具有稳定区域的GLP1受体激动剂化合物.pdf

本发明内容提供具有相当于天然肽化合物的α-螺旋区的稳定区域的GLP-1受体激动剂化合物。本发明内容还提供含苯甲酰胺的毒蜥外泌肽-4类似物和烯烃受约束的毒蜥外泌肽-4类似物，两种类似物具有相当于毒蜥外泌肽-4的α-螺旋区的稳定区域。

权利要求书
1.    式(I)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z如权利要求书中所定义，且其中2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续氨基酸残基被苯甲酰胺基团Y1取代。

2.    下式(II)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25、Y1和Z如权利要求书中所定义，且其中Xaa10为Leu或不存在；Xaa11为Ser或不存在；Xaa12为Lys或不存在；Xaa13为Gln或不存在；Xaa15为Glu或不存在；Xaa16为Glu或Ala；Xaa17为Glu或Ala；Xaa19为Val或不存在；Xaa20为Arg或不存在；Xaa21为Leu或不存在。

3.    下式(III)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z如权利要求书中所定义；
Xaa6‑Xaa14总的合在一起选自：
Phe Thr Ser Y1；
Phe Y1 Gln Met；
Phe Thr Y1 Met；
Y1 Lys Gln Met；
Phe Y1 Gln Leu；
Phe Thr Y1 Leu；
Y1 Lys Gln Leu；
Y1 Ser Lys Gln Met；
Phe Y1 Lys Gln Met；
Phe Thr Y1 Gln Met；
Phe Thr Ser Y1 Met；
Phe Thr Ser Asp Y1；
Y1 Ser Lys Gln Leu；
Phe Y1 Lys Gln Leu；
Phe Thr Y1 Gln Leu；
Phe Thr Ser Y1 Leu；
Phe Thr Ser Asp Leu Y1；
Phe Thr Ser Asp Y1 Met；
Phe Thr Ser Y1 Gln Met；
Phe Thr Y1 Lys Gln Met；
Phe Y1 Ser Lys Gln Met；
Y1 Leu Ser Lys Gln Met；
Phe Thr Ser Asp Y1 Leu；
Phe Thr Ser Y1 Gln Leu；
Phe Thr Y1 Lys Gln Leu；
Phe Y1 Ser Lys Gln Leu；或
Y1 Leu Ser Lys Gln Leu;
其中Y1如权利要求书中所定义；
Xaa15为Glu或不存在；
Xaa16为Glu或Ala；和
Xaa17为Glu或Ala。

4.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa1为His、脱氨基His或
其中R4为键、取代或未取代的亚链烷基或者取代或未取代的亚链烯基。

5.    权利要求4的化合物，其中R4为键。

6.    权利要求4的化合物，其中R4为任选被烃基、羟基或羧基取代的C1、C2、C3或C4亚链烃基。

7.    权利要求4的化合物，其中R4为亚甲基。

8.    权利要求4的化合物，其中R4为被一个或多个取代基R5取代的亚乙基，其中R5独立地为烃基、羟基或羧基。

9.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa1选自：
。

10.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa1为His或脱氨基His。

11.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa2为Gly、Ala、D‑Ala或Aib。

12.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa2为Gly、d‑Ala或Ala。

13.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa3为Gly、Ala、D‑Ala、Aib、Glu、Pro或选自以下的部分：
。

14.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa3为Gly、Ala、Glu或Pro。

15.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa3为Gly或Pro。

16.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa14为Met或Leu。

17.    权利要求1、2或3的化合物，其中Xaa25为Trp或Phe。

18.    权利要求1、2或3的化合物，其中Z为‑OH；‑NH2；Gly Gly‑OH；Gly Gly‑NH2；Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑OH；或Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑NH2。

19.    权利要求1、2或3的化合物，其中Z为‑OH或‑NH2。

20.    权利要求1、2或3的化合物，其中Y1为：

其中X为键、氧、硫、‑NH‑、‑NR’‑、取代或未取代的亚链烷基或者取代或未取代的亚链烯基；
R’为取代或未取代的烃基；
n为0、1、2、3、4、5或6的整数；
R1a为氢、卤素、羟基、硫醇基、羧基、取代或未取代的甲酰氨基、氨甲酰基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的亚氨基、取代或未取代的脲、硝基、亚硝基、取代或未取代的直链或支链烃基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烃氧基、取代或未取代的烯氧基、取代或未取代的环烃基氧基、取代或未取代的杂烃基氧基、取代或未取代的杂环烃基氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳氧基、取代或未取代的烃硫基、取代或未取代的烯硫基、取代或未取代的环烃基硫基、取代或未取代的杂烃基硫基、取代或未取代的杂环烃基硫基、取代或未取代的芳硫基、取代或未取代的杂芳硫基、取代或未取代的烃基亚磺酰基、取代或未取代的烯基亚磺酰基、取代或未取代的环烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂环烃基亚磺酰基、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的杂芳基亚磺酰基、取代或未取代的烃基磺酰基、取代或未取代的烯基磺酰基、取代或未取代的环烃基磺酰基、取代或未取代的杂烃基磺酰基、取代或未取代的杂环烃基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基或者取代或未取代的杂芳基磺酰基；和
S为1、2、3、4、5或6的整数。

21.    药物组合物，其包含权利要求1‑20中任一项的化合物和药学上可接受的载体。

22.    下式(IV)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z如权利要求书中所定义，且其中至少一对氨基酸残基由如下表示的亚链烯基桥连接：

其中m和p各自独立地为1、2、3、4、5或6。

23.    式(V)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14和Z如权利要求书中所定义；
Y2为：

Xaa25为Phe或Trp；
a为1、2或3；
b为0、1或2；和
。

24.    式(VI)的化合物：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14和Z如权利要求书所定义；
Y3为：

Xaa25为Phe或Trp；
a为1、2或3；
b为0、1或2；和
。

25.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa1为His、脱氨基His或

其中R4为键、取代或未取代的亚链烷基或者取代或未取代的亚链烯基。

26.    权利要求25的化合物，其中R4为键。

27.    权利要求25的化合物，其中R4为被烃基、羟基或羧基任选取代的C1、C2、C3或C4亚链烃基。

28.    权利要求25的化合物，其中R4为亚甲基。

29.    权利要求25的化合物，其中R4为被一个或多个取代基R5取代的亚乙基，其中R5独立地为烃基、羟基或羧基。

30.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa1选自：
。

31.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa1为His或脱氨基His。

32.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa2为Gly、Ala、D‑Ala或Aib。

33.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa2为Gly、d‑Ala或Ala。

34.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa3为Gly、Ala、D‑Ala、Aib、Glu、Pro或选自以下的部分：
。

35.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa3为Gly、Ala、Glu或Pro。

36.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa3为Gly或Pro。

37.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa14为Met或Leu。

38.    权利要求22、23或24的化合物，其中Xaa25为Trp或Phe。

39.    权利要求22、23或24的化合物，其中Z为‑OH；‑NH2；Gly Gly‑OH；Gly Gly‑NH2；Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑OH；或Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑NH2。

40.    权利要求22、23或24的化合物，其中Z为‑OH或‑NH2。

41.    药物组合物，其包含权利要求22‑40中任一项的化合物和药学上可接受的载体。

42.    化合物编号12。

43.    化合物编号13。

44.    化合物编号14。

45.    化合物编号15。

46.    化合物编号16。

47.    化合物编号17。

48.    化合物编号18。

49.    化合物编号22。

50.    化合物编号23。

51.    化合物编号24。

52.    化合物编号25。

53.    化合物编号26。

54.    化合物编号27。

55.    化合物编号34。

56.    化合物编号35。

57.    化合物编号36。

58.    药物组合物，其包含权利要求42‑57中任一项的化合物和药学上可接受的载体。

59.    用于治疗有需要的患者的糖尿病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以治疗患者的糖尿病。

60.    权利要求59的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。

61.    权利要求59的方法，其中所述糖尿病是2型糖尿病。

62.    权利要求59的方法，其中所述糖尿病是妊娠糖尿病。

63.    用于治疗有需要的患者的肥胖症或体重超重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以治疗患者的肥胖症或体重超重。

64.    用于治疗肥胖症的权利要求63的方法。

65.    用于治疗体重超重的权利要求63的方法。

66.    用于减轻有需要的患者的体重的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以减轻患者的体重。

67.    用于治疗有需要的患者的胰岛素抵抗或餐后高血糖症的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以治疗患者的胰岛素抵抗或餐后高血糖症。

68.    用于降低有需要的患者的HBA1c或血浆葡萄糖的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以降低患者的HBA1c或血浆葡萄糖。

69.    治疗有需要的患者的心血管疾病的方法，所述方法包括给予治疗有效量的权利要求1‑20、22‑40和42‑57中任一项的化合物或权利要求21、41或58的药物组合物以治疗患者的心血管疾病。

70.    权利要求69的方法，其中所述心血管疾病是心脏病、充血性心力衰竭、高血压、外周血管疾病、心绞痛、动脉粥样硬化、心肌梗死、高甘油三酯血症或高胆固醇血症。

71.    用于含取代的苯甲酰胺的化合物的固相合成的方法，所述方法包括：
a) 使具有游离胺的树脂结合试剂与具有侧链替代部分的取代苯基、游离羧酸和硝基部分反应，从而形成树脂结合的取代苯甲酰胺基；和
b) 使所述硝基部分还原形成游离胺，从而形成具有游离胺的树脂结合的取代苯甲酰胺基。

72.    权利要求71的方法，所述方法还包括：
c) 重复步骤a)‑b)以将一个或多个额外的取代苯基部分添加至所述树脂结合的取代苯甲酰胺基上，从而形成具有游离胺的延伸的树脂结合的取代苯甲酰胺基。

73.    权利要求71的方法，所述方法还包括：
d) 使所述具有游离胺的树脂结合的取代苯甲酰胺基与额外的氨基酸反应，从而形成含取代的苯甲酰胺的化合物。

74.    权利要求72的方法，所述方法还包括：
d) 使所述具有游离胺的延伸的树脂结合的取代苯甲酰胺基与额外的氨基酸反应，从而形成含取代的苯甲酰胺的化合物。

75.    权利要求71的方法，其中所述树脂结合试剂是与所述树脂结合的游离胺部分。

76.    权利要求71的方法，其中所述树脂结合试剂包含肽。

77.    权利要求71‑76中任一项的方法，其中每次出现的所述侧链替代部分独立地为氢、卤素、羟基、硫醇基、羧基、取代或未取代的甲酰氨基、氨甲酰基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的亚氨基、取代或未取代的脲、硝基、亚硝基、取代或未取代的烃基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烃氧基、取代或未取代的烯氧基、取代或未取代的环烃基氧基、取代或未取代的杂烃基氧基、取代或未取代的杂环烃基氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳氧基、取代或未取代的烃硫基、取代或未取代的烯硫基、取代或未取代的环烃基硫基、取代或未取代的杂烃基硫基、取代或未取代的杂环烃基硫基、取代或未取代的芳硫基、取代或未取代的杂芳硫基、取代或未取代的烃基亚磺酰基、取代或未取代的烯基亚磺酰基、取代或未取代的环烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂环烃基亚磺酰基、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的杂芳基亚磺酰基、取代或未取代的烃基磺酰基、取代或未取代的烯基磺酰基、取代或未取代的环烃基磺酰基、取代或未取代的杂烃基磺酰基、取代或未取代的杂环烃基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基或者取代或未取代的杂芳基磺酰基。

78.    用于含取代的苯甲酰胺的化合物的固相合成的方法，所述方法包括：
a) 使具有游离胺的树脂结合试剂与具有多个侧链替代部分、游离羧酸和硝基部分的取代聚苯甲酰胺试剂反应，从而形成树脂结合的取代聚苯甲酰胺基；和
b) 使所述硝基部分还原以形成游离胺，从而形成具有游离胺的树脂结合的取代聚苯甲酰胺基。

79.    权利要求78的方法，所述方法还包括：
c) 重复步骤a)‑b)以将一个或多个额外的取代聚苯甲酰胺部分添加至所述树脂结合的取代聚苯甲酰胺基上，从而形成具有游离胺的延伸的树脂结合的取代聚苯甲酰胺基。

80.    权利要求79的方法，所述方法还包括：
d) 使所述具有游离胺的树脂结合的取代聚苯甲酰胺基与额外的氨基酸反应，从而形成含取代的苯甲酰胺的化合物。

81.    权利要求79的方法，所述方法还包括：
d) 使所述具有游离胺的延伸的树脂结合的取代聚苯甲酰胺基与额外的氨基酸反应，从而形成含取代的苯甲酰胺的化合物。

82.    权利要求78‑81中任一项的方法，其中所述多个侧链替代部分各独立地为氢、卤素、羟基、硫醇基、羧基、取代或未取代的甲酰氨基、氨甲酰基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的亚氨基、取代或未取代的脲、硝基、亚硝基、取代或未取代的烃基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烃氧基、取代或未取代的烯氧基、取代或未取代的环烃基氧基、取代或未取代的杂烃基氧基、取代或未取代的杂环烃基氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳氧基、取代或未取代的烃硫基、取代或未取代的烯硫基、取代或未取代的环烃基硫基、取代或未取代的杂烃基硫基、取代或未取代的杂环烃基硫基、取代或未取代的芳硫基、取代或未取代的杂芳硫基、取代或未取代的烃基亚磺酰基、取代或未取代的烯基亚磺酰基、取代或未取代的环烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂环烃基亚磺酰基、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的杂芳基亚磺酰基、取代或未取代的烃基磺酰基、取代或未取代的烯基磺酰基、取代或未取代的环烃基磺酰基、取代或未取代的杂烃基磺酰基、取代或未取代的杂环烃基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基或者取代或未取代的杂芳基磺酰基。

