房， 注射后5秒钟再缓缓将注射针头抽出， 每个前房5l体积的 混合物， 于术后1d， 2d， 3d， 4d， 5。

30、d， 6d， 7d， 14d， 21d检测术眼眼压变化情况。 结果如图4所示， 从图 4 中可以看出， 地塞米松局部点眼后， 眼压逐渐升高， 至第 28 天眼压升高约 7mmHg。在 RhoA siRNA注射后第5天， 眼压降至正常基线水平。 用转染试剂LipofectamineTM RNAiMAX、 地塞米松和 PBS 做相同处理， 阴性对照为 Negative control siRNA。 0037 6、 RhoA siRNA(siRhoA) 体内转染并检测其干扰效率 0038 取 6 周成年小鼠准确称重， 用 1地塞米松眼水点眼， 每日四次， 共 28 天， 由此得 到慢性高眼压小鼠动物。

31、模型。用 PBS 稀释 RhoA siRNA 至 2g/l， 取 3.5l 再与转染试 剂 LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)1.5l 混合， 室温反应 30min 备用。注射 RhoA siRNA 的时间为地塞米松点眼 28 天后， 第 29 天开始进行试验。取慢性高眼压小鼠动物模 型， 随机分组， 用 4.3水合氯醛按 0.20-0.33ml/kg 标准进行腹腔麻醉。常规消毒后， 开 睑， 滴丁卡因滴眼液 2 次角膜表面麻醉。在手术显微镜下用 33G 微量注射器抽取事先准备 的RhoAsiRNA与转染试剂LipofectamineTM RNA iMAX的。

32、混合物由角巩膜缘前约0.3mm处进 入前房， 小心不要伤及晶体， 并缓缓将混合物注入前房， 注射后 5 秒钟再缓缓将注射针头抽 出， 每个前房 5l 体积的混合物。用 RT-PCR 检测体内的 RhoA 基因的转染效率。用转染试 剂LipofectamineTM RNA iMAX和地塞米松做相同处理， 以PBS和Negative control分别作 为空白对照和阴性对照。 0039 结果如图5所示， 由图5可以看出， 地塞米松引起的慢性高眼压小鼠动物模型的前 房组织中的 RhoAmRNA 升高， 在注射 RhoA siRNA(siRhoA) 后， RhoAmRNA 水平下降了约 50， 在体。

33、内具有良好的转染效率。 由此可见， 体内注射RhoA siRNA能高效下调前房组织中RhoA 基因的表达量， 影响应力纤维的形成， 进而影响小梁细胞肌动蛋白细胞骨架结构和分布的 改变， 从而引起小梁细胞通道构型的变化， 改变房水排出阻力， 进而影响眼压， 从而达到治 疗青光眼的目的。 0040 综上所述， 本发明根据 RhoA 的 RNA 干扰靶点序列 5 -GAAGTCAAGCATTTCTGTC-3 制 备的 RhoA siRNA 可以用于制备治疗青光眼药物。 说 明 书 CN 102743764 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102743764 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 102743764 A 9 1/4 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102743764 A 10 2/4 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102743764 A 11 3/4 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102743764 A 12 4/4 页 13 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102743764 A 13 。