《OSPT2磷高效利用转基因大豆培育方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《OSPT2磷高效利用转基因大豆培育方法.pdf（24页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 104004755 A (43)申请公布日 2014.08.27 CN 104004755 A (21)申请号 201410232281.3 (22)申请日 2014.05.28 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明。
2、人 朱月林 盖钧镒 陈国户 杨立飞 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 (54) 发明名称 OsPT2 磷高效利用转基因大豆培育方法 (57) 摘要 本发明属于分子生物学与生物技术领域， 涉 及一种磷转运蛋白基因 OsPT2 及该基因在转基因 作物育种中的应用， 提供含该基因的表达盒及构 建、 重组植物表达载体及含该载体的宿主菌、 磷高 效利用转基因大豆的培育方法和 OsPT2 基因相对 表达量的测定方法、 试剂盒。 本发明解决现有技术 中磷转运蛋白基因 OsPT2 在大豆育种中的空白， 通过选择合适的酶切位点， 在OsPT2基因引入35s 启动子。
3、和终止子， 增加了 OsPT2 基因在外源基因 中的表达调控， 构建的重组植物表达载体含有除 草剂抗性基因 bar 基因， 既方便检测又增加转基 因植株对除草剂的抗性， 以本发明培育方法生产 出的大豆， 能高效利用磷。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 序列表7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 104004755 A CN 104004755 A 1/2 页 2 1.一种磷转运蛋白OsPT2基因表达盒， 其特征在于 ： 该表达盒序列如SEQ 。
4、ID NO.2所示。 2.权利要求1所述的磷转运蛋白OsPT2基因表达盒的构建方法， 其特征在于， 包括如下 步骤 ： 1) 设计引物， 扩增序列为 SEQ ID NO.1 所示的 OsPT2 基因片段 ； 其中， 上游引物 P1 ： 如 SEQ ID NO.3 所示 ； 下游引物 P2: 如 SEQ ID NO.4 所示 ； 2) 将 OsPT2 基因连接到 pMD19-T 质粒载体， 转化 TOP10 感受态细胞， 提取阳性重组质 粒， 进行 SacI 和 XbaI 双酶切， 回收 OsPT2 基因片段 ； 3) 进行植物表达载体 pBI121SacI 和 XbaI 双酶切， 回收 pBI。
5、121 大片段 ； 4) 以连接酶连接上述回收的 OsPT2 基因片段和 pBI121 大片段， 形成连接产物， 以连接 产物转化 TOP10 感受态细胞， 37过夜培养， 挑取单克隆扩大培养， 筛选出转化子 ； 5) 提取步骤 4) 中转化子的阳性重组质粒进行 EcoRI 及 HindIII 双酶切， 回收小片段， 即得到 OsPT2 基因表达盒 ； 其 中， 步 骤 2)、 3) 和 步 骤 5) 中 双 酶 切 体 系 为 ： 50L 体 系 中 10Buffer15L， BSA0.5L， DNA15L， SacI1.0L， XbaI1.0L， ddH2O 补至 50L ； 37反应 2。
6、h ； 双酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目的片段 ； 步骤 4) 中连接反应体系为 ： 10T4ligase Buffer2.5L， pBI121 大片段 2L， OsPT2 基因片段 8L， T4DNA 连接酶 1L， ddH2O 补至 25L。 3.OsPT2 基因在磷高效利用转基因植物中的应用， 优选地， 在磷高效利用转基因大豆中 的应用。 4. 一种磷高效利用转基因大豆的培育方法， 其特征在于将水稻磷转运蛋白基因 OsPT2 构建至植物表达载体pCAMBIA3301中， 获得重组植物表达载体pCAMBIA3301-OsPT2中， 通过 农杆菌介导的方法导入大豆 ； 具体包括如。