说明书具有稳定区域的GLP‑1受体激动剂化合物
相关申请
本申请要求2010年7月28日提交的美国申请号61/368,522的优先权，其公开内容通过引用结合到本文中。
领域
本公开内容涉及具有稳定区域的胰高血糖素样肽‑1 (GLP‑1)受体激动剂化合物、含有GLP‑1受体激动剂化合物的药物组合物、使用GLP‑1受体激动剂化合物的治疗性治疗和用于制备GLP‑1受体激动剂化合物的方法。
背景
肽和蛋白质在生物过程的调节中起关键性作用。例如肽作为激素和抑制剂起调节作用，并且还参与免疫识别。肽的重大生物作用使其在了解肽与其所结合的受体的相互作用时是重要的。
肽的受体结合构象的确定对于肽类似物的合理设计而言极为重要。因为肽是高柔性分子，其结构受到其存在的环境的强烈影响，肽本身一般不可用于测定其受体结合构象。因此，必需以系统方式进行结构功能研究，以提供有关肽中对生物活性是重要的特定氨基酸残基和官能团的信息。这种性质的研究可利用构象上受约束的肽模拟物。例如Hruby, Trends Pharmacol. Sci., 8:336‑339 (1987)提出构象约束可提供有关受体对作为激动剂或拮抗剂的配体具有不同要求的信息。
肽模拟物(Peptide mimetics)或模拟肽(peptidomimetics)是在与受体和酶的相互作用中用作肽和/或氨基酸的合适替代物的结构。发现肽模拟物的合理方法的研发是药物化学的一个主要目标。已通过经验筛选方法和特定合成设计两者尝试这类研发。肽模拟物的具体设计利用肽骨架修饰、肽二级结构的化学模拟和对肽母体的共价约束以利于这类肽二级结构。
α螺旋将其残基的侧链沿棒状螺旋结构呈现。约3.6个氨基酸残基构成α‑螺旋的单个转角。因此，空间上相邻的侧链形成α‑螺旋的一“侧”，其中每3‑4个残基出现的残基沿着线性氨基酸序列。照本领域的惯例，这种间距可称为“i，i+3/i+4，i+7”等以表示偏移残基“i”的残基侧链以空间上邻近的方式大致位于沿α螺旋一侧。在α螺旋的情况下，术语“面”与术语“侧”同义。认为i、i+3/i+4和i+7残基可与靶蛋白发生关键性接触，且这种接触构成大部分结合能。Fairlie等，Curr. Med. Chem.，5:29 (1998)。α‑螺旋构象通过沿骨架的空间相互作用以及骨架酰胺羰基和各氨基酸的NH基团之间的氢键相互作用而稳定。α螺旋的侧链以众所周知的距离和角关系突出出来。Jain等，Mol. Divers., 8:89‑100 (2004)。
通过将合成模板引入肽类(peptidic)、通过使用β‑发夹模拟物、通过使用β‑肽序列和通过使用具有无关联折叠倾向的非天然寡聚体，实现了具有稳定α‑螺旋构象的模拟肽的合成。能够模拟约束肽表面的合成小分子提供稳定性改进、分子量较低和在某些情况下生物利用度较好的优势。在本领域中，已良好记载了采用各种定义明确的二级结构的合成小分子。本领域已知各种提高肽的α螺旋形成倾向的策略。示例性方法包括侧链约束、加帽(capping)和非天然氨基酸取代。
α螺旋的另一类约束利用闭环置换(ring closing metathesis，RCM)反应以形成掺入双键(例如亚链烯基(alkenylenyl)桥)或无双键(例如亚链烷基(alkylenyl)桥)的侧链‑侧链桥。烯烃置换反应的发现提供了用于在温和条件下合成和裂解碳‑碳键的便利途径。具体地说，利用受钌络合物催化的RCM反应已成为用于有机合成中形成亚链烯基桥接结构的普遍方法。对带有不饱和侧链(例如烯丙基甘氨酸、高烯丙基甘氨酸等)并位于肽基序的战略位置的氨基酸应用这种方法，可供通过固相肽合成(SPPS)方法制备环肽。
本领域需要新的GLP‑1受体激动剂化合物，其具有良好的稳定性、对降解的抗性、良好的胰高血糖素样肽‑1 (GLP‑1)受体结合活性和体内葡萄糖降低活性并且可用于治疗糖尿病和减轻体重。为了满足这些需要，本文的公开内容尤其提供具有稳定α‑螺旋区的GLP‑1受体激动剂化合物。
概述
按照螺旋‑卷曲转变理论，蛋白质中全部氨基酸残基的40%呈α‑螺旋构象，预期由10个或更少氨基酸组成的α‑螺旋因低的成核几率而基本上是不稳定的。在GLP‑1受体激动剂的情况下，例如毒蜥外泌肽‑4 (exendin‑4)和GLP‑1(7‑37)，α‑螺旋代表重要的序列选择性识别基序。毒蜥外泌肽‑4中的α‑螺旋受体结合区通常位于9‑30位，而GLP‑1(7‑37)中的α‑螺旋受体结合区位于15‑37位(包括15和37在内)。毒蜥外泌肽‑4和GLP‑1(7‑37)的螺旋特征扩展约20个氨基酸。
本公开内容提供具有α‑螺旋模拟物或可保持体外和体内活性的α‑螺旋稳定性的GLP‑1受体激动剂化合物，例如毒蜥外泌肽‑4。这就为可参与分子识别事件并可用于开发较小的具有优异代谢稳定性且性能提高的GLP‑1受体激动剂化合物的关键侧链残基提供了更好的了解，使得它们可用于口服制剂。这还提供了可用于治疗许多疾病和病症的新的GLP‑1受体激动剂化合物。
本公开内容提供含苯甲酰胺的肽化合物，所述化合物包含与式(I)具有至少50%序列同一性的氨基酸序列：

其中式(I)具有至少一个模拟一个或多个生理氨基酸侧链的苯甲酰胺部分；且其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z如本文定义。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物具有与式(I)有至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列。本公开内容提供包含这些含苯甲酰胺的化合物的药物组合物。本公开内容提供使用含苯甲酰胺的化合物和含有所述化合物的药物组合物治疗多种疾病(例如糖尿病)的方法。
本公开内容提供受约束的烯烃肽化合物，其包含与式(IV)有至少50%序列同一性的氨基酸序列：

