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1、(10)申请公布号 CN 102743338 A (43)申请公布日 2012.10.24 CN 102743338 A *CN102743338A* (21)申请号 201210141102.6 (22)申请日 2012.05.09 A61K 9/14(2006.01) A61K 47/42(2006.01) (71)申请人 中国药科大学 地址 211198 江苏省南京市江宁区龙眠大道 639 号 (72)发明人 周建平 吕慧侠 张银龙 张振海 姜天玥 孙博 (54) 发明名称 基于穿膜肽的口服复合纳米载体及其制备方 法和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种脂质穿膜肽和固体脂质纳 米粒构建。
2、的新型口服复合纳米载体及其制备方法 和用途。通过薄膜分散 - 超声法制备载药的固体 脂质纳米粒， 然后采用穿膜肽和载药固体脂质纳 米粒共孵育的方法， 构建的新型口服复合纳米载 体。所述的复合纳米载体利用固体脂质纳米粒的 在胃肠道内特殊的吸收途径和穿膜肽的促吸收作 用， 有效解决口服难吸收药物的吸收问题， 提高药 物的口服生物利用度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种新型的口服复合纳米载体， 其特征在于 ： 它含有难吸收。
3、药物、 固体脂质材料、 稳 定剂和脂质穿膜肽。 2.根据权利要求1所述的复合纳米载体， 其特征在于 ： 按质量比 ： 它含有0.130的 难吸收药物， 10 98的固体脂质材料， 0.1 60的稳定剂， 0.01 25的脂质穿膜肽， 0 20抗氧化剂， 0 95冻干支撑剂， 0 95的水。 3. 根据权利要求 1 和权利要求 2 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的难吸收药物 包括下列的一种或多种 ： 紫杉醇、 多烯紫杉醇、 多柔比星、 表柔比星、 长春新碱、 9- 羟基喜树 碱、 藤黄酸。 4. 根据权利要求 1 和权利要求 2 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的固体脂质材 料选自各种。
4、长链脂肪酸以及脂肪酸的甘油酯的一种或多种。 5. 根据权利要求 1 和权利要求 2 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的稳定剂是磷 脂和 ( 或 ) 表面活性剂， 磷脂选自天然磷脂、 半合成磷脂和全合成磷脂的一种或多种， 表明 活性剂选自泊洛沙姆 188 和吐温 80 的一种或两种。 6. 根据权利要求 1 和权利要求 2 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的脂质穿膜肽 为精氨酸 (Arginine， R) 的直链聚合物 Rn(n 5 16)， 它们的 N 端被脂肪酸修饰， 脂肪酸 优选碳链为 8 20 碳原子的， 更优选的硬脂酸 (StearicAcid， SA)。 7. 根据权利要求 。
5、1 和权利要求 2 所述的复合纳米载体， 其特征在于可以制备难吸收药 物的口服药物制剂。 权 利 要 求 书 CN 102743338 A 2 1/5 页 3 基于穿膜肽的口服复合纳米载体及其制备方法和用途 技术领域 ： 0001 本发明属于医药技术领域， 具体的说是利用穿膜肽和固体脂质纳米粒构建一种新 型口服复合纳米载体。 此复合纳米载体的特征在于利用固体脂质纳米粒在胃肠道内特殊的 吸收途径和穿膜肽的促吸收作用， 有效解决口服难吸收药物的吸收问题， 提高药物的口服 生物利用度。 背景技术 ： 0002 穿膜肽 (cell-permeable peptides， CPPs) 是一类具有较强细胞。
6、膜穿透能力的多 肽， 它们具有高效穿过细胞膜而不损伤细胞膜结构和功能的特点。多数研究证明穿膜肽在 常规的用量范围内基本没有毒性。 穿膜肽可以促进多肽、 蛋白质等难吸收药物在鼻腔粘膜、 肠道粘膜、 肺部给药、 皮肤给药的吸收， 从而使很多药物和治疗方法重获新生。 有研究证明， 采用长链脂肪酸对水溶性穿膜肽进行修饰， 可以增加穿膜肽的两亲性， 从而使其更容易插 入到磷脂双分子层中。此外， 修饰后的穿膜肽细胞摄取能力会明显增强。 0003 固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles， SLN)系指以生物相容的高熔点脂 质为骨架材料制成的纳米球。 SLN作为药物传递系统载体， 。