7、下步骤 ： 1) 重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 的构建 ： 将水稻磷转运蛋白 OsPT2 基因表达 盒构建至植物表达载体 pCAMBIA3301 中， 形成重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 ； 2)OsPT2 转基因大豆转化体的获得 ： 以大豆子叶节为外植体， 通过农杆菌介导法， 将植 物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 导入大豆基因组中， 通过除草剂 Bialaphos 筛选获得 T0代 转化体 ； 3)OsPT2 转基因大豆 T2代阳性植株的获得 ： T0代植株通过自花授粉获得 T1代种子， T1 代种子萌发后通过 PCR 及 GUS。
8、 染色鉴定出阳性植株， 阳性植株自花授粉获得 T2代种子 ； T2 代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株， 获得磷高效利用转基因大豆。 5. 一种重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2， 其特征在于含有权利要求 1 所述的磷 转运蛋白 OsPT2 基因表达盒和除草剂抗性基因 bar 基因， 水稻磷转运蛋白 OsPT2 基因表达 盒位于到植物表达载体 pCAMBIA3301 的 EcoRI 及 HindIII 酶切位点之间。 6. 权利要求 5 所述的植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2， 在磷高效利用转基因植物培 育中的应用， 优选地， 在磷高效利用转基因大豆培育。
9、中的应用。 7. 一 种 宿 主 菌， 其 特 征 在 于 含 有 权 利 要 求 4 所 述 的 重 组 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA3301-OsPT2。 8. 权利要求 7 所述的宿主菌在磷高效利用转基因植物培育中的应用， 优选地， 在磷高 效利用转基因大豆培育中的应用。 权 利 要 求 书 CN 104004755 A 2 2/2 页 3 9. 一种磷高效利用转基因大豆 OsPT2 基因相对表达量的测定方法， 其特征在于 ： 以大 豆伸长因子 EF-laX56856 基因 TefS1 作为内参基因， 通过半定量 RT-PCR 测定 OsPT2 基因在 磷高效利用转基因大豆中的。
10、表达量 ； 其中， 使用 444-bp OsPT2 基因探针的制备引物， 上游引物 F ： 如 SEQ ID No.9 所示， 下游 引物 R ： 如 SEQ ID No.10 所示 ； 检测 TefS1 基因的上游引物 FT ： 如 SEQ ID No.11 所示 ； 下游引物 RT ： 如 SEQ ID No.12 所示。 10. 一种磷高效利用转基因大豆 OsPT2 基因相对表达量测定的试剂盒， 其特征在于 ： 该 试剂盒包括如下序列 ： 444-bp OsPT2 基因探针的制备引物， 上游引物 F ： 如 SEQ ID No.9 所示， 下游引物 R ： 如 SEQ ID No.10 。
11、所示 ； TefS1 基因的检测引物， 上游引物 FT ： 如 SEQ ID No.11 所示 ； 下游引物 RT ： 如 SEQ ID No.12 所示。 权 利 要 求 书 CN 104004755 A 3 1/10 页 4 OsPT2 磷高效利用转基因大豆培育方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学与生物技术领域， 涉及一种磷转运蛋白基因 OsPT2 及该基 因在转基因作物育种中的应用， 具体涉及一种磷转运蛋白基因 OsPT2 表达盒、 该表达盒的 构建， 及利用该表达盒进行磷高效利用转基因大豆的培育方法、 在培育过程中所使用的表 达载体和宿主菌及应用以及该种转基因大豆的检测试剂盒。
12、和定量检测方法。 技术背景 0002 磷 (P) 是植物生长发育所需的大量元素之一， 几乎参与所有生命的重要代谢活 动， 在植物体内的能量传递、 信号传导、 光合作用及呼吸作用等过程中起到关键作用 ； 此 外， 磷还是细胞核及磷脂的重要组成成分 (Raghothama K G,Phosphate transport and signaling.Current Opinion in Plant Biology,2000.3(3):182-187)。植物从土壤中获 取磷仅以磷酸盐 (Pi) 形式获取。尽管土壤中总磷含量比较高， 但由于磷酸盐浓度较低 (0.110M) 而成为限制植物生长限制因子之一。