其中肽化合物中的至少一对氨基酸残基通过亚链烯基桥或亚链烷基(alkylenyl)桥连接；且其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z如本文定义。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物具有与式(IV)有至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列。本公开内容提供包含这些受约束的烯烃化合物的药物组合物。本公开内容提供使用受约束的烯烃化合物和含有所述化合物的药物组合物治疗多种疾病(例如糖尿病)的方法。
本公开内容提供用于本文所述含苯甲酰胺的肽化合物的固相合成的方法。使具有游离胺的树脂结合试剂(resin‑bound reagent)与具有侧链替代部分的取代苯基、游离羧酸和硝基部分，反应从而形成树脂结合的取代苯甲酰胺基(benzamidyl)。将硝基部分还原以形成游离胺，从而形成具有游离胺的树脂结合的取代苯甲酰胺基，所述游离胺因此可用于额外的固相反应。
附图简述
为了附图及其所表示的实施例的目的，化合物(Cmpd) T1为；其中2位的小写“a”为dAla；化合物T2为。在整个说明书中，由单字母氨基酸缩写词表示的序列中小写“a”为dAla。
图1表示对于本文所述的某些含苯甲酰胺的化合物，作为治疗前水平百分比的血糖浓度的时程。治疗前葡萄糖浓度为123 mg/dL。各点表示平均值± s. d. (标准差。紧随基线样品后，在t=0时给2小时禁食的NIH/Swiss小鼠IP注射化合物(100 nmol/kg)。在t=30、60、120、180和240分钟时采集样品。按照生产商的说明书，使用One Touch® Ultra® (LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)测量血糖。图例：溶媒(实心方框)；化合物12 (空心菱形)；化合物14 (尖向下的实心三角形)；化合物13 (尖向上的实心三角形)；化合物T2 (空心三角形)；化合物T1 (交叉线)。
图2表示对于本文所述的某些含亚链烯基的化合物，作为治疗前水平百分比的血糖浓度的时程。实验条件与图1所述实验条件相同。图例：溶媒(实心方框)；化合物22 (空心菱形)；化合物27 (尖向下的实心三角形)；化合物34 (尖向上的实心三角形)；化合物T2 (空心三角形)；化合物T1 (交叉线)。
图3表示化合物T1的侧链和化合物13的侧链替代部分之间可利用的重叠的分子建模研究结果。
图4表示化合物T1的侧链与化合物27和化合物34的侧链替代部分之间可利用的重叠的分子建模研究结果。
发明详述
本文所用缩写词具有其在化学和生物领域内的常规含义。本文所示化学结构和化学式按照化学领域已知化学价的标准规则建立。如果常规含义和本文所述定义间存在差异，则以本文定义为准。
如果取代基用其常规化学式指定，自左向右书写，则它同样包括自右向左书写结构得到的化学上相同的取代基，例如‑CH2O‑等同于‑OCH2‑。
术语“烃基(alkyl)”独自或作为另一取代基的部分，意指直链(即不分支的)或支链或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，可包括具有规定碳原子数(即C1‑C10意指1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个碳)的二价和多价基团。饱和烃基(saturated hydrocarbon radicals)的实例包括但不限于以下基团：例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、(环己基)甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烃基(unsaturated alkyl group)是具有一个或多个双键(即“烯基”)或三键(即“炔基”)的烃基。不饱和烃基(unsaturated alkyl group)的实例包括但不限于乙烯基、2‑丙烯基、巴豆基、2‑异戊烯基、2‑(丁二烯基)、2,4‑戊二烯基、3‑(1,4‑戊二烯基)、乙炔基、1‑丙炔基和3‑丙炔基、3‑丁炔基和高级同系物和异构体。烃氧基(alkoxy)是通过氧连接基(‑O‑)与分子的其余部分连接的烃基。烃基硫基(alkylthio)是通过硫连接基(‑S‑)与分子的其余部分连接的烃基。
术语“亚烷基(alkylene)”和“亚链烷基(alkylenyl)”单独或作为另一取代基的部分，意指衍生自烷基的二价基团，例如但不限于‑CH2CH2CH2CH2‑。通常，烷基(或亚烷基)可具有1‑24个碳原子，优选10个或更少碳原子，更优选4个或更少碳原子。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基，一般具有8个或更少碳原子。术语“亚烯基(alkenylene)”和“亚链烯基(alkenylenyl)”单独或作为另一取代基的部分，意指衍生自烯烃的二价基团。
术语“杂烃基(heteroalkyl)”独自或与另一术语组合意指稳定的直链或支链或其组合，由至少一个碳原子和至少一个选自O、N、P、Si和S的杂原子组成，其中氮和硫原子可任选被氧化，且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N、P、S和Si可位于杂烃基的任一内部位置或位于烃基与分子的其余部分连接的位置。实例包括但不限于：‑CH2‑CH2‑O‑CH3、‑CH2‑CH2‑NH‑CH3、‑CH2‑CH2‑N(CH3)‑CH3、‑CH2‑S‑CH2‑CH3、‑CH2‑CH2、‑S(O)‑CH3、‑CH2‑CH2‑S(O)2‑CH3、‑CH=CH‑O‑CH3、‑Si(CH3)3、‑CH2‑CH=N‑OCH3、‑CH=CH‑N(CH3)‑CH3、‑O‑CH3、‑O‑CH­2‑CH3和‑CN。最多两个杂原子可以是连续的，例如‑CH2‑NH‑OCH3。
术语“杂亚烃基(heteroalkylene)”和“杂亚链烃基(heteroalkylenyl)”单独或作为另一取代基的部分，意指衍生自杂烃基的二价基团，例如但不限于‑CH2‑CH2‑S‑CH2‑CH2‑和‑CH2‑S‑CH2‑CH2‑NH‑CH2‑。对于杂亚烃基，杂原子还可占据链末端的任一端或两端(例如亚烃基氧基、亚烃基二氧基、亚烃基氨基、亚烃基二氨基等)。更进一步，对于亚烃基和杂亚烃基连接基团，连接基团式中书写的方向并不意味着连接基团的方向。例如，式‑C(O)2R'‑表示‑C(O)2R'‑和‑R'C(O)2‑两者。如上所述，本文所用杂烃基，包括通过杂原子与分子的其余部分连接的基团，例如‑C(O)R'、‑C(O)NR'、‑NR'R''、‑OR'、‑SR'和/或‑SO2R'。当叙述“杂烃基”，接着列举特定的杂烃基时，例如‑NR'R''等，要理解术语杂烃基和‑NR'R''并不多余或相互排斥。更确切地说，列举特定的杂烃基以增加明确性。因此，术语“杂烃基”在本文不应解释为排除特定的杂烃基，例如‑NR'R''等。
术语“环烃基(cycloalkyl)”和“杂环烃基(heterocycloalkyl)”独自或与其它术语组合分别意指“烃基”和“杂烃基”的环状形式。此外，对于杂环烃基，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烃基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1‑环己烯基、3‑环己烯基、环庚基等。杂环烃基的实例包括但不限于1‑(1,2,5,6‑四氢吡啶基)、1‑哌啶基、2‑哌啶基、3‑哌啶基、4‑吗啉基、3‑吗啉基、四氢呋喃‑2‑基、四氢呋喃‑3‑基、四氢噻吩‑2‑基、四氢噻吩‑3‑基、1‑哌嗪基、2‑哌嗪基等。“环亚烃基(cycloalkylene)”或“环亚链烃基(cycloalkylenyl)”和“杂环亚烃基(heterocycloalkylene)”或“杂环亚链烃基(heterocycloalkylenyl)”单独或作为另一取代基的部分，意指分别衍生自环烃基和杂环烃基的二价基团。
术语“卤代”或“卤素”独自或作为另一取代基的部分，意指氟、氯、溴或碘原子。此外，术语例如“卤代烃基”意指包括一卤代烃基和多卤代烃基。例如，术语“卤代(C1‑C4)烃基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2‑三氟乙基、4‑氯丁基、3‑溴丙基等。
术语“酰基”意指‑C(O)R，其中R为取代或未取代的烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基或者取代或未取代的杂芳基。
术语“芳基”意指多不饱和的芳族烃取代基(hydrocarbon substituent)，其可为单环或稠合在一起(即稠合环芳基)或共价连接的多环(优选1‑3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多环，其中稠环的至少一个为芳环。术语“杂芳基”是指含有1‑4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即稠合在一起的多环，其中稠环的至少一个为杂芳环)。5,6‑稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环具有5元，另一环具有6元，且其中至少一个环是杂芳环。同样地，6,6‑稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6元，另一个环具有6元，且其中至少一个环是杂芳环。6,5‑稠环杂亚芳基是指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6元，另一个环具有5元，且其中至少一个环是杂芳环。杂芳基可通过碳或杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1‑萘基、2‑萘基、4‑联苯基、1‑吡咯基、2‑吡咯基、3‑吡咯基、3‑吡唑基、2‑咪唑基、4‑咪唑基、吡嗪基、2‑噁唑基、4‑噁唑基、2‑苯基‑4‑噁唑基、5‑噁唑基、3‑异噁唑基、4‑异噁唑基、5‑异噁唑基、2‑噻唑基、4‑噻唑基、5‑噻唑基、2‑呋喃基、3‑呋喃基、2‑噻吩基、3‑噻吩基、2‑吡啶基、3‑吡啶基、4‑吡啶基、2‑嘧啶基、4‑嘧啶基、5‑苯并噻唑基、嘌呤基、2‑苯并咪唑基、5‑吲哚基、1‑异喹啉基、5‑异喹啉基、2‑喹喔啉基、5‑喹喔啉基、3‑喹啉基和6‑喹啉基。以上提到的芳基和杂芳基环体系每一个的取代基选自下述可接受的取代基。“亚芳基”和“杂亚芳基”单独或作为另一取代基的部分，意指分别衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
术语“芳基”当与其它术语组合时(例如芳氧基、芳基硫氧基(arylthioxy)、芳基烃基(arylalkyl))包括上述定义的芳环和杂芳环两者。因此，术语“芳基烃基”意指包括其中芳基与烃基连接的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烃基包括其中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子置换的那些烃基(例如苯氧基甲基、2‑吡啶基氧基甲基、3‑(1‑萘氧基)丙基等)。
术语“氧代”意指与碳原子双键合的氧。
术语“烃基磺酰基”意指具有式‑S(O2)‑R'的部分，其中R'为上述定义的烃基。R'可具有规定数目的碳(例如“C1‑C4烃基磺酰基”)。
上述术语(例如“烃基”、“杂烃基”、“芳基”和“杂芳基”)的每一个包括指定基团的取代和未取代形式两种。下文提供每种基团类型的优选取代基。
烃基和杂烃基(包括通常称为亚烃基、烯基、杂亚烃基、杂烯基、炔基、环烃基、杂环烃基、环烯基和杂环烯基)的取代基可为选自以下的各组中的一个或多个，但不限于：‑OR'、=O、=NR'、=N‑OR'、‑NR'R''、‑SR'、‑卤素、‑SiR'R''R'''、‑OC(O)R'、‑C(O)R'、
‑CO2R'、‑CONR'R''、‑OC(O)NR'R''、‑NR''C(O)R'、‑NR'‑C(O)NR''R'''、‑NR''C(O)2R'、‑NR‑C(NR'R''R''')=NR''''、‑NR‑C(NR'R'')=NR'''、‑S(O)R'、‑S(O)2R'、‑S(O)2NR'R''、‑NRSO2R'、‑CN和‑NO2，取代基数的范围为0至(2m'+1)，其中m'是这类基团中碳原子的总数。R'、R''、R'''和R''''各自优选独立地指氢、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基(例如被1‑3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烃基、烃氧基(alkoxy)或硫代烃氧基(thioalkoxy)或芳基烃基(arylalkyl)。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个的这些基团时，则各R基团独立选自各R'、R''、R'''和R''''基团。当R'和R''与同一氮原子连接时，它们与氮原子结合在一起形成4元、5元、6元或7元环。例如，‑NR'R''包括但不限于1‑吡咯烃基和4‑吗啉基。根据取代基的以上论述，技术人员应了解术语“烃基”意包括这样的基团，其包括与氢基团以外的基团结合的碳原子，例如卤代烃基(例如‑CF3和‑CH2CF3)和酰基(例如‑C(O)CH3、‑C(O)CF3、‑C(O)CH2OCH3等)。
与对于烃基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基是多样的，选自例如：‑OR'、‑NR'R''、‑SR'、‑卤素、‑SiR'R''R'''、‑OC(O)R'、‑C(O)R'、‑CO2R'、‑CONR'R''、
‑OC(O)NR'R''、‑NR''C(O)R'、‑NR'‑C(O)NR''R'''、‑NR''C(O)2R'、‑NR‑C(NR'R''R''')=NR''''、‑NR‑C(NR'R'')=NR'''、‑S(O)R'、‑S(O)2R'、‑S(O)2NR'R''、‑NRSO2R'、‑CN、‑NO2、‑R'、‑N3、‑CH(Ph)2、氟(C1‑C4)烃氧基和氟(C1‑C4)烃基，取代基数的范围为0至芳族环体系开放化合价的总数；且其中R'、R''、R'''和R''''优选独立选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。当本发明的化合物包括多于一个R基团时，例如，当存在多于一个的这些基团时，各R基团独立选自各R'、R''、R'''和R''''基团。
两个或更多个取代基可任选连接形成芳基、杂芳基、环烃基或杂环烃基。这类所谓的成环取代基虽然不是必需的，但通常发现与环状基础结构连接。在一个实施方案中，成环取代基与基础结构的相邻成员连接。例如，与环状基础结构相邻成员连接的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基与基础结构的单一成员连接。例如，与环状基础结构的单一成员连接的两个成环取代基产生螺环结构。在又一个实施方案中，成环取代基与基础结构的非相邻成员连接。
芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可任选形成式‑T‑C(O)‑(CRR')q‑U‑的环，其中T和U独立地为‑NR‑、‑O‑、‑CRR'‑或单键，q为0‑3的整数。或者，芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可被式‑A‑(CH2)r‑B‑的取代基任选置换，其中A和B独立地为‑CRR'‑、‑O‑、‑NR‑、‑S‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑、‑S(O)2NR'‑或单键，r为1‑4的整数。如此形成的新环的单键之一可任选被双键置换。或者，芳环或杂芳环的相邻原子上的两个取代基可任选被式‑(CRR')s‑X'‑(C''R''')d‑的取代基置换，其中s和d独立地为0‑3的整数，X'为‑O‑、‑NR'‑、‑S‑、‑S(O)‑、‑S(O)2‑或‑S(O)2NR'‑。取代基R、R'、R''和R'''优选独立选自氢、取代或未取代的烃基、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。
术语“杂原子”或“环杂原子”意指氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
“取代基”意指选自以下部分的基团：
(A) ‑OH、‑NH2、‑SH、‑CN、‑CF3、‑NO2、氧代、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(B) 被选自以下的至少一个取代基取代的烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基和杂芳基：
(i) 氧代、‑OH、‑NH2、‑SH、‑CN、‑CF3、‑NO2、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(ii) 被选自以下的至少一个取代基取代的烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基和杂芳基：
(a) 氧代、‑OH、‑NH2、‑SH、‑CN、‑CF3、‑NO2、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基、未取代的杂芳基，和
(b) 被选自以下至少一个取代基取代的烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基、芳基或杂芳基：氧代、‑OH、‑NH2、‑SH、‑CN、‑CF3、‑NO2、卤素、未取代的烃基、未取代的杂烃基、未取代的环烃基、未取代的杂环烃基、未取代的芳基和未取代的杂芳基。
术语“药学上可接受的盐”意指包括根据本文所述化合物中存在的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。如果本发明的化合物含有相对酸性的官能团，则可不掺溶剂(neat)或在合适的惰性溶剂中，通过使这类化合物的中性形式与足量的所需碱接触，而获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基或镁盐或类似的盐。如果本发明的化合物含有相对碱性的官能团，则可不掺溶剂或在合适的惰性溶剂中，使这类化合物的中性形式与足量的所需酸接触，来获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括来源于无机酸的酸加成盐，无机酸如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、一氢硫酸、氢碘酸或亚磷酸等，以及来源于相对无毒的有机酸的盐，有机酸如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯基磺酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、甲磺酸等。还包括氨基酸的盐(例如精氨酸盐等)和有机酸(诸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸(galactunoric acid))的盐等。本发明的某些具体化合物含有允许化合物转化成碱加成盐或酸加成盐的碱性官能团和酸性官能团两者。
本文所述化合物可作为盐(例如与药学上可接受的酸)存在。本发明包括这类盐。这类盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、酒石酸盐(例如(+)‑酒石酸盐、(‑)‑酒石酸盐或其混合物包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐，以及与氨基酸(例如谷氨酸)的盐。这些盐可通过本领域技术人员已知方法制备。
通过使盐与碱或酸接触，按常规方法分离母体化合物，优选使化合物的中性形式再生。在某些物理性质(例如极性溶剂的溶解度)方面，化合物的母体形式不同于各种盐形式。
除盐形式以外，本发明还提供呈前药形式的化合物。本文所述化合物的前药为在生理条件下容易进行化学变化以提供本发明化合物的那些化合物。此外，前药可在离体环境中通过化学或生物化学方法转化成本发明的化合物。例如，当置于具有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂库中时，前药可慢慢转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。总的来说，溶剂化形式与非溶剂化形式等效，并包括在本发明的范围内。本发明的某些化合物可以多晶或无定形形式存在。总的来说，所有的物理形式对于本发明的预期用途是等效的，且旨在落入本发明的范围。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋体、非对映体、互变异构体、几何异构体和各个异构体均包括在本发明的范围内。
本发明的化合物还可在构成这类化合物的一个或多个原子处含有原子同位素的非天然部分。例如，化合物可用放射性同位素标记，例如氚(3H)、碘‑125 (125I)或碳‑14 (14C)。本发明化合物的所有同位素变体，不论放射性与否，都包括在本发明的范围内。
符号“”表示化学部分与分子式或化学式的其余部分的连接点。
在肽的情况下，本文所用“类似物”是指相对于母体化合物具有氨基酸插入、缺失和/或取代的化合物。类似物可具有优良的稳定性、溶解度、功效、半衰期等。在一些实施方案中，类似物是与母体化合物具有以下序列同一性的化合物：至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%。在一个实施方案中，母体化合物为毒蜥外泌肽‑4。
“衍生物”定义为具有母体或其类似物的氨基酸序列、但其氨基酸侧基、α‑碳原子、末端氨基或末端羧酸基团的一个或多个还具有化学修饰的分子。化学修饰包括但不限于添加化学部分、产生新的化学键和脱去化学部分。氨基酸侧基上的修饰包括而不限于赖氨酸ε‑氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N‑烷基化(alkylation)；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰氨基化。末端氨基的修饰包括而不限于脱氨基、N‑低级烃基、N‑二‑低级烃基、受约束的烃基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基(adamantyl))和N‑酰基修饰。末端羧基的修饰包括而不限于酰胺、低级烃基酰胺、受约束的烃基(例如支链、环状、稠合、金刚烷基)、烃基、二烃基酰胺和低级烃基酯修饰。此外，一个或多个侧基或端基可用具有普通技术的合成化学师已知的保护基保护。氨基酸的α‑碳可被一甲基化的或二甲基化。
激动剂和类似物的衍生物也包括在所提供的方法内，其中一个或多个特定位点上的各氨基酸的立体化学结构可从(L)/S反转成(D)/R。所提供的方法还包括通过Asn、Ser和/或Thr残基的糖基化进行修饰的激动剂和类似物。
在比较两个或更多个核酸或肽序列的情况下，术语“同一性”、“序列同一性”等是指是相同的两个或更多个序列或亚序列，或者具有相同特定百分比的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或亚序列(即在比较窗或指定区内比较和比对最大一致性时，在规定区域内约50%同一性，优选50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)，如采用本领域已知序列比较算法测量的，例如BLAST或BLAST 2.0。该定义包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的序列，例如多态变体或等位基因变体及人工变体。在优选的算法中，按照本领域已知方法计算出空位等。对于序列比较，通常一个序列用作参比序列，将试验序列与之进行比较。当采用序列比较算法，将试验序列和参比序列键入计算机，必要时指定亚序列坐标(subsequence coordinate)，并指定序列算法程序参数。优选可使用默认程序参数，或者可指定备选参数。然后根据程序参数，序列比较算法计算出试验序列相对于参比序列的百分比序列同一性。可进行序列的最佳比对用于比较，例如通过局部同源性算法(Smith和Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981))；通过同源性比对算法(Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970))；通过相似性搜索方法(Pearson和Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci., USA 85:2444 (1988))；通过这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，载于Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)的计算机执行，或者通过手动比对和目视检查。参见例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等编辑，1995增刊))。适于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的优选实例包括BLAST和BLAST 2.0算法，该算法描述于Altschul等，Nuci. Acids Res., 25:3389‑3402 (1977)和Altschul等, J. Mol. Biol. 215:403‑410 (1990)。采用本领域已知的BLAST和BLAST 2.0来测定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件是可公开获自国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)网站。该算法包括先通过鉴定查询序列中长度W的短字码来鉴定高评分序列对(high scoring sequence pair，HSP)，当与数据库序列中的相同长度字码比对时，所述查询序列符合或满足某一正值的阈值分数T。T称为邻域字码分数阈值(neighborhood word score threshold) (Altschul等，同上)。这些初始邻域字码命中(word hits)用作开始检索以查找包含它们的较长HSP的种子。字码命中然后沿各个序列的两个方向延伸，直到可以增加累积比对分数为止。例如对于核苷酸序列，累积分数采用参数M (匹配残基对的奖励分数；总是> 0)和N (错配残基的处罚分数；总是< 0)计算。对于氨基酸序列，采用评分矩阵计算累积分数。各方向上字码命中的延伸在以下情况下终止：累积比对分数从其获得的最大值下降量X；累积分数由于一个或多个负得分残基比对的累积而导致变成零或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)将字长(W) 11、期望(E) 10、M=5、N=‑4和两条链的比较用作默认。对于氨基酸序列，BLASTP程序将字长3、期望(E) 10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))比对(B) 50、期望(E) 10、M=5、N=‑4和两条链比较用作默认。
为了测定2个氨基酸序列或2个核酸的百分比同一性或相似性，出于最佳比较目的对序列进行比对(例如可将空位引入第一氨基酸或核酸序列的序列中，用于与第二氨基酸或核酸序列进行最佳比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被第二序列相应位置的相同或类似的氨基酸残基或核苷酸占据时，则该位置上的分子是相同或相似的。2个序列的百分比同一性或相似性是该序列共有的相同或相似位置数的函数(即%同一性 = 相同位置数/位置总数(例如重叠位置) x 100)。2个氨基酸的相似性可通过本领域已知的各种方法评价。例如非极性中性残基(例如Ala、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Trp、Val)可视为类似，继而酸性带电荷极性(例如Glu、Asp)、碱性带电荷极性(例如Arg、His、Lys)和中性极性(例如Asn、Gln、Ser、Thr、Tyr)残基各可视为类似。
可容易地计算同一性和相似性两者。例如，在计算百分比同一性时，只可计算精确匹配，而且相对于局部比对，可进行全局比对。测定序列间的同一性或相似性的常用方法包括例如公开于Carillo等，1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073的方法。设计测定同一性的示例性方法以得到所测序列间的最大匹配。市售计算机程序中也提供测定同一性和相似性的示例性方法。用于2个序列比较的数学算法的具体实例是Karlin等，1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264‑2268的算法，以及例如Karlin等，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873‑5877的改进算法。这类算法被并入Altschul等，1990, J. Mol. Biol. 215:403‑410的NBLAST和XBLAST程序中。为了获得用于比较目的的具有空位的比对(gapped alignments)，可按Altschul等，1997, Nucleic Acids Res. 25:3389‑3402所述应用Gapped BLAST。或者，可采用检测分子间的远缘关系的PSI‑Blast进行重复检索。当应用BLAST、Gapped BLAST和PSI‑Blast程序时，可使用本领域已知的各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。此外，可采用FASTA方法(Atschul等，1990，同上)。用于序列比较的数学算法的另一个具体实例是Myers等，1988，CABIOS 4:11‑17的算法。这类算法被并入ALIGN程序(2.0版)中，其是GCG序列比对软件包的部分(Devereux等，1984, Nucleic Acids Res. 12(1)：387)。可通过用Vector NTI® (Invitrogen；Carlsbad CA)中的AlignX®模块进行分析，来测定百分比同一性。
“患者”是指温血动物。患者包括人；陪伴动物(例如狗、猫)；农场动物(例如牛、马、绵羊、猪、山羊)；野生动物等。在一个实施方案中，患者是人。在一个实施方案中，患者是患有2型糖尿病的人。在一个实施方案中，患者是患有2型糖尿病的胖人。
术语“肽”和“多肽”在本文所述肽缀合物的组分的情况下是同义词。术语“肽”在习惯意义上是指通过酰胺键连接的氨基酸的聚合物。术语“脱氨基酸”、“des‑AA”、“desLys”等是指给定氨基酸不存在。氨基酸“不存在”意指之前在所述不存在氨基酸的N端和C端侧连接的残基(或官能团)键合在一起。
术语“侧链替代物”等是指模拟天然的生理氨基酸的侧链部分的化学部分。
应注意在整个申请书中，备选物以马库什(Markush)基团书写，例如含有多于一个可能氨基酸的各个氨基酸位置。特别预期的是，应分别考虑马库什基团的每个成员，从而包括另一个实施方案，且马库什基团不意味着作为单一单元。
“GLP‑1受体激动剂化合物”是指当通过本领域已知方法评价时，诱导毒蜥外泌肽参比肽(例如毒蜥外泌肽‑4)或GLP‑1(7‑37)参比肽的生物活性的化合物，所述方法例如受体结合研究或体内血糖测定，例如以下文献描述的：Hargrove等，2007, Regulatory Peptides, 141:113‑119，该公开内容通过引用结合到本文中。GLP‑1受体激动剂化合物包括例如天然毒蜥外泌肽、毒蜥外泌肽类似物、天然GLP‑1、GLP‑1类似物、GLP‑1(7‑37)和GLP‑1(7‑37)类似物。
术语“毒蜥外泌肽”包括本文所述的天然存在的毒蜥外泌肽(或天然存在的毒蜥外泌肽的合成形式)。毒蜥外泌肽包括该分子的酰胺化形式、酸形式、药学上可接受的盐形式和任何其它生理活性形式。在一个实施方案中，术语毒蜥外泌肽可与术语“毒蜥外泌肽激动剂”互换使用。没有相反的明确指示时，预期本文所述所有肽呈酰胺化形式和游离酸形式。
“毒蜥外泌肽类似物”是指肽；含有肽模拟物、氨基酸取代和/或其它修饰的肽；含有本文所述的N端构象受约束的化合物和/或其它化学部分的肽；或当通过本领域已知方法评价时，诱导类似于毒蜥外泌肽参比肽(例如毒蜥外泌肽‑4)的生物活性的其它化合物，所述方法例如受体结合测定或体内血糖测定，例如以下文献描述的：Hargrove等，2007, Regulatory Peptides 141:113‑119，该公开内容通过引用结合到本文中并用于所有目的。优选在这类受体结合测定中，毒蜥外泌肽类似物以小于1 µM的亲和力、小于5 nM的亲和力、小于1 nM的亲和力或小于0.1 nM的亲和力结合。在一个实施方案中，术语“毒蜥外泌肽类似物”是指当与毒蜥外泌肽‑4的氨基酸序列比较时，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代、插入、缺失或者其两种或更多种组合的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，术语毒蜥外泌肽类似物是毒蜥外泌肽‑4类似物。在其它实施方案中，术语“毒蜥外泌肽类似物”是指与毒蜥外泌肽‑4的氨基酸序列具有至少85%、至少88%、至少90%、至少93%、至少95%或至少98%序列同一性的肽。毒蜥外泌肽类似物包括该分子的酰胺化形式、酸形式、药学上可接受的盐形式和任何其它生理活性形式。在一个实施方案中，术语毒蜥外泌肽类似物可与术语“毒蜥外泌肽激动剂类似物”互换使用。
“GLP‑1(7‑37)类似物”是指肽；含有肽模拟物和/或其它修饰的肽；含有本文所述的N端构象受约束的化合物和/或其它化学部分的肽；或当通过本领域已知方法评价时，诱导类似于GLP‑1(7‑37)的生物活性的其它化合物，所述方法例如受体结合测定或体内血糖测定，例如以下文献描述的：Hargrove等，2007 (同上)。在一个实施方案中，术语“GLP‑1(7‑37)类似物”是指当与GLP‑1(7‑37)的氨基酸序列比较时，具有1、2、3、4、5、6、7、或8个氨基酸取代、插入、缺失或者其两种或更多种组合的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，GLP‑1(7‑37)类似物是GLP‑1(7‑36)。GLP‑1(7‑37)类似物包括该分子的酰胺化形式、酸形式、药学上可接受的盐形式和任何其它生理活性形式。
本公开内容提供与式(I)具有至少50%氨基酸序列同一性的含苯甲酰胺的肽化合物：