7、与常见的药物载体相比具有生物 相容性好、 可生物降解、 载药能力强、 物理化学存储稳定、 对靶器官有特异趋向性、 成本低和 利于大规模生产等优点， 是一种具有发展前景的新型给药系统。 0004 研究表明， 固体脂质纳米粒作为口服药用载体， 可以在一定程度上改善难吸收药 物的口服吸收， 但其主要经 Peyer 结上的 M 细胞或胞饮作用转运， 吸收较为有限。常见的吸 收促进剂连续使用会给粘膜造成直接损伤， 使其临床使用时受到了限制。因此急需开发一 种既能有效的促进纳米粒的口服吸收， 又对胃肠道粘膜及其人体的生理功能造成最小伤害 的口服纳米粒载体。 发明内容 ： 0005 本发明目的旨在提供一种脂。
8、质穿膜肽修饰固体脂质纳米粒的新型口服复合纳米 载体及其制备方法和用途。 0006 所述的复合纳米载体， 其特征在于 ： 它含有难吸收药物、 固体脂质材料、 稳定剂和 脂质穿膜肽。 0007 所述的复合纳米载体， 其特征在于 ： 按质量比 ： 它含有 0.1 30的难吸收药物， 10 98的固体脂质材料， 0.1 60的稳定剂， 0.01 25的脂质穿膜肽， 0 20抗 氧化剂， 0 95冻干支撑剂， 0 95的水。 0008 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的难吸收药物包括下列的一种或多种 ： 紫 杉醇、 多烯紫杉醇、 多柔比星、 表柔比星、 长春新碱、 9- 羟基喜树碱、 藤黄酸。 00。
9、09 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的固体脂质材料选自各种长链脂肪酸以及 脂肪酸的甘油酯的一种或多种。 0010 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的稳定剂是磷脂和(或)表面活性剂， 磷脂 说 明 书 CN 102743338 A 3 2/5 页 4 选自天然磷脂、 半合成磷脂和全合成磷脂的一种或多种， 表明活性剂选自泊洛沙姆 188 和 吐温 80 的一种或两种。 0011 所述的复合纳米载体， 其特征在于所述的脂质穿膜肽为精氨酸 (Arginine， R) 的 直链聚合物 Rn(n 5 16)， 它们的 N 端被脂肪酸修饰， 脂肪酸优选碳链为 8 20 碳原子 的， 更优选的硬脂酸。
10、 (Stearic Acid， SA)。 0012 所述的复合纳米载体， 其特征在于可以制备难吸收药物的口服药物制剂。 0013 有益成果 ： 当制备的复合纳米载体口服后， 首先带正电荷的纳米粒可以吸附带带 负电的胃肠道表面， 增加纳米粒的局部浓度， 其次脂质穿膜肽可以抑制 P- 糖蛋白的外排作 用， 从而促进纳米粒口服吸收， 提高药物口服生物利用度。 附图说明 ： 0014 图 1 为市售制剂 (Taxol) 大鼠口服给药后的血药浓度 - 时间曲线 (n 6)。 0015 图 2 为紫杉醇固体脂质纳米粒 (PTX-SLN) 大鼠口服给药后的血药浓度 - 时间曲线 (n 6)。 0016 图 。
11、3 为 SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒 (SA-R8-PTX-SLN) 大鼠口服给药后的血 药浓度 - 时间曲线 (n 6)。 0017 以下通过非限定性实施例进一步详细说明本发明， 本发明的保护范围， 不局限于 此。 具体实施方式 ： 0018 下列实施例中 R 为精氨酸， SA 为硬脂酸 0019 实施例 1 ： 穿膜肽修饰 9- 羟基喜树碱固体脂质纳米粒 0020 (1) 穿膜肽的合成 0021 采用固相合成法合成 SA-R9， 具体过程如下 ： 0022 在 50ml 侧面带支管、 支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入 1g Rinkamide-MBHA 树脂 (0.74mmol.g-。
12、1)， 加 20mL DMF 溶胀 10min， 抽滤去掉溶剂。然后加入 20mL 20哌 啶 /DMF 溶液， 搅拌 30min， 抽滤。用 DMF 洗涤树脂 6 次， 抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 1.44g(2.22mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf 为 2， 2， 4， 6， 7- 五甲基二氢苯并呋喃 -5- 磺酰 基 )、 0.46g(2.22mmol) 二环己基碳二亚胺和 0.30g(2.22mmol)HOBt(1- 羟基苯并三唑 ) 和 20mlDMF， 室温搅拌进行缩合反应。反应 2h 后取少量树脂进行茚三酮显色反应， 结果表明 缩合反应已完全。抽滤， 用 DM。