13、 (Raghothama K G and Karthikeyan A S,Phosphate acquisition.Plant and Soil,2005.274:37-49)。我国农田约有 2/3 严重缺 磷， 其中红壤作为我国南方主要的耕作土壤， 其独特的理化性质， 使其中的磷素更容易被固 定， 从而表现出严重缺磷现象 ( 李杰 , 石元亮 , 陈智文 , 我国南方红壤磷素研究概况 . 土 壤通报 ,2011.42(3):763-768)。为了获得较高产量， 全球每年约 3 千万吨磷肥施用于耕 地土壤， 其中高达 80被浪费掉 (Lpez-Bucio J,de la Vega OM,Gu。
14、evara-Garca A and Herrera-Estrella L.Enhanced phosphorus uptake in transgenic tobacco plants that overproduce citrate.Nature Biotechnology,2000.18:450-453)。大量磷肥的施用加速 土壤退化及环境污染， 并造成磷资源浪费， 据估算磷矿资源将在本世纪末消耗殆尽 (Hata S,Kobae Y and Banba M,Interactions between plants and arbuscular mycorrhizal fungi. Inter。
15、national Review of Cell and Molecular Biology,2010.281:1-48)。 0003 大豆是需磷量较多的作物， 也是世界普遍种植的作物之一， 是人类最主要的植物 油及蛋白来源 (Herridge D F,Peoples M B and Boddey R M,Global inputs of biological nitrogen fixation in agricultural systems.Plant and Soil,2008.311:1-18)。土 壤 低 磷 限 制 着 大 豆 的 产 量 (Vance C P,Symbiotic ni。
16、trogen fi xation and phosphorus acquisition.Plant nutrition in a world of declining renewable resources.Plant Physiology,2001.127:390-397)。 而近年来包括中国在内的世界各国对大豆的消费迅速增 长， 使大豆生产的供需矛盾越来越突出， 特别是在我国， 直接关系到国家经济发展和粮食安 全 ( 程凤娴 , 涂攀峰 , 严小龙 , 王秀荣 , 廖红 , 酸性红壤中磷高效大豆新种质的磷营养特 性 . 植物营养与肥料学报 ,2010.16(1):71-81)。 0004 。
17、近年来， 将高亲和磷转运蛋白基因转入到合适的经济及农作物中， 获得磷高效的 转基因材料是培育磷高效作物新品种的一种有效途径， 如大豆中超表达 GmPT5 基因 , 转 基因植株的磷含量在低磷及高磷条件下均比对照的磷含量显著增加 (Qin L,Zhao J,Tian J,Chen L Y,Sun Z A,Guo Y X,Lu X,Gu M,Xu G H,Liao H.The high-affinity phosphate 说 明 书 CN 104004755 A 4 2/10 页 5 transporter GmPT5regulates phosphate transport to nodule。
18、s and nodulation in soybean.Plant Physiology,2012,159:1634-1643)。水稻中分别超表达 OsPT1、 OsPT2 及 OsPT8， 在低磷条件下可增加磷从地下部到地上部的运输， 从而提高植株耐低磷能力 (Jia H F,Ren H Y,Gu M,Zhao J N,Sun S B,Zhang X,Chen J Y,Wu P and Xu G H,The phosphate transporter gene OsPht1 ； 8is involved in phosphate homeostasis in rice.Plant Physi。