其中Xaa取代基如本文定义，且其中式(I)的一个或多个连续氨基酸残基被1‑6个苯甲酰胺基团取代。设计苯甲酰胺基团，以模拟式(I)的生理氨基酸(例如Ala、Cys、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr)侧链的一种或多种性质(例如形状、电荷分布、体积(bulk)等)。侧链替代部分与形成苯甲酰胺元件的苯环连接。在一个实施方案中，式(I)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续氨基酸残基被本文所述苯甲酰胺基团Y1取代。在一个实施方案中，式(I)的4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸残基被本文所述苯甲酰胺基团Y1取代。在一个实施方案中，式(I)的5、6、7、8或9个连续氨基酸残基被本文所述苯甲酰胺基团Y1取代。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少75%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(I)具有至少95%序列同一性。
式(I)中，Xaa1为His、脱氨基His，或

其中R4为键、取代或未取代的亚链烷基(alkylenyl)或者取代或未取代的亚链烯基。在一个实施方案中，R4为键。在一个实施方案中，R4为任选被烃基、羟基或羧基取代的C1、C2、C3或C4亚链烃基。在一个实施方案中，R4为亚甲基。在一个实施方案中，R4为被一个或多个取代基R5取代的亚乙基(ethylenyl)，其中R5独立地为烃基、羟基或羧基。在一个实施方案中，R4为未取代亚链烯基，优选亚乙烯基(ethenylenyl)。在一个实施方案中，Xaa1具有下列结构：

在一个实施方案中，Xaa1为His或脱氨基His。
式(I)中，Xaa2为Gly、Ala、D‑Ala或Aib。在一个实施方案中，Xaa2为Gly、d‑Ala或Ala。在一个实施方案中，Xaa2为Gly或Ala。在一个实施方案中，Xaa2为Gly。
式(I)中，Xaa3为Gly、Ala、D‑Ala、Aib、Glu、Pro或选自以下的部分：

在一个实施方案中，Xaa3为Gly、Ala、Glu或Pro。在一个实施方案中，Xaa3为Gly或Pro。在一个实施方案中，Xaa3为Gly。在一个实施方案中，Xaa3为Pro。
式(I)中，Xaa14为Met或Leu。在一个实施方案中，Xaa14为Met。在一个实施方案中，Xaa14为Leu。
式(I)中，Xaa25为Trp或Phe。在一个实施方案中，Xaa25为Trp。在一个实施方案中，Xaa25为Phe。
式(I)中，Z为‑OH、‑NH2、Gly Gly‑OH、Gly Gly‑NH2、Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑OH或Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser‑NH2。在一个实施方案中，Z为‑OH、‑NH2、Gly Gly‑OH或Gly Gly‑NH2。在一个实施方案中，Z为‑OH或‑NH2。在一个实施方案中，Z为‑NH2。
式(I)中，Y1为：

在Y1所表示的结构中，X为键、氧、硫、‑NH‑、‑NR’‑、取代或未取代的亚链烷基(alkylenyl)或者取代或未取代的亚链烯基。在一个实施方案中，X为氧或C1或C2亚链烯基。在一个实施方案中，X为氧。
在Y1所表示的结构中，R’为取代或未取代的烃基。在一个实施方案中，R’为C1、C2或C3未取代、直链或支链烃基。
在Y1所表示的结构中，n为0‑6的整数。在一个实施方案中，n为1、2或3。在一个实施方案中，n为1或2。
在Y1所表示的结构中，R1a为氢、卤素、羟基、硫醇基、羧基、取代或未取代的甲酰氨基、氨甲酰基、取代或未取代的氨基、取代或未取代的亚氨基、取代或未取代的脲、硝基、亚硝基、取代或未取代的直链或支链烃基(alkyl)、取代或未取代的烯基(alkenyl)、取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烃氧基、取代或未取代的烯氧基、取代或未取代的环烃基氧基、取代或未取代的杂烃基氧基、取代或未取代的杂环烃基氧基、取代或未取代的芳氧基、取代或未取代的杂芳氧基、取代或未取代的烃基硫醇基、取代或未取代的烯基硫醇基、取代或未取代的环烃基硫醇基、取代或未取代的杂烃基硫醇基、取代或未取代的杂环烃基硫醇基、取代或未取代的芳基硫醇基、取代或未取代的杂芳基硫醇基、取代或未取代的烃基亚磺酰基、取代或未取代的烯基亚磺酰基、取代或未取代的环烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂烃基亚磺酰基、取代或未取代的杂环烃基亚磺酰基、取代或未取代的芳基亚磺酰基、取代或未取代的杂芳基亚磺酰基、取代或未取代的烃基磺酰基、取代或未取代的烯基磺酰基、取代或未取代的环烃基磺酰基、取代或未取代的杂烃基磺酰基、取代或未取代的杂环烃基磺酰基、取代或未取代的芳基磺酰基或者取代或未取代的杂芳基磺酰基。在一个实施方案中，R1a为氢、卤素、羟基、硫醇基、羧基、取代或未取代的直链或支链C1、C2、C3、C4、C5或C6烃基；取代或未取代的环烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。在一个实施方案中，R1a为未取代的直链或支链C1、C2、C3或C4烃基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在一个实施方案中，R1a为未取代的直链或支链C1、C2或C3烃基或者未取代的芳基。在一个实施方案中，R1a未被取代。
在Y1所表示的结构中，S为1、2、3、4、5或6的整数。在一个实施方案中，S为2、3或4的整数。在一个实施方案中，S为3。
在一些实施方案中，本发明的化合物的上述各个取代的基团被至少一个取代基取代。更具体地讲，在一些实施方案中，上述各个取代的烃基、取代的杂烃基、取代的环烃基、取代的杂环烃基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烃基、取代的杂亚烃基、取代的环亚烃基、取代的杂环亚烃基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基被至少一个取代基取代。
在上述化合物的其它实施方案中，各个取代或未取代的烃基为取代或未取代的C1‑C20烃基，各个取代或未取代的杂烃基为取代或未取代的2‑20元杂烃基，各个取代或未取代的环烃基为取代或未取代的C4‑C8环烃基，各个取代或未取代的杂环烃基为取代或未取代的4‑8元杂环烃基，各个取代或未取代的亚烃基为取代或未取代的C1‑C20亚烃基，各个取代或未取代的杂亚烃基为取代或未取代的2‑20元杂亚烃基，各个取代或未取代的亚环烃基为取代或未取代的C4‑C8环亚烃基，而各个取代或未取代的杂环亚烃基为取代或未取代的4‑8元杂环亚烃基。
或者，各个取代或未取代的烃基为取代或未取代的C1‑C8烃基，各个取代或未取代的杂烃基为取代或未取代的2‑8元杂烃基，各个取代或未取代的环烃基为取代或未取代的C5‑C7环烃基，各个取代或未取代的杂环烃基为取代或未取代的5‑7元杂环烃基，各个取代或未取代的亚烃基为取代或未取代的C1‑C8亚烃基，各个取代或未取代的杂亚烃基为取代或未取代的2‑8元杂亚烃基，各个取代或未取代的环亚烃基为取代或未取代的C5‑C7环亚烃基，而各个取代或未取代的杂环亚烃基为取代或未取代的5‑7元杂环亚烃基。
在一个实施方案中，式(I)的含苯甲酰胺的肽化合物更特别地用下式(II)的含苯甲酰胺的肽化合物表示：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25、Y1和Z具有式(I)肽化合物所示相同含义，且其中Xaa10为Leu或不存在(优选Leu)；Xaa11为Ser或不存在(优选Ser)；Xaa12为Lys或不存在(优选Lys)；Xaa13为Gln或不存在(优选Gln)；Xaa15为Glu或不存在(优选Glu)；Xaa16为Glu或Ala (优选Glu)；Xaa17为Glu或Ala (优选Glu)；Xaa19为Val或不存在(优选Val)；Xaa20为Arg或不存在(优选Arg)；Xaa21为Leu或不存在(优选Leu)。
本公开内容还提供与式(II)具有至少75%序列同一性的含苯甲酰胺的肽化合物。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(II)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(II)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(II)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(II)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(II)具有至少95%序列同一性。
落入式(II)肽化合物范围内的代表性化合物包括化合物编号12、13、14和15。
在一个实施方案中，式(I)的含苯甲酰胺的肽化合物更特别地由下式(III)的含苯甲酰胺的肽化合物表示：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z具有式(I)肽化合物所示相同含义。在式(III)化合物中，Xaa6‑Xaa14总的合在一起选自：