13、F 洗涤树脂 6 次， 抽滤去掉溶剂。C 端的 ( 保护的 ) 氨基酸 己联接于树脂上。后面接着联接有 C 端起的第二个至最后一个 ( 保护的 ) 氨基酸， 重复上 面操作， 即从用 20哌啶 /DMF 溶液脱保护开始， 到茚三酮显色试验后用 DMF 洗涤止。如果 茚三酮显色试验表明缩合未完全， 则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的 - 氨基都 用 Fmoc 保护， 氨基酸依次为 ： Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，。
14、Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH。最后树脂用甲醇洗第三次， 真空干燥。 0023 将上述已接肽的树脂加入到 50ml 圆底烧瓶中， 加入 15mL 试剂 K(TFA/ 苯甲硫醚 / EDT/ 苯酚 / 水 87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v)， 室温下搅拌 3h。过滤， 收集滤液。用三氟 说 明 书 CN 102743338 A 4 3/5 页 5 乙酸洗三次树脂。合并滤液， 将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸， 加入体积为 8-10 倍的乙 醚沉淀多肽， 放入冰箱过夜。离心， 除去乙醚， 真空干燥， 得到 SA。
15、-RRRRRRRRR 粗肽。 0024 将 100mg 上述的 SA-RRRRRRRRR 粗肽溶于 2ml 纯水中， 用制备用反相 HPLC 纯化， 收 集保留主峰， 收集液经旋蒸浓缩， 然后冷冻干燥得 SA-RRRRRRRRR 纯肽。质谱分析表明， 其分 子量为 1699， 与理论值相符。最终得 N 端被硬脂酸修饰的 RRRRRRRRR(SA-R9)。 0025 (2) 固体脂质纳米粒制备 0026 精密称取 15mg 9- 羟基喜树碱、 200mg 山嵛酸甘油酯、 100mg 卵磷脂置于 500mL 茄 型瓶， 加入一定量氯仿振摇溶解， 真空旋蒸除去氯仿形成含药薄膜， 抽真空过夜除去痕量有。
16、 机溶剂 ； 称取50mg泊洛沙姆188至10mL蒸馏水中形成水相 ； 将水相加入到茄型瓶中水化成 均匀乳浊液， 探头超声， 得到9-羟基喜树碱固体脂质纳米粒粗品， 离心(2000rpm， 10min)除 去少量金属屑， 过 0.8m 滤膜三次， 整粒， 得 9- 羟基喜树碱固体脂质纳米粒分散液。 0027 精确移取 5mL 9- 羟基喜树碱固体脂质纳米粒分散液， 加入 7.5mg SA-R9， 磁力搅 拌过夜 (4， 12h)， 得到脂质穿膜肽 SA-R9和 9- 羟基喜树碱固体脂质纳米粒的复合纳米载 体。 该复合纳米载体的平均粒径为168.3nm， 多分散系数PDI为0.174， zeta。
17、电位为21.5mV， 9-羟基喜树碱的包封率为93.74。 以5蔗糖为冻干保护剂， 将上述复合纳米载体制备成 冻干粉保存， 使用时用蒸馏水复溶使用。 0028 实施例 2 ： 穿膜肽修饰紫杉醇固体脂质纳米粒 0029 (1) 穿膜肽的合成 0030 采用固相合成法合成 SA-R8， 具体过程如下 ： 0031 在 50ml 侧面带支管、 支管带有砂板滤芯的圆底烧瓶内加入 1g Rinkamide-MBHA 树脂 (0.74mmol.g-1)， 加 20mL DMF 溶胀 10min， 抽滤去掉溶剂。然后加入 20mL 20哌 啶 /DMF 溶液， 搅拌 30min， 抽滤。用 DMF 洗涤树脂。
18、 6 次， 抽滤去掉溶剂。向反应瓶中加入 1.44g(2.22mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH(Pbf 为 2， 2， 4， 6， 7- 五甲基二氢苯并呋喃 -5- 磺酰 基 )、 0.46g(2.22mmol) 二环己基碳二亚胺和 0.30g(2.22mmol)HOBt(1- 羟基苯并三唑 ) 和 20mlDMF， 室温搅拌进行缩合反应。反应 2h 后取少量树脂进行茚三酮显色反应， 结果表明 缩合反应已完全。抽滤， 用 DMF 洗涤树脂 6 次， 抽滤去掉溶剂。C 端的 ( 保护的 ) 氨基酸 己联接于树脂上。后面接着联接有 C 端起的第二个至最后一个 ( 保护的 ) 氨基酸， 重。
19、复上 面操作， 即从用 20哌啶 /DMF 溶液脱保护开始， 到茚三酮显色试验后用 DMF 洗涤止。如果 茚三酮显色试验表明缩合未完全， 则可延长缩合时间直至完全。所有氨基酸的 - 氨基都 用 Fmoc 保护， 氨基酸依次为 ： Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH， Fmoc-Arg(Pbf)-OH。最后树脂用甲醇洗第三次， 真空干燥。 0032 将上述已接肽的树脂加入到 50ml 圆底烧。