19、ology,2011.156:1164-1175 ； Wu P,Shou H X,Xu G H and Lian X M,Improvement of phosphorus effi ciency in rice on the basis of understanding phosphate signaling and homeostasis.Current Opinion in Plant Biology,2013.16:1-8)。 烟草(Nicotiana tabacum L.)NtPT1 在水稻中超表达， 在低磷及高磷条件下均能够显著增加转基因植株的磷含量 (Park M R,Baek 。
20、S H,Reyes B G and Yun S J,Overexpression of a high-affi nity phosphate transporter gene from tobacco (NtPT1)enhances phosphate uptake and accumulation in transgenic rice plants.Plant and Soil,2007.292:259-269)。 由此可见， 植物中超表达磷 转运蛋白基因在低磷条件下可增加磷的吸收及提高耐低磷能力。 0005 水稻 (Oryza sativa L.)Pht1 家族基因之一的磷转运蛋白基因 O。
21、sPT2 主要在根中 柱、 叶韧皮部、 木质部中表达， 是磷饥饿信号的应答基因， 负责植物对磷的吸收及磷在体内 的转运过程 (Wu P,Shou H X,Xu G H and Lian X M,Improvement of phosphorus effi ciency in rice on the basis of understanding phosphate signaling and homeostasis.Current Opinion in Plant Biology,2013.16:1-8)。利用 RNA 沉默技术敲除 OsPT2 显著增加磷 的吸收及从根部到地上部分长距离运输， 。
22、并且超表达 OsPT2 能够引起水稻地上部过量 磷的积累， 从而引起磷中毒。由于其特殊的表达模式， OsPT2 被认为在植物磷转运过程 中起到 重要的作用 (Ai P H,Sun S B,Zhao J N,Fan X R,Xin W J,Guo Q,Yu L,Shen Q R,Wu P,Miller A J and Xu G H,Two rice phosphate transporters,OsPht1 ； 2and OsPht1 ； 6,have different functions and kinetic properties in uptake and translocation.T。
23、he Plant Journal,2009.57(5):798-809)。 利用生物工程手段将此基因导入作物中， 可改善作物磷吸 收及利用效率， 有效降低磷肥的施用量。 但到目前为止， 尚未发现有此基因在大豆中表达的 报道， 利用生物工程提高大豆磷高效利用也鲜有报道。 发明内容 0006 本发明目的是解决现有技术中磷转运蛋白基因 OsPT2 基因在大豆育种中的空白， 实现大豆磷高效转运、 减少磷肥的过度使用， 从而降低土壤退化速度。 0007 为实现上述目的， 本发明提供下述技术 ： 0008 本发明提供一种磷转运蛋白OsPT2基因表达盒， 其序列为SEQ ID NO.2， 具有EcoRI 和。
24、 HindIII 双酶切位点。 0009 本发明还提供上述磷转运蛋白 OsPT2 基因表达盒的构建方法， 包括如下步骤 ： 0010 1)设计引物， 扩增序列为SEQ ID NO.1所示的OsPT2基因片段 ； 其中， 上游引物P1 ： 如 SEQ ID NO.3 所示 ； 下游引物 P2: 如 SEQ ID NO.4 所示 ； 0011 2)将OsPT2基因连接到pMD19-T质粒载体， 转化TOP10感受态细胞， 提取阳性重组 质粒， 进行 SacI 和 XbaI 双酶切， 回收 OsPT2 基因片段 ； 0012 3) 进行植物表达载体 pBI121SacI 和 XbaI 双酶切， 回收。
25、 pBI121 大片段 ； 说 明 书 CN 104004755 A 5 3/10 页 6 0013 4) 以连接酶连接上述回收的 OsPT2 基因片段和 pBI121 大片段， 形成连接产物， 以 连接产物转化 TOP10 感受态细胞， 37过夜培养， 挑取单克隆扩大培养， 筛选出转化子 ； 0014 5)提取步骤4)中转化子的阳性重组质粒进行EcoRI及HindIII双酶切， 回收小片 段， 即得到 OsPT2 基因表达盒 ； 0015 其中， 步骤 2)、 3) 和步骤 5) 中双酶切体系为 ： 50L 体系中 10Buffer15L， BSA0.5L， DNA15L， SacI1.0L。
