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一种花生短周期组织培养方法.pdf

  • 上传人：zhu****_FC
  • 文档编号：4846896
  • 上传时间：2018-11-17
  • 格式：PDF
  • 页数：13
  • 大小：2.85MB
    • 摘要
    申请专利号：

    CN201310100062.5

    		 申请日：

    2013.03.26
    公开号：

    CN103168689A

    		 公开日：

    2013.06.26
    当前法律状态：

    终止

    		 有效性：

    无权
    法律详情：

    未缴年费专利权终止IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20130326授权公告日:20140716终止日期:20170326|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20130326|||公开
    IPC分类号：

    A01H4/00

    		 主分类号：

    A01H4/00
    申请人：

    河北农业大学
    发明人：

    刘立峰; 马彩霞; 穆国俊; 侯名语; 陈焕英; 何美敬
    地址：

    071001 河北省保定市灵雨寺街289号
    优先权：

    专利代理机构：

    北京路浩知识产权代理有限公司 11002

    		 代理人：

    王朋飞;张庆敏
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    内容摘要

    本发明提供一种花生短周期组织培养方法，包括如下步骤：1）花生种子表面消毒和浸种；2）取花生种子的胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上培养；3）切取丛生芽或丛生芽组织块，接种到一号伸长培养基上培养和二号伸长培养基上交替培养至得到2～3cm长的幼苗；4）切取2～3cm长的幼苗，接种到生根培养基上培养，直至长出健壮的根得到完整的植株；5）将完整的植株炼苗后移栽到蛭石上。通过本发明的方法对花生进行组织培养，可在15周内得到生根的花生组培苗，大大缩短了组培所需周期，从而加快了花生组培苗的繁育速度，且本发明的方法培育花生组配苗的再生率高，重复性好。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种花生短周期组织培养方法，包括如下步骤：
    1）花生种子表面消毒和浸种；
    2）取步骤1）所述花生种子的胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上培养，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块；
    所述丛生芽诱导培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+5～6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基；
    3）切取步骤2）所述丛生芽或丛生芽组织块，接种到一号伸长培养基上培养，每三周继代一次；每次继代切取新分化的丛生芽或丛生芽组织块转至步骤2）所述丛生芽诱导培养基上培养，并切取开始伸长的丛生芽或丛生芽组织块转至二号伸长培养基上培养至得到2～3cm长的幼苗；
    所述一号伸长培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6‑BA的固体培养基，pH=5.8；所述二号伸长培养基为MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3，pH=5.8的固体培养基；
    4）切取步骤3）所述2～3cm长的幼苗，接种到生根培养基上培养，直至长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；
    所述生根培养基为MSB5+1mg/L NAA，pH=5.8的固体培养基；
    5）将步骤4）所述完整的植株炼苗后移栽到蛭石上。

    2.   如权利要求1所述的花生短周期组织培养方法，其特征在于，步骤1）所述表面消毒是指：将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，先后浸于体积百分比75%的乙醇溶液中1min、质量百分比0.1%的HgCl2溶液中10min，再用无菌水漂洗4～5次。

    3.   如权利要求1所述的花生短周期组织培养方法，其特征在于，步骤1）所述浸种为将经表面消毒的花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中7h。

    4.   如权利要求1所述的花生短周期组织培养方法，其特征在于，步骤5）所述炼苗为打开培养瓶的封口膜，向瓶中加入没过培养基的无菌水，开盖炼苗3d。

    5.   应用于权利要求1所述花生短周期组织培养方法的丛生芽诱导培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+5～6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。

    6.   如权利要求5所述的丛生芽诱导培养基，为MSB5+0.2mg/LNAA+6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。

    7.   应用于权利要求1所述花生短周期组织培养方法的一号伸长培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。

    8.   应用于权利要求1所述花生短周期组织培养方法的二号伸长培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3，pH=5.8的固体培养基。

    9.   权利要求1‑4任一项所述花生短周期组织培养方法在花生繁育中的应用。

    10.   如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述花生的品种为麻油1‑1、弗落蔓生、濮花23号或海花1号。