。技术人员应了解的是，为了使Xaa6‑Xaa14总的合在一起以表示与化学部分Y1结合的这些氨基酸残基，Xaa6‑Xaa14所表示的氨基酸残基中的一些将不存在于化合物中。换句话说，Xaa6至Xaa14的每一个将不对应于一个氨基酸残基或Y1，因此将不存在于化合物中。
对于式(III)化合物，Y1具有对于式(I)化合物所定义的相同含义；Xaa15为Glu或不存在(优选Glu)；Xaa16为Glu或Ala (优选Glu)；Xaa17为Glu或Ala (优选Glu)。
本公开内容还提供与式(III)具有至少75%序列同一性的含苯甲酰胺的肽化合物。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(III)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(III)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(III)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(III)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，含苯甲酰胺的肽化合物与式(III)具有至少95%序列同一性。
落入式(III)的肽化合物范围内的代表性化合物包括化合物编号16、17和18。
下表1中示出了本文所述示例性化合物。照本领域的惯例并如本文所用，小写一字母氨基酸代码(例如“a”)表示D‑氨基酸(而序列表中的“a”指D‑Ala)。符号“‑NH‑”、“‑NH2”等是指具有一个或多个连接的氢的胺氮，符号“N”作为肽的部分而不是桥头的部分，是指Asn。本文所用“桥头”在习惯意义上是指分子(例如肽)中桥(例如亚链烯基桥)的连接点。术语“H”当为肽的部分时是指His，而“H”当用于术语“‑NH‑”、“‑NH2”等时是指氢。
表1


另一方面，提供受约束的烯烃肽化合物，其包含与式(IV)的结构具有至少50%序列同一性的氨基酸序列：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14、Xaa25和Z具有与式(I)相同的定义，且其中至少一对氨基酸残基通过亚链烯基桥或亚链烷基(alkylenyl)桥连接。在一个实施方案中，至少一对氨基酸残基通过亚链烯基桥连接。在一个实施方案中，通过亚链烯基桥连接的氨基酸残基被2、3或4个氨基酸残基分隔开；优选被3个氨基酸残基分隔开。术语“受约束的GLP‑1受体激动剂”、“受约束的肽化合物”、“受约束的化合物”、“受约束的烯烃化合物”等是指这样的肽化合物，其中至少一对残基已经被取代，使得亚链烯基桥或亚链烷基(alkylenyl)桥连接该对残基。本公开内容还提供与式(IV)具有至少75%序列同一性的受约束的烯烃肽化合物。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(IV)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(IV)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(IV)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，约束的受约束的烯烃肽化合物与式(IV)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(IV)具有至少95%序列同一性。
式(IV)中，亚链烯基桥用下式表示：

其中m和p各自独立地为1、2、3、4、5或6；优选1、2或3；更优选1或2。在某些实施方案中，存在单个亚链烯基桥。在某些实施方案中，存在多个，例如2、3或甚至4个亚链烯基桥。
在某些实施方案中，亚链烯基桥连接通过亚链烯基桥连接的氨基酸对的骨架Cα原子。在某些实施方案中，亚链烯基桥连接一个残基的骨架Nα与另一个氨基酸的骨架Cα碳。在某些实施方案中，亚链烯基桥连接一个残基的骨架Nα与另一个氨基酸的骨架Nα。在某些实施方案中，如本领域已知，亚链烯基桥还原形成亚链烷基(alkylenyl)桥。
在一个实施方案中，式(IV)的受约束的烯烃肽化合物更特别地由下式(V)的受约束的烯烃肽化合物表示：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14和Z具有式(I)所示相同含义，且其中Y2为：

其中Xaa25为Phe或Trp；a为1、2或3；b为0、1或2；和。在一个实施方案中，Xaa25为Phe。在一个实施方案中，Xaa25为Trp。在一个实施方案中，a为1或2。在一个实施方案中，a为1。在一个实施方案中，b为0或1。在一个实施方案中，b为1。在一个实施方案中，b为0。如果b为0，则(CH2)b为单键，其中(CH2)b的左侧的碳原子通过单键与(CH2)b的右侧的碳原子连接。为了清楚起见，Y2中确定的氨基酸仅为Xaa25、Leu和Lys；所有其它的字母是指氮、氧和碳。
本公开内容还提供与式(V)具有至少75%序列同一性的受约束的烯烃肽化合物。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(V)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(V)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(V)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(V)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(V)具有至少95%序列同一性。
落入式(V)的受约束的烯烃肽化合物范围的代表性化合物包括化合物编号22、23、24、25、26和27。
在一个实施方案中，式(IV)的受约束的烯烃肽化合物更特别地用下列式(VI)的受约束的烯烃肽化合物表示：

其中Xaa1、Xaa2、Xaa3、Xaa14和Z具有式(I)所示相同含义，其中Y3为：

其中Xaa25为Phe或Trp；a为1、2或3；b为0、1或2；和。在一个实施方案中，Xaa25为Phe。在一个实施方案中，Xaa25为Trp。在一个实施方案中，a为1或2。在一个实施方案中，b为0或1。在一个实施方案中，b为0。如果b为0，则(CH2)b为单键，其中(CH2)b左侧的碳原子通过单键与(CH2)b右侧的碳原子连接。为了清楚起见，Y3中确定的氨基酸仅为Xaa25、Leu和Lys；所有其它的字母是指氮、氧和碳；只是具有与式(I)所示相同定义的Z除外。
本公开内容还提供与式(VI)具有至少75%序列同一性的受约束的烯烃肽化合物。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(VI)具有至少80%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(VI)具有至少85%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(VI)具有至少88%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(VI)具有至少92%序列同一性。在一个实施方案中，受约束的烯烃肽化合物与式(VI)具有至少95%序列同一性。
落入式(VI)的受约束的烯烃肽化合物范围的代表性化合物包括化合物编号34、35和36。
下表2中提供本文所述式(IV)、(V)和(VI)的示例性肽化合物。要理解术语“N”当表示本文所述桥头时是指氮。还要理解符号“NH2‑H‑"是指具有N端酰胺官能团的N端His。
表2

在某些实施方案中，本文所述肽化合物与1、2或3个聚乙二醇聚合物连接。在一个实施方案中，化合物与一个聚乙二醇连接。聚乙二醇的分子量可为约200道尔顿‑约80,000道尔顿；约5,000、约10,000道尔顿‑约60,000道尔顿；约10,000道尔顿‑约50,000道尔顿；或约15,000道尔顿‑约40,000道尔顿。聚乙二醇可为直链或支链。
在某些实施方案中，化合物与一个或两个聚乙二醇连接，其中聚乙二醇与亲脂部分进一步连接。在一个实施方案中，聚乙二醇的分子量可为约200‑约7,000道尔顿或约500‑约5,000道尔顿。亲脂部分可以是烃基(例如C1‑20烃基、C1‑10烃基、C1‑6烃基、C1‑4烃基)、脂肪酸(例如C4‑28脂肪酸链、C8‑24脂肪酸链、C10‑20脂肪酸链)、胆固醇基、金刚烷基等。烃基可为直链或支链，优选直链。在一个实施方案中，脂肪酸是乙酰化脂肪酸或酯化脂肪酸。‑(聚乙二醇)‑(亲脂部分)可在C端氨基酸残基、N端氨基酸残基、内部氨基酸残基(例如内部Lys氨基酸残基)或其组合(例如化合物在N端和C端氨基酸残基处连接)处与化合物连接。
在某些实施方案中，化合物与多聚氨基酸连接。示例性的多聚氨基酸包括聚赖氨酸、聚天冬氨酸、聚丝氨酸、聚谷氨酸等。多聚氨基酸可呈D或L型，优选L型。多聚氨基酸可包含1‑12个氨基酸残基；2‑10个氨基酸残基；或2‑6个氨基酸残基。
在某些实施方案中，化合物与脂肪酸连接。脂肪酸可以是C4‑C28脂肪酸链、C8‑C24脂肪酸链或C10‑C20脂肪酸链。在一个实施方案中，脂肪酸是乙酰化脂肪酸。在一个实施方案中，脂肪酸是酯化脂肪酸。
在某些实施方案中，化合物与白蛋白连接。白蛋白可以是重组白蛋白、血清白蛋白或重组血清白蛋白。在另一个实施方案中，化合物与白蛋白‑脂肪酸(即与脂肪酸连接的白蛋白)连接。
在一个实施方案中，化合物与免疫球蛋白或免疫球蛋白Fc区连接。免疫球蛋白可以是IgG、IgE、IgA、IgD或IgM。在一个实施方案中，化合物与IgG Fc区或IgM Fc区连接。免疫球蛋白Fc区是：(i)免疫球蛋白的重链恒定区2 (CH2)；(ii)免疫球蛋白的重链恒定区3 (CH3)；或(iii)免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和3(CH3)两者。免疫球蛋白Fc区还可在重链恒定区包含铰链区。可与毒蜥外泌肽类似物肽连接的免疫球蛋白Fc区的其它实施方案描述于描述于WO 2008/082274，该公开内容通过引用结合到本文中。
如果本文所述化合物与一个或多个聚合物(例如本文所述聚合物)共价连接，则可使用本领域已知的任何连接基团。连接基团可包含适于将肽与聚合物连接的任何化学基团。或者，化合物可在没有任何连接基团的情况下与聚合物直接连接。示例性连接基团包括氨基酸、马来酰亚胺基团、二羧酸基团、琥珀酰亚胺基团或其两个或更多个的组合。用于连接肽与一个或多个聚合物的方法是本领域已知的，描述于例如美国专利号6,329,336；美国专利号6,423,685；美国专利号6,924,264；WO 2005/077072、WO 2007/022123、WO 2007/053946；WO 2008/058461以及WO 2008/082274，所述专利的公开内容通过引用结合到本文中。
肽合成的通用方法。本文所述化合物的某些肽元件可采用本领域已知的生物学、化学和/或重组DNA技术制备。示例性的肽合成方法描述于本文和美国专利号6,872,700、WO 2007/139941、WO 2007/140284、WO 2008/082274、WO 2009/011544以及美国公布号2007/0238669，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。本文示出了用于制备化合物其它方法，和/或用于制备化合物的其它方法是本领域已知的。
例如可采用标准固相肽合成技术，例如自动化或半自动化肽合成仪，来制备本文所述化合物的肽组分。通常，采用这类技术，在室温下，在碱(例如二异丙基乙胺等)存在下，在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺、1‑羟基苯并‑三唑等)存在时，在惰性溶剂(例如二甲基甲酰胺、N‑甲基吡咯烷酮、二氯甲烷等)中使α‑N‑氨甲酰基保护的氨基酸和与树脂上的生长肽链连接的氨基酸偶联。使用试剂(例如三氟乙酸、哌啶等)，从所得肽‑树脂脱去α‑N‑氨甲酰基保护性基团，并且用待加入肽链的下一个所需的N‑保护的氨基酸重复偶联反应。合适的N‑保护性基团是本领域众所周知的，例如叔丁氧基羰基(tBoc)、芴基甲氧羰基(Fmoc)等。用于肽合成仪的溶剂、氨基酸衍生物和4‑甲基二苯甲基‑胺树脂可购自不同市售来源，包括例如Applied Biosystems Inc. (Foster City，Calif.)。
对于化学合成固相肽合成可用于肽缀合物，因为固相合成总的来说是直接方法，具有优良的工业规模可伸缩性，一般与相对长的肽缀合物相容。可利用NMP/HOBt (选项1)系统和带有加帽的tBoc或Fmoc化学法(参见Applied Biosystems ABI 430A肽合成仪的用户手册，1.3B版，1988年7月1日，第6节，第49‑70页，Applied Biosystems，Inc.，Foster City，Calif.)，用自动肽合成仪(430A型，Applied Biosystems Inc.，Foster City，Calif.)进行固相肽合成。Boc‑肽‑树脂可用HF裂解(‑5℃至0℃，1小时)。肽可用水和乙酸交替从树脂上提取，将滤液冻干。可按照标准方法(例如Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems, Inc., 1990, 第6‑12页)裂解Fmoc‑肽树脂。肽还可采用Advanced Chem Tech Synthesizer (MPS 350型，Louisville，Ky.)装配。
还可采用本领域已知方法，例如Sambrook等，1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版，Cold Spring Harbor，利用重组DNA技术制备本文所述化合物。非肽化合物可通过本领域已知方法制备。例如，含磷酸(phosphate)的氨基酸和含有这类氨基酸的肽可采用本领域已知方法制备，例如描述于Bartlett等，1986, Biorg. Chem., 14:356‑377。
纯化。肽可采用例如Waters Delta Prep 3000系统，通过RP‑HPLC (制备型和分析型)来纯化。C4、C8或C18制备柱(10 μ，2.2X25 cm；Vydac，Hesperia，Calif.)可用来分离肽，并且可采用C4、C8或C18分析柱(5μ，0.46X25 cm；Vydac)来测定纯度。溶剂(A=0.1% TFA/水，B=0.1% TFA/CH3CN)可以1.0 ml/分钟的流速递送至分析柱，以15 ml/分钟递送至制备柱。氨基酸分析可在Waters Pico Tag系统中进行，并应用Maxima程序处理。可通过蒸气相酸解(115℃，20‑24小时)使肽水解。水解产物可衍生化，并通过标准方法分析。参见例如Cohen等，1989, The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, 第11‑52页，Millipore Corporation，Milford，MA)。快速原子轰击分析可通过M‑Scan，Incorporated (West Chester，Pa.)进行。质量校准可使用碘化铯或碘化铯/甘油进行。可在Applied Biosystems Bio‑Ion 20质谱仪中进行使用飞行时间检测的等离子体解吸电离分析(Plasma desorption ionization analysis)。
用于固相合成的试剂。可用于本文所述固相合成方法的具有侧链替代部分、游离羧酸和硝基部分的试剂(即合成的结构单元)可通过本领域已知和/或本文描述的各种合成方法获得。
例如，如流程1所示，可使3‑羟基‑4‑硝基苯甲酸甲酯与醇反应，得到可用于合成本文所述化合物的试剂。可通过改变流程1反应中的醇的取代基R，将侧链替代部分引入试剂中。实施例提供示例性的合成。
流程1