26、， XbaI1.0L， ddH2O 补至 50L ； 37反应 2h ； 双酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目的片段 ； 0016 步骤 4) 中连接反应体系为 ： 10T4ligase Buffer2.5L， pBI121 大片段 2L， OsPT2 基因片段 8L， T4DNA 连接酶 1L， ddH2O 补至 25L。 0017 本发明提供 OsPT2 基因在磷高效利用转基因植物中的应用， 优选地， 在磷高效利 用转基因大豆中的应用。 0018 本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆的培育方法， 将水稻磷转运蛋白基因 OsPT2 构建至植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT。
27、2 中， 通过农杆菌介导的方法导入大豆 ； 具体 包括如下步骤 ： 0019 1) 重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 的构建 ： 将水稻磷转运蛋白 OsPT2 基因 表达盒构建至植物表达载体 pCAMBIA3301 中， 形成重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 ； 0020 2)OsPT2 转基因大豆转化体的获得 ： 以大豆子叶节为外植体， 通过农杆菌介导法， 将植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 导入大豆基因组中， 通过除草剂 Bialaphos 筛选获得 T0代转化体 ； 0021 3) 转 OsPT2 基因大豆 T2代阳性植株的获得 ：。
28、 T0代植株通过自花授粉获得 T1代种 子， T1代种子萌发后通过 PCR 及 GUS 染色鉴定出阳性植株， 阳性植株自花授粉获得 T2代种 子 ； T2代种子萌发后通过同样的方法鉴定出阳性植株， 获得磷高效利用转基因大豆。 0022 本发明还提供一种重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2， 含有上述的磷转运蛋 白 OsPT2 基因表达盒和除草剂抗性基因 bar 基因， 水稻磷转运蛋白 OsPT2 基因表达盒位于 植物表达载体 pCAMBIA3301 的 EcoRI 及 HindIII 酶切位点之间。 0023 上述的植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2， 在磷高效利。
29、用转基因植物培育中的应 用， 优选地， 在磷高效利用转基因大豆培育中的应用。 0024 本发明还提供一种宿主菌， 含有上述植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2。 0025 本发明提供的宿主菌在磷高效利用转基因植物培育中的应用， 优选地， 在磷高效 利用转基因大豆培育中的应用 0026 本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆 OsPT2 基因相对表达量的测定方法， 以 大豆伸长因子 EF-laX56856 基因 TefS1 作为内参基因， 通过半定量 RT-PCR 测定 OsPT2 基因 在磷高效利用转基因大豆中的表达量 ； 0027 其中， 使用 444-bp OsPT2 基因探针的。
30、制备引物， 上游引物 F ： 如 SEQ ID No.9 所示， 下游引物 R ： 如 SEQ ID No.10 所示 ； 0028 检测 TefS1 基因的上游引物 FT ： 如 SEQ ID No.11 所示 ； 下游引物 RT ： 如 SEQ ID No.12 所示。 0029 本发明还提供一种磷高效利用转基因大豆 OsPT2 基因相对表达量测定的试剂盒， 该试剂盒包括如下序列 ： 说 明 书 CN 104004755 A 6 4/10 页 7 0030 444-bp OsPT2基因探针的制备引物， 上游引物F ： 如SEQ ID No.9所示， 下游引物R ： 如 SEQ ID No.。