    说明书

    说明书一种花生短周期组织培养方法
    技术领域
    本发明属于植物的组织培养领域，具体涉及一种花生短周期组织培养方法。
    背景技术
    花生是世界上重要的经济作物和油料作物。我国花生产量居世界第一，种植面积居世界第二，在世界花生生产上具有举足轻重的地位。传统育种可以有效的提高花生在产量、抗旱等方面的特性，但基因工程育种比传统育种方法更能有效地对一些有益目的性状进行保留、筛选。花生的遗传基础较弱，可用的有效资源有限，利用基因工程技术进行花生遗传转化，关键在于建立一个高效的受体系统，即需要建立一个高效的花生植株组织培养方法。
    花生作为一种大粒豆科植物，国内外已有成功实现花生离体再生的报道：McKently等以带胚子叶以及去胚子叶为外植体诱导丛生芽，发现带胚子叶为最适外植体，经过258d长成完整植株，但上述研究中外植体取材过程复杂且对种子需求量较大；Charleen和Venkatachala分别以胚小叶为外植体，通过体细胞胚再生途径成功诱导出胚性愈伤组织，但是存在分化成株困难的问题；Mroginski等以3‑5d苗龄的不成熟小叶为外植体诱导丛生芽并获得完整植株；Tiwari等以未成熟胚小叶为外植体研究预培养时间、培养基及基因型对胚小叶再生的影响，整个过程再生率可达80%，耗时4个月，但上述以胚小叶为外植体的再生体系依然存在着成株困难以及重复性低的问题，同时再生频率低以及周期长的问题还有待解决，同时研究表明植株离体再生对基因型有很强的依赖性。因此建立一种周期短、再生率高、重复性好的花生植株再生体系具有重要意义。
    发明内容
    针对花生组织培养周期长、再生率低、重复性差的现状，本发明的目的在于提供一种花生短周期组织培养方法，包括如下步骤：
    1）花生种子表面消毒和浸种；
    2）取步骤1）所述花生种子的胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上培养，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块；
    所述丛生芽诱导培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+5～6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基（即以MSB5为基础培养基，添加NAA的终浓度为0.2mg/L，添加6‑BA的终浓度为6mg/L，pH值为5.8的固体培养基，以下培养基成分以此类推）；
    3）切取步骤2）所述丛生芽或丛生芽组织块，接种到一号伸长培养基上培养，每三周继代一次；每次继代切取新分化的丛生芽或丛生芽组织块转至步骤2）所述丛生芽诱导培养基上培养，并切取开始伸长的丛生芽或丛生芽组织块转至二号伸长培养基上培养至得到2～3cm长的幼苗；
    所述一号伸长培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6‑BA的固体培养基，pH=5.8；所述二号伸长培养基为MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3，pH=5.8的固体培养基；
    4）切取步骤3）所述2～3cm长的幼苗，接种到生根培养基上培养，直至长出至少4条根且主根长度大于2cm，得到完整的植株；
    所述生根培养基为MSB5+1mg/L NAA，pH=5.8的固体培养基；
    5）将步骤4）所述完整的植株炼苗后移栽到蛭石上。
    其中，步骤1）所述表面消毒是指：将花生成熟荚果去果皮，选取颗粒饱满、表面光滑的种子，用水冲洗后吸干表面水分，先后浸于体积百分比75%的乙醇溶液中1min、质量百分比0.1%的HgCl2溶液中10min，再用无菌水漂洗4～5次。
    其中，步骤1）所述浸种为将经表面消毒的花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中7h。
    其中，步骤4）所述生根培养的时间为2周。
    其中，步骤5）所述炼苗为打开培养瓶的封口膜，向瓶中加入没过培养基的无菌水，开盖炼苗3d。
    其中，所述培养的环境条件为光照强度1500～2000lx，光照时间16h/d，温度26±0.5℃。
    本发明还提供应用于花生短周期组织培养方法的丛生芽诱导培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+5～6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。
    其中，所述丛生芽诱导培养基优选MSB5+0.2mg/L NAA+6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。
    本发明还提供应用于花生短周期组织培养方法的一号伸长培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基。
    本发明还提供应用于花生短周期组织培养方法的二号伸长培养基，为MSB5+0.2mg/L NAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3，pH=5.8的固体培养基。
    本发明还提供应用于花生短周期组织培养方法的生根培养基，为MSB5+1mg/L NAA，pH=5.8的固体培养基。
    本发明还提供所述花生短周期组织培养方法在花生繁育中的应用。
    其中，所述花生的品种为麻油1‑1、弗落蔓生、濮花23号或海花1号。
    本发明的有益效果在于：
    1、通过本发明的方法对花生进行组织培养，再生率高，其中再生率大于80%的品种有：麻油1‑1、弗落蔓生、濮花23号、海花1号，最高可达93.01%±0.01。
    2、通过本发明的方法对花生进行组织培养，可在15周内得到生根的组培苗，大大缩短了组培所需周期，从而加快了花生组培苗的繁育速度。
    3、本发明的花生组织培养方法重复性好。
    附图说明
    图1为实施例1中芽诱导培养15天后的胚小叶照片；
    图2为实施例1中芽诱导培养15天后的胚小叶周边长出的丛生芽照片；
    图3为实施例2中边上有新分化的丛生芽的幼苗照片；
    图4为实施例2中2‑3cm长的幼苗照片；
    图5为实施例3中长有根的完整植株照片；
    图6为实施例3中移栽到蛭石中的植株照片。
    具体实施方式
    以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
    若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例中所用化学试剂均为化学纯，其中所用6‑BA购自北京博奥拓达科技有限公司，所用NAA和GA3均购自sigma,所用琼脂、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素均购自北京索莱宝科技有限公司，其余所用药品均购自天津市福晨化学试剂厂。
    所用的14个花生品种为：
    麻油1‑1、弗落蔓生、狮头企、RHP12、邢花1号、濮花23号、海花1号、佛州巨人、兰娜（大）、白沙1016、LH花生、冀花5号、花育19、花育25，以上品种均为地方品种，在河北农业大学种质资源库中均有保存。
    实施例1丛生芽诱导培养基的筛选
    本实施例以品种麻油1‑1为材料。
    本实施例所用基本培养基为MSB5培养基，是包括MS培养基中大量、微量和铁盐成分以及B5培养基中的有机成分的培养基，其母液配置如表1‑表5所示：
    表1MS大量母液（20倍）配置