含苯甲酰胺的肽化合物的合成。含苯甲酰胺的化合物的固相合成适宜在树脂(例如Rink酰胺树脂)中进行。参照下列流程2，新生树脂结合的肽S1的游离胺与合适的取代硝基苯基苯甲酸酯S2的羧基反应，导致树脂结合的肽3中末端苯甲酰胺基部分的共价引入。
流程2

出乎意料的是，发现S3的亚硝基可容易地还原到胺的水平，从而形成游离胺用于随后的固相反应。
例如，在流程2中，引入其它合适的取代硝基苯基苯甲酸酯，从而形成双苯甲酰胺基化合物。术语“聚苯甲酰胺”、“聚苯甲酰胺基”等在常规意义上是指通过酰胺键连接的多个取代苯基部分。术语“双苯甲酰胺”、“三苯甲酰胺”等在常规意义上是指由此键合的特定数目的苯基部分。在将一个或多个苯甲酰胺(聚苯甲酰胺)化学特征引入本文所述化合物中后，可在裂解和纯化前引入N端肽序列。
含苯甲酰胺的化合物的合成。第一方面，提供用于取代的含苯甲酰胺的肽化合物固相合成的方法。所述方法包括使具有游离胺的树脂结合试剂与具有侧链替代部分、游离羧酸和硝基部分的取代苯基反应的步骤，从而形成树脂结合的取代苯甲酰胺基。还原硝基部分以形成游离胺，从而形成具有游离胺的树脂结合的取代苯甲酰胺基。术语“含苯甲酰胺的化合物”、“含苯甲酰胺的肽”等是指具有通过酰胺键与取代苯基共价键合的肽组分的本文所述化合物。两个或更多个苯甲酰胺可以是连续的，并通过酰胺键连接，这种组合进而可通过一个或多个酰胺键与一个或多个肽元件连接。例如，如果苯甲酰胺(聚苯甲酰胺)与肽的N端或C端残基连接，则单个酰胺键连接肽元件和苯甲酰胺(聚苯甲酰胺)。或者，如果苯甲酰胺(聚苯甲酰胺)置换肽元件的一个或多个连续的内部(即不是N端也不是C端)残基，则苯甲酰胺(聚苯甲酰胺)进而通过酰胺键与肽的N端和C端氨基酸残基连接。
在某些实施方案中，重复之前的步骤以向树脂结合的取代苯甲酰胺基添加一个或多个额外的取代苯基部分，从而形成具有游离胺的延伸的树脂结合的取代苯甲酰胺基。
在某些实施方案中，使苯甲酰胺基部分的游离胺，单独或作为延伸的树脂结合的取代苯甲酰胺基的部分，与额外的氨基酸反应，从而形成含取代的苯甲酰胺的化合物。
在某些实施方案中，树脂结合试剂是与所述树脂结合的伯(即“游离”)胺部分。因此，在这种情况下，苯甲酰胺与所得含苯甲酰胺的肽的C端缀合。
在一个实施方案中，使聚苯甲酰胺试剂与具有游离胺的树脂结合试剂反应。聚苯甲酰胺试剂具有适于与具有游离胺和硝基的树脂结合试剂反应的羧基。聚苯甲酰胺试剂由通过酰胺键连接的苯基形成，各苯基具有侧链替代部分。在将聚苯甲酰胺试剂加入树脂后，可如上所述进行合成。
进一步对于任一种本文所述的合成方法而言，要了解，采用从树脂上裂解和后续纯化，得到本文所述化合物。
本文所述肽化合物和包含肽化合物的药物组合物可用于治疗糖尿病。糖尿病可为1型糖尿病、2型糖尿病或妊娠糖尿病。在一个实施方案中，糖尿病是2型糖尿病。用于治疗糖尿病的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的糖尿病。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗前驱糖尿病。用于治疗糖尿病的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的前驱糖尿病。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗胰岛素抵抗和刺激胰岛素释放。用于治疗胰岛素抵抗的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的化合物或受约束的烯烃化合物以治疗患者的胰岛素抵抗。用于刺激胰岛素释放的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以刺激患者的胰岛素释放。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗餐后高血糖症。用于治疗餐后高血糖症的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的餐后高血糖症。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于降低血糖水平和降低HbA1c水平。用于降低血糖水平的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的化合物或受约束的烯烃化合物以降低患者的血糖水平。在一个实施方案中，血糖水平可以是空腹血糖水平。降低HbA1c水平的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以降低患者的HbA1c水平。HbA1c水平一般是患者血糖水平的长期度量。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于减少胃蠕动和延缓胃排空。用于减少胃蠕动的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以减少患者的胃蠕动。用于延缓胃排空的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以延缓患者的胃排空。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于减少食物摄取、减少食欲和增加饱满感。用于减少食物摄取的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以减少患者的食物摄取。用于减少食欲或增加饱满感的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以减少患者的食欲。患者可以是任何体重，且可能体重超重或肥胖。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于减轻体重。用于减轻体重的方法包括给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以减轻患者的体重。患者可为任何体重，且可能体重超重或肥胖。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗体重超重和肥胖症。用于治疗体重超重的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的体重超重。用于治疗肥胖症的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的肥胖症。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
“肥胖症”和“体重超重”是指患者的体重大于正常预期体重，可通过例如身体外形、本领域已知的体重指数(BMI)、腰臀围比率、皮褶厚度、腰围等确定。疾病预防控制中心(The Centers for Disease Control and Prevention，CDC)把体重超重定义为BMI为25‑29.9的成人；把肥胖定义为BMI为30或更高的成人。存在确定肥胖症的其它度量。例如，CDC指出腰臀比大于1.0的人为体重超重。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗心血管疾病。用于治疗心血管疾病的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的心血管疾病。用于治疗心血管疾病的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的心血管疾病。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。心血管疾病包括心脏病、充血性心力衰竭、高血压、外周血管疾病、心绞痛、动脉粥样硬化、心肌梗死、高甘油三酯血症和高胆固醇血症。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗神经变性疾病。用于治疗神经变性疾病的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的神经变性疾病。用于治疗神经变性疾病的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的心血管疾病。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。神经变性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、皮克病(Pick’s disease)等。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停。用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的阻塞性睡眠呼吸暂停。用于治疗阻塞性睡眠呼吸暂停的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的阻塞性睡眠呼吸暂停。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
本文所述化合物和包含所述化合物的药物组合物可用于治疗短肠综合征。用于治疗短肠综合征的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的短肠综合征。用于治疗短肠综合征的方法提供给予有需要的患者治疗有效量的一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以治疗患者的短肠综合征。在一个实施方案中，所述方法提供给予药物组合物，所述药物组合物包含一种或多种本文所述的含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)或者一种或多种本文所述的受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)。
可采用本领域技术人员普遍已知的方法，在多种受体结合测定法中测试本文所述化合物。这类测定法包括本文所述测定法。
GLP‑1受体结合测定法。可采用其中受体源为RINm5F细胞膜，配体为[125I]GLP‑1的结合置换测定法，测量GLP‑l受体结结合活性和亲和力。可将均浆的RINm5F细胞膜在含40,000 cpm e25I]GLP‑l示踪剂的20 mM HEPES缓冲液和不同浓度的试验化合物中在恒定搅拌时于23℃孵育2小时。反应混合物经用0.3% PEl溶液预浸泡的玻璃滤板过滤，用冰冷的磷酸缓冲盐水漂洗。可使用闪烁计数器测定结合计数。可应用GraphPad Prism软件(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)，计算出结合亲和力。
GLP‑1腺苷酸环化酶测定法(功能测定法)。可采用例如本领域已知的HTRF (均相时间分辨荧光(Homogeneous Time‑Resolved Fluorescence))基于细胞的cAMP测定试剂盒(CisBio)，测量GLP‑1受体介导的腺苷酸环化酶活化。
葡萄糖降低测定法。在测定前(例如2小时)，使合适的试验动物(例如NIH/Swiss小鼠)禁食。可测定治疗前葡萄糖血液浓度。可在零时间注射化合物或溶媒，以固定的间隔(例如30、60、120、180和240分钟)抽取样品用于血糖测定。合适的血糖测量装置是One Touch® Ultra® (LifeScan，Inc.，Milpitas，CA)。结果可表示为积分的曲线下面积(“AUC”)。例如“AUC240”是指240分钟内的积分血糖。
可用于本文所述生物学测定法的化合物包括下列化合物：
一方面，提供包含本文所述含苯甲酰胺的肽化合物(例如式(I)、式(II)或式(III)的肽化合物)以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。一方面，提供包含本文所述受约束的烯烃肽化合物(例如式(IV)、式(V)或式(VI)的肽化合物)以及药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文所述肽化合物可以多种口服、胃肠外和局部剂型制备和给予。因此，可通过注射(例如静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内)给予本发明的化合物。此外，可通过吸入(例如鼻内)给予本文所述化合物。此外，可经皮给予本发明的化合物。还预期可利用多种给药途径(例如肌内、口服、经皮)给予本发明的化合物。因此，本发明还提供包含药学上可接受的载体或赋形剂和一种或多种本发明的化合物的药物组合物。术语“药学上可接受的赋形剂”等是指赋形剂、载体、一般视为掺入药物组合物中的可接受的其它配混剂(compounding agent)等。
对于从本发明的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可为固体或液体。固体形式制剂包括散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和分散颗粒剂。固体载体可为一种或多种物质，其还可用作稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。
散剂中，载体是与细碎的活性组分混合的细碎固体。片剂中，将活性组分以合适比例与具有必需的结合性质的载体混合，并压制成所需形状和大小。
散剂和片剂优选含有5%‑70%的活性化合物。合适的载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。术语“制剂(preparation)”欲包括活性化合物与作为载体的包封材料(提供胶囊)的制剂(formulation)，在胶囊中含或不含其它载体的活性组分被一种载体包围，因此活性组分与该载体缔合。同样还包括扁囊剂和糖锭剂。片剂、散剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和糖锭剂可用作适于口服给药的固体剂型。
对于制备栓剂，首先将低熔点蜡(例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物)融化，通过搅拌将活性组分均匀分散在其中。然后将熔融的均质混合物倒入合适大小的模子中，使之冷却，从而固化。
液体形式制剂包括溶液剂、混悬剂和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液剂。对于胃肠外注射，液体制剂可在溶液中、在聚乙二醇水溶液中配制。
当胃肠外应用是需要或期需的时，本发明化合物特别合适的混合物是注射用无菌溶液剂，优选油性溶液剂或水性溶液剂以及混悬剂、乳剂或植入剂，包括栓剂。具体地说，用于胃肠外给药的载体包括葡萄糖水溶液、盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段共聚物等。安瓿剂是方便的单位剂量。本发明的化合物还可掺入脂质体中或通过透皮泵或贴剂给予。适用于本发明的药物混合物包括描述于以下文献的药物混合物：例如Pharmaceutical Sciences (第17版, Mack Pub. Co., Easton, PA)和WO 96/05309，两者的教导通过引用结合到本文中。
可通过将活性组分溶于水中，按需加入合适的着色剂、香料、稳定剂和增稠剂，来制备适于口服用的水性溶液剂。适于口服用的水性混悬剂可通过将细碎的活性组分分散于含粘性物质的水中来制备，粘性物质例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和其它众所周知的助悬剂。
还包括欲在临用前转化成液体形式制剂以用于口服给药的固体形式制剂。这类液体形式包括溶液剂、混悬剂和乳剂。除活性组分以外，这些制剂还可含有着色剂、香料、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
药物制剂优选呈单位剂型。在这类形式下，制剂被再分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂，包装含有离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的散剂。此外，单位剂型为可胶囊剂、片剂、扁囊剂或糖锭剂自身，或者其可以是适当数目的包装形式的任何这些剂型。
单位剂量制剂中活性组分的量可按照具体应用和活性组分的效能在以下范围内改变或调整：0.1 mg‑10000 mg、更通常1.0 mg‑1000 mg、最通常10 mg‑500 mg。需要时，组合物还可含有其它相容的治疗剂。
一些化合物可能在水中具有有限的溶解度，因此在组合物中可能需要表面活性剂或其它合适的助溶剂。这类助溶剂包括：聚山梨酯20、60和80；Pluronic F‑68、F‑84和P‑103；环糊精；及聚氧乙烯35蓖麻油。这类助溶剂通常以介于约0.01%至约2%重量之间的水平使用。
可能需要大于简单水性溶液剂粘度的粘度，以降低分配制剂时的可变性，降低制剂中混悬液或乳液的组分的物理分离和/或以别的方式改进制剂。这种粘度增强剂(building agent)包括例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、硫酸软骨素及其盐、透明质酸及其盐和前述物质的组合。这类增强剂通常以介于约0.01%至约2%重量之间的水平使用。
本发明的组合物还可包括提供缓释和/或舒适的组分。这类组分包括高分子量、阴离子mucomimetic聚合物、胶凝多糖和细碎药物载体基质。美国专利号4,911,920、5,403,841、5,212,162和4,861,760中更详细地论述了这些组分。这些专利的完整内容通过引用以其整体结合到本文中用于所有目的。
还提供装有至少一种治疗有效量的本文所述化合物或含有本文所述化合物的药物组合物的药物递送装置。药物递送装置可以是单用或复用小瓶、单用或复用药物注射笔(pharmaceutical pens)、单用或复用药筒等。在一个实施方案中，药物递送装置含有本文所述化合物或药物组合物，其量为能够为患者提供约7‑约40个剂量或足够的剂量以持续约1周或约1个月。
本发明提供的药物组合物包括其中包含治疗有效量(即有效达到其预期目的的量)的活性成分的组合物。对于具体应用是有效的实际量尤其将取决于待治疗的病况。例如，当在治疗特定疾病或病症的方法中给予时，这类组合物将含有有效达到所需结果(例如缓解特定疾病或病症的症状)的活性成分的量。
例如，治疗本文所述疾病的有效量的本文所述化合物通常可为约0.01 μg‑约5 mg、约0.1 μg‑约2.5 mg、约1 μg‑约1 mg、约1 μg‑约50 μg或约1 μg‑约25 μg。或者，根据70 kg患者的体重，治疗有效量的GLP‑1受体激动剂化合物可为约0.001 μg‑约100 μg；或根据70 kg患者的体重，可为约0.01 μg‑约50 μg。可根据剂型，一次/天、两次/天、三次/天、一次/周、两周一次或一次/月给予这些治疗有效剂量。待给予的确切剂量取决于例如剂型，例如即释剂型或缓释剂型。对于经皮、经鼻或口服剂型，剂量可提高约5倍‑约10倍。
所给予的化合物的剂量和频率(单剂量或多剂量)可随多种因素而变化，包括给药途径；接受者的尺寸、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；待治疗疾病的症状的性质和程度(例如特定疾病对改善的反应)；其它疾病或其它健康相关问题的存在情况；同时治疗的类型；以及任何疾病或治疗方案的并发症。其它治疗方案或治疗剂可与本发明的方法和化合物联用。
对于任何的本文所述化合物，最初可由各种测定确定治疗有效量，包括但不限于细胞培养测定和行为测定。靶浓度是能够在细胞培养测定中诱导生物学反应或诱导行为反应的一种或多种活性化合物的浓度。
可由动物模型确定人用的治疗有效量。例如，可配制人用剂量以达到在动物中证实是有效的浓度。可按本领域已知和/或按本文所述，通过监测基础的特定疾病或病症并且向上或向下调整剂量，来调节人用剂量。
剂量可随患者的需要和待采用的化合物而改变。在本发明的情况下，给予患者的剂量应随时间推移足以在患者中引起有益的治疗反应。剂量的大小还将取决于任何不良副作用的存在、性质和程度。一般而言，以较小剂量开始治疗，该剂量小于化合物的最适剂量。之后，以小的递增量提高剂量直到在各情况下都达到最佳效果。在本发明的一个实施方案中，剂量范围为0.001%‑10% w/v。在另一个实施方案中，剂量范围为0.1%‑5% w/v。
分别调节剂量和间隔，以提供所给予的化合物对受治疗的具体临床适应症是有效的水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相当的治疗方案。
利用本文提供的教导，设计有效的预防性或治疗性治疗方案，该方案不会引起重大毒性但对治疗具体患者出现的临床症状完全有效。该设计应包括通过考虑化合物效能、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在情况和严重性、优选的给药方式和所选药剂的毒性概况等因素而仔细选择的活性化合物。
具体化合物的毒性和治疗效果间的比率是其治疗指数，可用LD50 (化合物在50%群体中致死的量)和ED50 (化合物在50%群体中有效的量)间的比率来表示。优选呈现高治疗指数的化合物。从细胞培养测定和/或动物研究中获得的治疗指数数据可用来配制各种人用剂量。这类化合物的剂量优选在血浆浓度的范围内，其包括几乎无毒性或无毒性的ED50。剂量可随所用的剂型和所利用的给药途径而改变。参见例如Fingl等，载于：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第l页，1975。各医师可考虑其中使用化合物的患者的状况和具体方法来选择确切的剂型、给药途径和剂量。
实施例
下面的实施例意在说明本发明的某些实施方案，而不是限制本发明的范围。缩略语：AcCN = 乙腈；BuOH = 丁醇；DCM = 二氯甲烷；DIEA，DIPEA = N,N‑二异丙基乙胺；DMA = N,N‑二甲基乙酰胺；DMAP = N,N‑二甲基氨基吡啶；DMF = N,N‑二甲基甲酰胺；DMSO = 二甲亚砜；EDC = N‑(3‑二甲基氨基丙基)‑N’‑乙基碳二亚胺盐酸盐；EtOAc = 乙酸乙酯；HOBt = 1‑羟基苯并三唑；HPLC = 高压液相色谱法；MS = 质谱法；MsCl = 甲烷磺酰氯；NMR = 核磁共振；TFA = 三氟乙酸；THF = 四氢呋喃；RT = 室温；LC/MS = 液相色谱质谱；NCS = N‑氯代琥珀酰亚胺；TMSI = 三甲基甲硅烷基咪唑；NMM = N‑甲基马来酰亚胺；IBCF = 氯甲酸异丁酯；LDA = 二异丙基酰胺锂；Tf = 三氟甲磺酸盐(triflate/trifluoromethanesulfonate)；CDI = 羰基二咪唑；DPPA = 二苯基磷酰基叠氮化物；HATU = 六氟磷酸2‑(7‑氮杂‑1H‑苯并三唑‑1‑基)‑1,1,3,3‑四甲基脲鎓；DME = 二甲醚；Boc = 叔丁氧基羰基；NBS = N‑溴代琥珀酰亚胺；EDCI = 1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺；dppf = 1,1'‑双(二苯膦基)二茂铁；SEM：2‑(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基；μW：微波。用于本文所述合成的起始原料是市售可得的，或可通过本领域已知的和/或本文描述的方法合成。
实施例1. 用于含有苯甲酰胺的化合物的试剂的合成
可用于本文所述方法和组合物的化合物可通过各种途径，包括以下流程3中描述的合成途径来合成。
流程3