31、10 所示 ； 0031 TefS1 基因的检测引物， 上游引物 FT ： 如 SEQ ID No.11 所示 ； 下游引物 RT ： 如 SEQ ID No.12 所示。 0032 本发明有益效果 ： 0033 1. 本发明通过选择合适的酶切位点， 将经过人工 PCR 扩增的 OsPT2 基因引入 35s 启动子和终止子， 增加了OsPT2基因在外源基因中的表达调控， 提高了OsPT2基因的表达水 平 ； 同时， 通过引入 EcoRI 及 HindIII 双酶切位点， 形成的磷转运蛋白 OsPT2 基因表达盒可 以应用于多种磷高效利用转基因植株的培育， 尤其是磷高效利用转基因大豆的培育， 填。
32、补 了现有技术中的空白。 0034 2. 采用本发明提供的磷高效利用转基因大豆的培育方法生产出的含有 OsPT2 基 因的大豆， 具有磷高效利用的特点， 可在低磷环境下生存， 通过试验鉴定， 通过本发明提供 的培育方法生产出的转基因大豆， 即使在 75 天低磷生长环境下， 生长状况仍然良好， 产量 未发生显著性减少。 0035 3. 本 发 明 构 建 的 水 稻 磷 转 运 蛋 白 基 因 OsPT2 的 重 组 植 物 表 达 载 体 pCAMBIA3301-OsPT2， 含有除草剂抗性基因 bar 基因， 使得携带有磷转运蛋白基因 OsPT2 的 植物表达载体在宿主细胞中表达更容易检测，。
33、 额外增加的除草剂抗性基因 bar 基因提高了 转基因植株对除草剂的抗性， 增加了品质。 0036 4. 本发明通过选择合适的看家基因即大豆伸长因子 EF-laX56856 基因 (TefS1) 作为内参基因， 以此作为基准， 使用集成凝胶显像系统， 凝胶图像分析 OsPT2 基因相对于 TefS1 基因的表达量， 通过该方法可以定量测定 OsPT2 基因转化率， 从而选择出合适表达的 转基因大豆， 为转基因育种提供方便。 附图说明 0037 图 1OsPT2 基因表达盒 0038 图 2 植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 的 T-DNA 区 0039 图 3 农杆菌介导大豆子。
34、叶节遗传转化过程 0040 A ： 无菌苗5天苗龄 ； B ： 子叶节共培养 ； C ： Bialaphos筛选2个月的外植体 ； D ： 抗性 芽伸长至 3-4cm ； E ： GUS 阳性芽生根 ； F ： 转基因阳性植株。 0041 图 4 转基因大豆植株 PCR 及 Southern 杂交鉴定 0042 A ： PCR鉴定T0代植株 ： agus基因 ； bbar基因 ； cOsPT2基因 ； MDNA Marker ： 大小分别为 2Kb、 1Kb、 0.75Kb、 0.5Kb、 0.25Kb、 0.1Kb ； P质粒 DNA 阳性对照 ； WT野生型植 株阴性对照 ； 1 10分别。
35、为 T0代转基因植株 12PT2-1 12PT2-10 ； 0043 B ： Southern 杂交分析 ： MDNA Marker ： 大小分别为 15Kb、 7.5Kb、 0.75Kb、 0.5Kb、 0.25Kb、 0.1Kb ； P质粒 DNA 阳性对照 ； WT野生型植株阴性对照 ； 1 10分别为 T0代转 基因植株 12PT2-1 12PT2-10。 0044 图 5 转基因大豆 GUS 染色鉴定 0045 A ： T0代植株叶片 ； B ： T0代植株花 ； C ： 萌发 3 天的 T1代种子 ； D ： 萌发 24 小时的 T2 代种子 ： 1-3分别为 12PT2-1， 1。
36、2PT2-2， 12PT2-4， WT野生型植株阴性对照。 说 明 书 CN 104004755 A 7 5/10 页 8 0046 图 6 转 OsPT2 基因植株 Basta 抗性分析 0047 A ： 黑色箭头表示转基因植株具有 Basta 抗性 ； B ： 白色箭头表示阴性植株不具有 Basta 抗性。 0048 图 7 半定量 RT-PCR 检测 OsPT2 在 T2代植株中的表达 0049 A ： 半定量RT-PCR检测OsPT2基因表达电泳结果。 B ： 光密度分析OsPT2基因相对表 达量。WT野生型植株阴性对照 ； 1， 2， 3分别为转基因植株 12PT2-1， 12PT2。
37、-2， 12PT2-4 ； TefS1看家基因 0050 图 8 低磷条件下营养液栽培植株生长情况 0051 A-C ： 低磷处理 10 天后 ； D-F ： 低磷处理 45 天后 ； G ： 低磷处理 75 天后 ； OsPT2T2T2 转基因植株 ； WT野生型植株阴性对照， 其中， 各竖线长度代表比例尺度 (Bar) ： A、 D、 G 短线 长度代表实际 Bar 15cm ； B， C， E 与 F 长线长度代表实际 Bar 1cm 0052 图 9 低磷及正常磷条件下营养液栽培植株不同器官磷积累情况 0053 A ： 营养液栽培 30 天后植株根、 茎、 叶有效磷含量 ； B ： 营。