20、瓶中， 加入 15mL 试剂 K(TFA/ 苯甲硫醚 / EDT/ 苯酚 / 水 87.5/5.5/2.5/2.5/2.5(v/v)， 室温下搅拌 3h。过滤， 收集滤液。用三氟 乙酸洗三次树脂。合并滤液， 将滤液旋蒸除去大部分的三氟乙酸， 加入体积为 8-10 倍的乙 醚沉淀多肽， 放入冰箱过夜。离心， 除去乙醚， 真空干燥， 得到 SA-RRRRRRRR 粗肽。 0033 将 100mg 上述的 SA-RRRRRRRR 粗肽溶于 2ml 纯水中， 用制备用反相 HPLC 纯化， 收 集保留主峰， 收集液经旋蒸浓缩， 然后冷冻干燥得 SA-RRRRRRR 纯肽。质谱分析表明， 其分子 量为 。
21、1543， 与理论值相符。最终得 N 端被硬脂酸修饰的 RRRRRRRR(SA-R8)。 说 明 书 CN 102743338 A 5 4/5 页 6 0034 (2) 固体脂质纳米粒制备 0035 精密称取 10mg 紫杉醇、 225mg 单硬脂酸甘油酯、 225mg 大豆磷脂置于 500mL 茄型 瓶， 加入一定量氯仿振摇溶解， 真空旋蒸除去氯仿形成含药薄膜， 抽真空过夜除去痕量有机 溶剂 ； 称取100mg泊洛沙姆188和100mg吐温80至10mL蒸馏水中形成水相 ； 将水相加入到 茄型瓶中水化成均匀乳浊液， 探头超声， 得到紫杉醇固体脂质纳米粒粗品， 离心 (2000rpm， 10m。
22、in) 除去少量金属屑， 过 0.8m 滤膜三次， 整粒， 得紫杉醇固体脂质纳米粒分散液。 0036 精确移取 5mL 紫杉醇固体脂质纳米粒分散液， 加入 10mg SA-R8， 磁力搅拌过夜， 得 到脂质穿膜肽 SA-R8和紫杉醇固体脂质纳米粒的复合纳米载体。该复合纳米载体的平均粒 径为 217.1nm， 多分散系数 PDI 为 0.280， zeta 电位为 34.3mV， 紫杉醇的包封率为 91.70。 以 10蔗糖为冻干保护剂， 将上述复合纳米载体制备成冻干粉保存， 使用时用蒸馏水复溶 使用。 0037 (3) 大鼠药动学实验 0038 18只SD雄性大鼠， 体重(20020)g， 随。
23、机分为三组， 作为受试动物。 服药前禁食12 小时， 自由饮水。给药方案 ： 其中参比制剂为市售制剂 (Taxol)， 受试制剂为自制的紫杉醇 固体脂质纳米粒 (PTX-SLN) 和 SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒 (SA-R8-PTX-SLN)， 口服给 药 (20mg/kg)。市售制剂 (Taxol)、 紫杉醇固体脂质纳米粒和 SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳 米粒口服给药后分别于 0.25、 0.5、 0.75、 1、 2、 3、 4、 6、 8、 10、 12、 24、 36、 48h， 眼底取血 0.4mL 置肝素抗凝塑料离心管中， 6000rpm 离心 10min， 取 0.15。
24、mL 上层血浆， 备用。 0039 市售制剂 (Taxol) 大鼠口服给药后的血药浓度 - 时间曲线见图 1。 0040 紫杉醇固体脂质纳米粒(PTX-SLN)大鼠口服给药后的血药浓度-时间曲线见图2。 0041 SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒 (SA-R8-PTX-SLN) 大鼠口服给药后的血药浓 度 - 时间曲线见图 3。 0042 由图1、 图2和图3可见， 市售制剂(Taxol)和紫杉醇固体脂质纳米粒口服给药后， 分别在 4h 和 12h 后血药浓度已在检测限以下， SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒在 36h 仍 在检测限以上。 0043 表 1Taxol、 PTX-SLN 和 。
25、SA-R8-PTX-SLN 的大鼠口服药动学参数 (n 6) 0044 0045 注 ： *P 0.05， 与 Taxol 比较。 0046 采用非房室模型计算市售制剂(Taxol)、 紫杉醇固体脂质纳米粒和SA-R8修饰紫杉 醇固体脂质纳米粒大鼠口服给药后的药动学参数， 结果见表 1。根据市售制剂 (Taxol)、 紫 说 明 书 CN 102743338 A 6 5/5 页 7 杉醇固体脂质纳米粒和 SA-R8修饰紫杉醇固体脂质纳米粒大鼠口服给药后血药浓度 - 时间 曲线下面积 (AUC0-t)， 以市售制剂 (Taxol) 为参比， 计算紫杉醇固体脂质纳米粒 (PTX-SLN) 和 SA-R8 修饰紫杉醇固体脂质纳米粒 (SA-R8-PTX-SLN) 的相对生物利用度， PTX-SLN 和 SA-R8-PTX-SLN 的相对生物利用度分别提高了 2.35 倍和 8.67 倍。 说 明 书 CN 102743338 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102743338 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102743338 A 9 。