实施例1a：3‑(苄氧基)‑4‑硝基苯甲酸甲酯(2)。将3‑羟基‑4‑硝基苯甲酸甲酯化合物1 (1.0 g，1.0 eq)在微波小瓶中溶于THF (6 mL)。将苯甲醇(1.0 eq)和PPh3 (1.0 eq)加入小瓶中。将反应小瓶置于氮气流下，在搅拌反应物1.5小时后，避光加入DIAD (1.0 eq)。在100℃下用微波照射反应物6分钟(Biotage InitiatorTM Eight)。使溶液浓缩，所得产物的纯化在SP1快速色谱系统(BiotageTM)中进行，以6% EtOAc:94% Hex开始到60% EtOAc:40% Hex。回收的黄色固体用含MP‑碳酸酯树脂(2 eq)的DCM溶液处理，使混合物在室温下振摇过夜。树脂经过滤后，用DCM多次洗涤。将滤液真空浓缩，得到化合物2，为黄色固体(1.39 g，收率94%)。
实施例1b：3‑(苄氧基)‑4‑硝基苯甲酸(3)。将化合物2 (1.53 g，1.0 eq)在圆底烧瓶中溶于THF (52.8 mL)和MeOH (26.4 mL)中，接着加入2N NaOH (13.2 mL，5.0 eq)。将反应物在60℃下加热3小时，不时打开烧瓶以释放压力。通过TLC监测反应物(5% MeOH:95% DCM)。使所得混合物浓缩，将残余物溶于水中，用1N HCl酸化至pH= 2‑3。酸性溶液用AcOEt萃取3x，经Na2SO4干燥，过滤后浓缩，得到化合物3，为浅黄色固体(1.25 g，收率96%)。分析型：1H NMR (DMSO d6, 500 mHz): δ 7.99 (d, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.66 (dd, 1H), 7.46‑7.40 (m, 4H), 7.33 (m, 1H), 5.39 (s, 2H)。LCMS (C18，含2‑98% CH3CN的0.1% TFA/H2O，6分钟内)；C14H11NO5的计算质量(M+H)+ 274.06，LC‑MS实测274。
通过改变流程3中所所用的加合醇试剂，可获得各种有用的试剂用于合成本文所述的化合物。对于下列化合物4、5、6和7 (流程4)，所用的醇分别为异丁醇、异丙醇、2‑甲基‑萘酚和仲丁醇。合成条件在其它方面如流程3提供。
流程4

实施例1c：3‑(异丁氧基)‑4‑硝基苯甲酸(4)。分析型：1H NMR (DMSO d6, 500 mHz): δ 7.98 (d, 1H), 7.74 (s, 1H), 7.65‑7.63 (dd, 1H), 4.00 (d, 2H), 3.9 (s, 3H), 2.02 (hp, 1H), 0.97 (d, 6H)。LCMS (C18，含2‑98% CH3CN的0.1% TFA/H2O，6分钟内)；C11H13NO5的计算质量(M+H)+ 240.0，LC‑MS实测240.1。
实施例1d：3‑(异丙氧基)‑4‑硝基苯甲酸(5)。分析型：1H NMR (DMSO d6, 500 mHz): δ 7.94 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 7.64‑7.62 (dd, 1H), 4.91 (hp, 1H), 1.3 (s, 6H)。LCMS (C18，含2‑98% CH3CN的0.1% TFA/H2O，6分钟内)；C10H11NO5的计算质量(M+H)+ 226.0，LC‑MS实测226.1。
实施例1e：3‑(萘基甲基氧基)‑4‑硝基苯甲酸(6)。分析型：1H NMR (DMSO d6, 500 mHz): δ 8.0‑7.92 (m, 6H), 7.67 (dd, 1H), 7.58 (dd, 1H), 7.53 (d, 2H), 5.56 (s, 2H)。LCMS (C18，含2‑98% CH3CN的0.1% TFA/H2O，6分钟内)；C18H13NO5的计算质量(M+H)+ 323.0，LC‑MS实测323.8。
实施例1f：3‑(仲丁氧基)‑4‑硝基苯甲酸(7)。分析型：1H NMR (DMSO d6, 500 mHz): δ 7.91 (d, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.61‑7.59 (dd, 1H), 4.72‑4.68 (hx, 1H), 1.26 (d, 3H), 0.91 (t, 3H)。LCMS (C18，含2‑98% CH3CN的0.1% TFA/H2O，6分钟内)；C11H13NO5的计算质量(M+H)+ 240.0，LC‑MS实测240.1。
实施例2. 苯甲酰胺化合物的合成。
通常按照以下流程5中提供的反应步骤，制备掺入苯甲酰胺和/或聚苯甲酰胺部分的本文所述化合物。
流程5