38、养液栽培 30 天后植株根、 茎、 叶总磷含量 ； C ： 落叶中总磷含量 ； D ： 种子中总磷含量 ； 每个株系共选用 5 棵植株用于分 析， 不同字母表示 LSD 比较在 P0.05 水平上差异显著。 具体实施方式 0054 下述实施例中所用方法若无特殊说明均为本领域惯用的技术手段， 所用的试剂、 材料， 如无特殊说明均可通过商业途径得到。 0055 一、 植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 的构建 0056 1. 水稻磷转运蛋白基因 OsPT2 基因的克隆 ： 0057 以水稻叶片为材料， 参照 TaKaRa 公司总 RNA 提取试剂盒 ( 目录号 ： D9108A) 说。
39、明 书方法， 提取叶片总RNA并反转录成cDNA， 用RNase消化cDNA产物， 参照水稻磷转运蛋白基 因基因序列信息(NCBI登录号 ： AF536962)， 设计引物进行PCR反应， 扩增出水稻磷转运蛋白 基因 OsPT2 ； 其中， 基因 OsPT2 的序列如 SEQ ID NO.1 ； 引物序列 ： 上游引物 P1 序列如 SEQ ID NO.3 所示， 下游引物 P2 序列如 SEQ ID NO.4 所示。 0058 以上述反转录成的 cDNA 为模板， 进行 PCR 反应 ； 0059 PCR 反应体系 ： 10PCR Buffer5.0L， dNTP mix4.0L(2.5mm。
40、ol L-1)， 引物 P1 和 P2 各 1.0L(20molL-1)， PrimeSTARTM HS DNA Polymerase0.4L， cDNA 模板 1L， ddH2O 补至 50L ； 0060 两步法 PCR 反应程序 ： 94， 5min， 65， 2min， 72， 45s， 30 个循环后， 72总延伸 10min ； 0061 PCR 产物用凝胶回收试剂盒 (AXYGEN， 目录号 ： AP-GX-50) 回收纯化， 用 T4DNA 连接 酶 (TaKaRa， 目录号 ： D2011A) 连接到 pMD19-T 载体 (TaKaRa， 目录号 ： D102A)， 转化 。
41、TOP10 感 受态细胞， 获得阳性重组质粒， 进行序列测定 ； 0062 2. 磷转运蛋白 OsPT2 基因表达盒的构建 0063 提取上述阳性重组质粒进行 SacI 和 XbaI 双酶切， 回收 OsPT2 基因片段 ； 0064 同时对植物表达载体 pBI121 进行 SacI 和 XbaI 双酶切， 回收 pBI121 大片段 ； 0065 双 酶 切 体 系 (50L) ： 10Buffer15L， BSA0.5L， DNA15L， SacI1.0L， 说 明 书 CN 104004755 A 8 6/10 页 9 XbaI1.0L， ddH2O 补至 50L ； 37反应 2h ；。
42、 双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目 的片段 ； 0066 上述回收的pBI121大片段和OsPT2基因片段， 按照1:4的比例， 用T4DNA连接酶连 接， 连接反应体系 ： 10T4ligase Buffer2.5L， pBI121大片段2L， OsPT2基因片段8L， T4DNA 连接酶 1L， ddH2O 补至 25L ； 16反应过夜， 取 10L 连接产 物转化 TOP10 感受态 细胞。37过夜培养， 挑取单克隆扩大培养， 筛选转化子 ； 0067 提取转化子的阳性重组质粒， 依据上述酶切体系进行EcoRI及HindIII双酶切， 回 收小片段， 即得到 OsPT2 基因。
43、表达盒， 序列如 SEQ ID NO.2 所示 ； 0068 3. 重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 的构建 0069 对植物表达载体 pCAMBIA3301 依据上述酶切体系进行 EcoRI 及 HindIII 双酶切， 回收大片段。 0070 双酶切后回收的 pCAMBIA3301 大片段和 OsPT2 基因表达盒， 按照 1:4 的比例， 用 T4DNA 连接酶连接， 连接反应体系 ： 10T4ligase Buffer2.5L， pCAMBIA3301 大片段 2L， OsPT2 基因表达盒 8L， T4DNA 连接酶 1L， ddH2O 补至 25L ； 16反应。