    表2MS微量母液（200倍）配置

    表3MS铁盐母液（200倍）配置

    表4B5有机元素母液(1000倍)配置


    表5肌醇母液(100倍)配置

    每升MSB5培养基中包含30g蔗糖，7g琼脂，pH值为5.8。
    以以上所述MSB5培养基为基本培养基，添加不同浓度的a‑萘乙酸（NAA）与不同浓度6‑苄基嘌呤（6‑BA），配制待筛选的丛生芽诱导培养基，具体激素浓度设置见表6，pH值为5.8。
    表6待选丛生芽诱导培养基的激素种类和浓度组合

    筛选丛生芽诱导培养基的步骤如下：
    将花生成熟荚果去果皮,选取颗粒饱满，表面光滑的种子，于自来水下反复冲洗数次，吸水纸吸干表面水分，先后浸于体积百分比75%的乙醇溶液中1min、质量百分比0.1%的HgCl2溶液中10min，进行表面消毒，再用无菌水漂洗4‑5次。将经表面消毒的花生种子剥去种皮，浸泡于无菌水中7h备用。
    于超净工作台中，用镊子小心将浸泡7h后的花生两片子叶去除，得到完整体胚，再以镊子轻轻将胚小叶分离，每粒种子可以得到6～8片胚小叶，分别接种于表6所示的5种待筛选丛生芽诱导培养基上，置于光照培养箱中培养，光照强度1500‑2000lx，光照时间16h/d，温度为26±0.5℃，用以诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块。
    以上各处理重复3次，每重复110‑120个外植体，接种15天后的胚小叶如图1所示，其周边长有的丛生芽的照片见图2，统计芽诱导率，结果如表7所示。
    表7不同激素浓度对丛生芽诱导的影响

    注：同列不同的大写字母表示差异达到显著水平(P≤0.05)
    结果表明，诱导率较高的MSB5+0.2mg/L NAA+5mg/L6‑BA培养基和MSB5+0.2mg/L NAA+6mg/L6‑BA培养基之间差异不显著，诱导率可达86%以上，均适合作为花生的丛生芽诱导培养基。而6‑BA浓度过高或过低都会抑制丛生芽的诱导。
    实施例2伸长培养基的筛选
    本实施例使用实施例1中的MSB5培养基为基本培养基，按照表8的组合配制添加6‑苄基嘌呤（6‑BA）、a‑萘乙酸（NAA）、赤霉素（GA3），得到待筛选的伸长培养基，pH值为5.8。
    表8待选伸长培养基的激素种类和浓度组合