实施例2a. 化合物12. 按照流程5中的描述联合使用自动化和手动固相肽合成技术，如下合成化合物12。
步骤1. 将计算的100 μmol Rink酰胺树脂称入Symphony肽合成仪的反应瓶中，按照标准Fmoc肽合成方案进行肽延伸直到毒蜥外泌肽‑4 (1‑28)的残基Lys12。使所得肽‑树脂中间体(0.3 g，0.15 mmol)在DMF中溶胀。向浆液中加入化合物7 (2.2 eq)，接着加入HBTU (2.2 eq)、HOBt (2.2 eq)和NMM (4.4 eq)。3小时后，树脂用DMF、DCM和MeOH洗涤。氯醌试验为阴性。
步骤2. 使树脂8在DMF中溶胀5‑10分钟后，加入含SnCl2:2H2O (2M溶液)的DMF (10 eq)溶液。在室温下轻轻搅拌浆液0.5小时，然后在100℃下微波照射6分钟(Biotage InitiatorTM Eight)。树脂9然后用DMF 6x、DCM 3x、MeOH 2x洗涤，高真空干燥。
步骤3. 使所得到的苯胺‑树脂9在DCE中溶胀5‑10分钟。向浆液中加入PyBrop (4.8 eq)、卢剔淀(15 eq)和化合物3 (4 eq)。在室温下轻轻搅拌浆液0.5小时，然后在100℃下用微波照射30分钟(Biotage InitiatorTM Eight)。重复该程序。
步骤4. 按照步骤2所述进行之前步骤得到的亚硝基到胺的还原，得到树脂10。
步骤5. 使用PyBrop (4.8 eq)、卢剔淀(15 eq)和Fmoc‑Ser(OtBu)‑OH (4 eq)，进行下一个氨基酸的偶联。将混合物在100℃下微波照射30分钟(Biotage Initiator8TM)。树脂然后用DMF 4x、DCM 2x、MeOH 3x洗涤，高真空干燥，得到树脂11。
步骤6. 将计算的100 μmol树脂11称入Symphony肽合成仪的反应瓶中，按照标准Fmoc肽合成方案进行肽延伸，接着用10 ml TFA/H2O/PhOH/TIPS (95:2:2:1)将肽从树脂下裂解，用甲基叔丁基醚沉淀。使所得产物溶解，加样到反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)，得到化合物12，为白色粉末(2.4 mg，3%)。分析型：RP‑HPLC (C18，含5‑75% CH3CN的0.1% TFA/H2O，15分钟内)的保留时间为9.62分钟；C144H213N35O39的计算质量(M+H)+ 3058.51，LC‑MS实测1020.6 (M+3H)3+、765.4 (M+4H)4+、1530.8 (M+2H)2+。
采用流程5所述程序，合成下列化合物。
实施例2b. 化合物13. 分析型：化合物13的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，18.3 mg，12%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.68分钟；C145H214N36O42的计算质量(M+H)+ 3133.54，LC‑MS实测1045.6 (M+3H)3+、784.4 (M+4H)4+、1567.9 (M+2H)2+。
实施例2c. 化合物14. 分析型：化合物14的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，2.7 mg，3%；RP‑HPLC (C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，4分钟内)的保留时间：3.03分钟；C142H207N33O41的计算质量(M+H)+ 3032.43，LC‑MS实测1012.6 (M+3H)3+、1517.8 (M+2H)2+。
实施例2d. 化合物15. 分析型：化合物15的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，0.35 mg，>1%；RP‑HPLC (C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，4分钟内)的保留时间：3.12分钟；C136H192N30O35的计算质量(M+H)+ 2807.23，LC‑MS实测937.5 (M+3H)3+、1404.8 (M+2H)2+。
实施例2e. 化合物16. 分析型：化合物16的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，0.4 mg，>1%；RP‑HPLC (C18，含10‑60% CH3CN的0.1% TFA/H2O，35分钟内)的保留时间：17.02分钟；C94H127N23O24的计算质量(M+H)+ 1963.20，LC‑MS实测1965.1 (M+1)、982.5 (M+2H)2+。
实施例2f. 化合物17. 分析型：化合物17的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，0.35 mg，>1%；RP‑HPLC (C18，含10‑60% CH3CN的0.1% TFA/H2O，35分钟内)的保留时间：21.45分钟；C122H164N26O37的计算质量(M+H)+ 2586.82，LC‑MS实测1294.7 (M+2H)2+。
实施例2g. 化合物18. 分析型：化合物18B的反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)：白色粉末，0.4 mg，1%；RP‑HPLC (C18，含10‑60% CH3CN的0.1% TFA/H2O，35分钟内)的保留时间：18.79分钟；C89H118N22O23的计算质量(M+H)+ 1864.07，LC‑MS实测1866.0 (M+1)、933.5 (M+2H)2+。
实施例3. 生物活性测定法：化合物12‑18
按本文所述用GLP‑1环化酶测定法进行含苯甲酰胺的化合物的生物活性体外测定。如表3所示，最大活性化合物(化合物13‑14)显示纳摩尔活性。
表3. 环化酶GLP‑1 EC50 (nm)
化合物编号EC50 (nm)1265131.7145.51527716136172361821
按照本文所述方法，进行了化合物给药对血糖的作用的体内测定。如图1所示，用本文所述葡萄糖测定法测定，化合物13‑14有效降低血糖。
实施例4. 通过闭环置换的合成
掺入RCM的本文所述化合物的制备一般按照手动和自动化SPPS方法的组合。典型的图解流程如以下流程6所示。
流程6

实施例4a. 化合物22. 采用流程6所述自动化和手动固相肽合成技术的组合，如下合成化合物22。
步骤1. 使Rink酰胺树脂(0.8 g，0.512 mmol)在DMF中溶胀，用含20%哌啶的DMF处理2x25分钟，用DMF洗涤6次。向浆液中加入Fmoc‑L‑烯丙基Gly‑OH (0.38 g，2.2 eq)，接着加入HBTU (0.430 g，2.2 eq)、HOBt (0.15 g，2.2 eq)和NMM (0.25 mL，4.4 eq)。2小时后，树脂用DMF洗涤6次，用含20%哌啶的DMF处理2x25分钟，用DMF洗涤6次。用Fmoc‑Lys(Boc)‑OH、Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Phe‑OH重复SPPS循环，得到树脂19。
步骤2. 使用相同比率的激活剂和碱，将所得树脂19 (0.5 g，0.31 mmol)用Fmoc‑L‑烯丙基Gly‑OH处理。用Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Phe‑OH和Fmoc‑Leu‑OH重复该循环，得到树脂20，将其洗涤并干燥。
步骤3. 将干的树脂20加载到10‑20 mL微波容器(BiotageTM)中，用DCM (8 mL)溶胀后加入0.4 M LiCl/DMF (1 mL)。混合物用氩气吹洗，接着加入约50 mg (20 mol%)的Grubbs II催化剂，在轻缓的氩气流中加入。用DCM (1 mL)将催化剂从小瓶壁上完全洗下。盖上小瓶，用氩气吹洗，超声处理3‑4分钟，接着在Biotage InitiatorTM Eight中于100℃微波反应90分钟。裂解树脂21中的少量样品，LCMS分析显示完全环化。
步骤4. 将计算的100 μmol树脂21称入Symphony肽合成仪的反应瓶中，按照标准Fmoc肽合成方案进行肽延伸，接着用10 ml TFA/H2O/PhOH/TIPS (95:2:2:1)将肽从树脂上裂解，用甲基叔丁基醚沉淀。将所得残余物加到反相HPLC柱(C18，含20‑50% CH3CN的0.1% TFA/H2O，30分钟梯度内)，得到化合物22，为白色粉末(20.5 mg，14%)。分析型：RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间为2.69分钟；C145H225N37O41的计算质量(M+H)+ 3142.63，LC‑MS实测1048.6 (M+3H)3+、1572.9 (M+2H)2+。
通过采用流程6描述的程序，并使用不同手性的烯丙基甘氨酸试剂，合成下列化合物。
实施例4b. 化合物23. 分析型：产量：2.4 mg，1.5%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.67分钟；C145H225N37O41的计算质量(M+H)+ 3142.63，LC‑MS实测1048.6 (M+3H)3+、1572.9 (M+2H)2+。
实施例4c. 化合物24. 分析型：产量：34 mg，22%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.68分钟；C145H225N37O41的计算质量(M+H)+ 3142.63，LC‑MS实测1048.6 (M+3H)3+、1572.9 (M+2H)2+。
实施例4d. 化合物25. 分析型：产量：7.2 mg，7%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.68分钟；C145H225N37O41的计算质量(M+H)+ 3142.63，LC‑MS实测1048.6 (M+3H)3+、1572.9 (M+2H)2+。
掺入适于闭环置换的烯丙基官能团的各种氨基酸试剂。在下面两个实施例中，按流程6所述，将Fmoc‑L‑β‑高烯丙基Gly‑OH用于第1个和/或第5个偶联中。
实施例4e. 化合物26. 产量：22 mg，18%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.95分钟；C146H227N37O41的计算质量(M+H)+ 3156.66，LC‑MS实测1053.6 (M+3H)3+、1579.9 (M+2H)2+、790.4 (M+4H)4+。
实施例4f. 化合物27. 产量：28 mg，21%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.93分钟；C147H229N37O41的计算质量(M+H)+ 3170.69，LC‑MS实测1058.6 (M+3H)3+、1586.9 (M+2H)2+、794.6 (M+4H)4+。
实施例5. N‑联闭环置换化合物的合成
实施例5a. 化合物34. 按照下列流程7中提供的合成途径合成化合物34。
流程7

步骤1. 使Rink酰胺树脂(0.8 g，0.512 mmol)在DMF中溶胀，用含20%哌啶的DMF处理2x25分钟，用DMF洗涤6次。向浆液中加入Fmoc‑Asn(Trt)‑OH (2.2 eq)，接着加入HBTU (2.2 eq)、HOBt (2.2 eq)和NMM (4.4 eq)。2小时后，树脂用DMF洗涤6次，用含20%哌啶的DMF处理2x25分钟，用DMF洗涤6次，得到树脂28。
步骤2. 使树脂28在NMP中溶胀，然后用2,4,6‑可力丁(10 eq)和2‑硝基苯甲酰氯(4 eq)处理。使反应物在室温下振摇25分钟。树脂然后用NMP 3x，DMF 2x，DCM 2x洗涤，得到树脂29。
步骤3. 使树脂29在无水THF中溶胀，接着加入PPh3 (5 eq)和3‑丁烯‑1‑醇(10 eq)，随后在低光照下，在缓和的氩气流下滴加DIAD (5 eq)。使浆液在室温下振摇35分钟，然后用THF 3x、DMF 3x、NMP 3x洗涤，得到树脂30。
步骤4. 使树脂30在NMP中溶胀，接着加入DBU (5 eq)和巯基乙醇(10 eq)。使混合物在室温下在注射器中振摇5分钟，然后用NMP洗涤1次。重复该处理，得到树脂31，其给出阳性氯醌试验。
步骤5. 在微波小瓶中，使树脂31在1,2‑DCE中溶胀，接着加入Fmoc‑Lys(Boc)‑OH (4 eq)、PyBrop (4.8 eq)、2,6‑卢剔淀(15 eq)和几滴DMF。将浆液在100℃下微波照射(Biotage Initiator8TM) 11分钟。氯醌试验为阴性，于是树脂用20%哌啶处理2x25分钟，用DMF洗涤6次。通过LCMS分析少量树脂样品的裂解，显示出预期的M+1。
步骤6. 使所得肽‑树脂在DMF中溶胀，向浆液中加入Fmoc‑Leu‑OH (2.2 eq)，接着加入HBTU (2.2 eq)、HOBt (2.2 eq)和NMM (4.4 eq)。2小时后，树脂32用DMF洗涤6次，用含20%哌啶的DMF处理2x25分钟，并用DMF洗涤6次。
步骤7. 用Fmoc‑Phe‑OH、Fmoc‑L‑烯丙基Gly‑OH和Fmoc‑Ileu‑OH重复之前的循环。将无水树脂(0.250 g，0.139 mmol)装载到5 mL微波容器(BiotageTM)中，用DCM (2.4 mL)溶胀，接着加入0.4 M LiCl/DMF (0.7 mL)。混合物用氩气吹洗，接着加入约40 mg (20 mol%)的Grubbs II催化剂，在轻缓的氩气流下加入。用DCM (0.5 mL)从小瓶壁中完全洗下催化剂。盖上小瓶，用氩气吹洗，超声处理3‑4分钟，接着在Biotage InitiatorTM Eight中于100℃微波反应90分钟。裂解少量样品的树脂33，LCMS分析显示完全环化。在流程7描述的结构中，取代基R1、R2和R3分别是指Lys，Leu和Phe的侧链。
步骤8. 将计算出的100 μmol树脂33称入Symphony肽合成仪的反应容器中，按照标准Fmoc肽合成方案进行肽延伸，接着用10 ml TFA/H2O/PhOH/TIPS (95:2:2:1)从树脂上裂解肽，用甲基叔丁基醚沉淀。将所得肽溶于1.5 mL的MeOH:ACN (1:1)，接着加入2M LiOH (0.6 mL)，在室温下搅拌反应物6小时。使所得产物溶解，加到反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)中，得到化合物34，为白色粉末。分析型：产量：16.6 mg，11%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.89分钟；C148H230N38O42的计算质量(M+H)+ 3213.71，LC‑MS实测1072.6 (M+3H)3+、804.4 (M+4H)4+、1608.9 (M+2H)2+。
实施例5b. 化合物35. 按照流程7描述的程序合成化合物35，不同之处在于在第4个偶联时使用Fmoc‑L‑β‑高烯丙基Gly‑OH替换Fmoc‑L‑烯丙基Gly‑OH。裂解后，将粗产物溶解，并加到反相HPLC柱中(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)，得到化合物35，为白色粉末。分析型：产量：22.1 mg，13%；RP‑HPLC (C18，含5‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，5分钟内)的保留时间：2.92分钟；C149H232N38O42的计算质量(M+H)+ 3227.74，LC‑MS实测1077.6 (M+3H)3+、808.4 (M+4H)4+、1614.9 (M+2H)2+。
实施例5c. 化合物36. 按照流程7描述的程序合成化合物35，不同之处在于在Mitsunobu烷基化步骤(步骤3)中使用烯丙基醇。裂解后，将粗产物溶解，并加到反相HPLC柱(C18，含5‑95% CH3CN的0.1% TFA/H2O，40分钟梯度内)，得到化合物36，为白色粉末。分析型：产量：12.1 mg，9%；RP‑HPLC (C18，含10‑90% CH3CN的0.1% TFA/H2O，30分钟内)的保留时间：17.68分钟；C147H228N38O42的计算质量(M+H)+ 3199.69，LC‑MS实测1067.6 (M+3H)3+、801.4 (M+4H)4+、1601.9 (M+2H)2+。
实施例6. 葡萄糖降低体内生物活性
按本文所述，用GLP‑1环化酶测定法进行受约束的烯烃化合物的生物活性体外测定。如表4所示，最大活性化合物(化合物27和34)显示亚纳摩尔活性，化合物22具有纳摩尔活性。
表4. 环化酶GLP‑1 EC50 (nm)
化合物编号EC50 (nm)2252313324127251312635270.8340.73535
通过本文所述方法，进行了化合物给药对血糖的作用的体内测定。如图2所示，如通过本文所述葡萄糖测定法测定的，所有受试化合物有效降低血糖。
实施例7. 含苯甲酰胺的化合物的分子建模研究
对于化合物T1的侧链和化合物13的相应侧链替代部分，进行了分子建模研究，以评价其通用构象空间和能量学。如图3所示，与化合物T1相应的Phe基团相比，在化合物13的2个侧链替代苯环的最小能量结构中观察到基本上完全重叠。
实施例8. 受约束的烯烃化合物的分子建模研究
对于化合物T1的侧链及化合物27和化合物34的相应侧链替代部分，进行了分子建模研究，以评价其通用构象空间和能量学。如图4所示，与化合物T1相应的Phe基团相比，在化合物27和化合物34的2个侧链替代苯环的最小能量结构中观察到基本上完全重叠。