44、过夜， 取 10L 连 接产物转化 TOP10 感受态细胞。37过夜培养， 挑取单克隆扩大培养， 提取质粒， 进行双酶 切验证， 重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 构建成功。 0071 二、 重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2 转染农杆菌 EHA105 0072 1. 提取 10L， 即 2g 纯化的重组植物表达载体 pCAMBIA3301-OsPT2， 加入 200L 农杆菌 EHA105 感受态， 混匀 ； 0073 2. 冰浴 5min， 转入液氮冷冻 1min ； 0074 3. 加入 800L YEB 液体培养基， 250rpm， 28， 4-5。
45、h ； 0075 4. 用移液器将菌液移至 YEB 固体选择培养基， 其中含 50mgL-1卡那霉素， 均匀涂 布 ； 0076 5.28培养 1-2d， 挑取单菌落， 提取质粒， 酶切鉴定获得转化的农杆菌工程菌。 0077 三、 农杆菌介导 OsPT2 基因表达载体转化大豆 0078 1. 大豆子叶节外植体的制备及侵染 0079 取成熟饱满的大豆 新辽鲜 种子， 表面消毒后接种于萌发培养基 B5 培养基 +3 (w/v)+0.8 (w/v) 琼脂， pH5.8， 25条件下， 光照 ( 时间 16h 昼 /8h 夜， 强度 90mol m-2s-1) 培养 5-6 天获得无菌苗 ( 如图 3。
46、-A 所示 )。保留子叶下方 2-3cm 的下胚轴， 垂直沿下 轴胚将子叶分开， 水平划 5-7 次腋芽原基区， 得到子叶节外植体。 0080 将含重组植物表达载体pCAMBIA3301-OsPT2农杆菌EHA105划线于平板， 28培养 24h， 挑取单克隆液体培养 24h， 然后取 2mL 菌液加入 200mL YEP 液体培养基中， 扩大培养至 OD650为 0.6-0.8， 菌液离心后， 用液体共培养基 1/10B5 培养基 +1.67mgL-16- 苄基氨基嘌 呤 +0.25mgL-1赤霉素 +200molL-1乙酰丁香酮 +3 (w/v) 蔗糖 +0.7 (w/v) 琼脂， pH5。
47、.4 重悬， 调节 OD650值为 1。 0081 外植体放入到 50mL 重悬菌液中， 侵染 30min。侵染结束后， 吸干多余菌液， 将外植 体近轴面向下接种于铺有一层滤纸的共培养基 ( 添加 3mmolL-1L- 半胱氨酸 +1mmolL-1 硫代硫酸钠和二硫苏糖醇 )， 25暗培养 4 天 ( 如图 3-B 所示 )。 0082 2. 转基因植株的再生 说 明 书 CN 104004755 A 9 7/10 页 10 0083 共培养结束后的外植体， 用液体芽诱导培养基 B5 培养基 +1.67mgL-16- 苄基 氨基嘌呤 +500mgL-1羧苄青霉素 +3 (w/v) 蔗糖 +3m。
48、molL-1MES， pH5.6 摇动洗涤 4-5 次除去表面多余菌体， 将外植体近轴面向上接种于固体芽诱导培养基 ( 液体芽诱导培养基 +0.8(w/v)琼脂)。 25光照(16h光照/8h黑暗， 光照强度为90mol m-2s-1)培养10天。 10 天后， 外植体接种于芽诱导筛选培养基 ( 芽诱导培养基 +4mgL-1的双丙氨磷 )， 筛选培 养 4 周， 每 2 周继代一次。 0084 培养 4 周后， 将有丛生芽分化的外植体 ( 如图 3-C 所示 )， 接种到芽伸长培养基 MS 培养基 +1mgL-1玉米素 +0.5mgL-1赤霉素 +0.1mgL-1吲哚乙酸 +100mgL-1焦谷 氨酸 +50mgL-1L- 天冬酰胺 +300mgL-1羧苄青霉素 +2mgL-1双丙氨磷 +3 (w/v) 蔗糖 +3mmolL-1MES+0.8 (w/v) 琼脂， pH5.6 上进行培养， 每隔两周继代 1 次， 培养约 6-8 周。 0085 待芽伸长至 3-4cm 时 ( 如图 3-D 所示 )， 用手术刀从基部切下， 转入生根培养基 1/2B5 培养基 +0.5mgL-1IBA+3 (w/v) 蔗糖 +0.8 (w/v) 琼脂， pH5.6， 根长至 1-2cm 长时 ( 如图 3-E 所示 )， 驯化移入温室，。