    本实施例切取实施例1中诱导的丛生芽或丛生芽组织块，转移到7个待测伸长培养基中，置于光照培养箱中培养，光照强度1500～2000lx，时间16h/d，温度为26±0.5℃，每三周继代一次，继代的幼苗如图3所示，既有幼苗，边上又有新分化的丛生芽，用以对丛生芽进行伸长和增殖培养。
    以上各处理重复3次，每重复70～90个丛生芽，当丛生芽伸长至2～3cm统计每丛生芽伸长数，用以对比筛选最佳芽伸长培养基，结果如表9所示，单独添加GA3较GA3同6‑BA和NAA结合使用，对丛生芽的伸长效果差异显著（P<0.001）；单独添加GA3的情况下，随着GA3浓度的升高对丛生芽的伸长产生了抑制，浓度为2mg/L最为适宜；GA3同6‑BA和NAA结合使用的情况下，当GA3和NAA浓度不变，随着6‑BA浓度的增大每丛生芽伸长数变化不显著，2mg/LGA3与0.2mg/LNAA、4mg/L6‑BA组合每丛生芽伸长数最多(0.35±0.01)。由于观察到GA3会抑制丛生芽周围组织分化新的芽点，但是能够快速的促进已分化丛生芽的伸长，缩短伸长时间。因此，本发明选用Ⅵ号和Ⅶ号芽伸长培养基结合使用，分别作为一号伸长培养基和二号伸长培养基，即MSB5+0.2mg/LNAA+3mg/L6‑BA和MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3两种伸长培养基交替使用，可有效提高每丛生芽伸长数至7.24±0.85并缩短丛生芽伸长时间至3‑4周，此时得到的2～3cm长的幼苗如图4所示。
    表9不同激素浓度对对丛生芽伸长数的影响


    注：同列不同的大写字母表示差异达到显著水平(P≤0.05)，处理Ⅶ不参与此次比较
    实施例3本发明花生短周期组织培养方法的建立与验证
    根据实施例1‑2的结果，建立本发明花生短周期组织培养方法，包括如下步骤：
    1）花生种子表面消毒和浸种；
    2）取步骤1）所述花生种子的胚小叶，接种到丛生芽诱导培养基上培养，诱导胚小叶产生丛生芽或丛生芽组织块；
    所述丛生芽诱导培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+5～6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基；
    3）切取步骤2）所述丛生芽或丛生芽组织块，接种到一号伸长培养基上培养，每三周继代一次；每次继代切取新分化的丛生芽或丛生芽组织块转至步骤2）所述丛生芽诱导培养基上培养，并切取开始伸长的丛生芽或丛生芽组织块转至二号伸长培养基上培养至得到2～3cm长的幼苗；
    所述一号伸长培养基为MSB5+0.2mg/L NAA+3mg/L6‑BA的固体培养基，pH=5.8；所述二号伸长培养基为MSB5+0.2mg/LNAA+4mg/L6‑BA+2mg/L GA3，pH=5.8的固体培养基；
    4）切取步骤3）所述2～3cm长的幼苗，接种到生根培养基上培养，直至长出健壮的根得到完整的植株；
    所述生根培养基为MSB5+1mg/L NAA，pH=5.8的固体培养基；
    5）将步骤4）所述植株炼苗后移栽到蛭石上，待长出发达根系后定植到田间。
    本实施例对建立的以上方法进行验证，所用的14个花生品种为麻油1‑1、弗落蔓生、狮头企、RHP12、邢花1号、濮花23号、海花1号、佛州巨人、兰娜（大）、白沙1016、LH花生、冀花5号、花育19、花育25。
    其中，本实施例采用MSB5+0.2mg/L NAA+6mg/L6‑BA，pH=5.8的固体培养基作为试验时的丛生芽诱导培养基。
    丛生芽诱导培养基的诱导率如表10所示：芽诱导率大于80%的品种有：麻油1‑1、弗落蔓生、濮花23号、海花1号，最高为麻油1‑1，达93.01%±0.01。
    表10不同基因型花生品种的诱导率
    基因型芽诱导率（%±SD）基因型芽诱导率（%±SD）麻油1‑193.01±0.01A狮头企53.76±0.07D弗落蔓生89.25±0A邢花1号51.58±0.11D濮花2380.47±0.07ABRHP1249.13±0.02D海花1号80.34±0.04AB花育1929.86±0.04E佛州巨人74.91±0.06BC白沙101629.02±0.01E兰娜（大）62.94±0.05DCLH花生26.26±0.03E冀花5号60.97±0.03D花育2525.51±0.02E
    注：同列不同的大写字母表示差异达到显著水平(P≤0.05)
    依据本实施例的花生短周期组织培养方法对上述14个品种进行组织培养的结果显示，所有品种均可在15周内得到生根组培苗，长有根的完整植株照片见图5，移栽到蛭石中的植株照片见图6。

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