小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TAMSRA41及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 104087600 A (43)申请公布日 2014.10.08 CN 104087600 A (21)申请号 201410313383.8 (22)申请日 2014.07.02 C12N 15/53(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 陈凡国 李翔 丁鹏程 张尚立 夏光敏 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMs。

2、rA4.1 及 其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种小麦山融 3 号甲硫氨酸亚 砜还原酶基因 TaMsrA4.1。本发明还公开了所述 基因 TaMsrA4.1 在拟南芥和小麦植株中提高其抗 盐性的应用。 实验结果表明， 本发明所述转基因植 株比非转基因植株的抗盐能力得到了很大程度的 提高， 为通过基因工程手段提高作物抗盐性提供 了理论依据和实践基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104087。

3、600 A CN 104087600 A 1/1 页 2 1. 一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1， 其特征在于 ： 所述基因 cDNA 的核苷 酸序列如 SEQ ID No.1 所示。 2.如权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1， 其特征在于 ： 所述小麦 是山融 3 号小麦。 3.权利要求1所述小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因TaMsrA4.1在提高植株抗盐性中的应 用。 4. 如权利要求 3 所述的应用， 其特征在于 ： 所述植株是小麦或拟南芥。 权 利 要 求 书 CN 104087600 A 2 1/10 页 3 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsr。

4、A4.1 及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物基因工程技术领域， 尤其涉及一种小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1 及其应用。 背景技术 0002 高盐是限制植物生长发育和相关产量的重要因素。因此， 发掘和鉴定抗盐相关基 因用于农作物改良是育种科学家考虑的关键问题之一。甲硫氨酸亚砜还原酶 (Methionine Sulfoxide reductase， Msr) 家族基因能被多种非生物胁迫诱导表达。在植物体内， Msr 不 但可以清除机体内过量的活性氧 (Reactive oxygen radical species， ROS)， 而且可以体 外催化因 ROS 氧化的 R 和。

5、 S 型的 MetSO 还原为 Met， 这些证据表明 Msr 在植物胁迫应答中可 能发挥重要作用。 0003 小麦是世界上最为重要的甜土粮食作物之一， 不耐盐碱。不过近年来世界范围内 的土壤盐渍化加剧， 严重限制了作物生长发育和产量。因此加强小麦应对耐盐的能力是扩 大小麦种植范围和提高小麦产量最为有效的途径之一。 本实验室前期将小麦近缘禾草中耐 逆性极强的长穗偃麦草的染色质渐渗入小麦济南 177 的基因组， 创制了一批抗逆新种质资 源并从中选育出高产 / 耐盐小麦新品种山融 3 号 (SR3)。前期的盐旱处理 SR3 幼苗构建的 cDNA芯片显示其中的TaMsrA4.1有显著响应。 尽管Ms。

6、rA家族基因在拟南芥、 水稻以及一些 其他植物中抗胁迫方面的作用已有初步结果， 但在主要粮食作物小麦中该家族基因特别是 TaMsrA4.1 基因的克隆、 功能验证尚未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一个抗盐相关基因 - 小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1， 以及利用该基因在提高植株抗盐性中的应用。 0005 本发明的技术方案是 ： 从小麦山融 3 号 (SR3) 中分离得到小麦甲硫氨酸亚砜还原 酶基因 TaMsrA4.1， 首先在拟南芥中验证其功能， 随后在小麦中证实其提高抗盐性。 0006 本发明所述的小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1， 其特征在于 。

7、： 所述基因 cDNA 序列如 SEQ ID No.1 所示。其中， 所述小麦是山融 3 号小麦。 0007 本发明在小麦中克隆的甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1 与其他物种中的 类似基因相比同源性在 60 79之间。对其保守区分析发现， 小麦中甲硫氨酸亚砜 还原酶基因 TaMsrA4.1 推导的氨基酸序列含有类似 “GCFWG”的保守序列和位于 C 端的 “KGCNDPIRCYG” 保守序列， 这其中的三个 Cys 是酶的热稳定性和催化活性所必须。和其它 同类基因相比， 也存在N-和C-端的较高的变异性， 这暗示在小麦中该基因存在功能上的分 化。 0008 本发明所述小麦甲硫氨酸亚。

8、砜还原酶基因 TaMsrA4.1 在提高植株抗盐性中的应 用。 0009 实验证实 ： 在盐处理下， 转入本发明所述基因 TaMsrA4.1 的植株过表达系生长状 说 明 书 CN 104087600 A 3 2/10 页 4 况和根长比野生型生长更好， 说明该基因的转化的确增强了植株 ( 拟南芥和小麦 ) 抗盐的 能力。 0010 本发明的有益效果 ： 利用现有的植物基因工程技术， 本发明首次克隆得到了小麦 SR3 甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1 并进行了功能验证。实验发现该基因与抗盐性密 切相关。故对于该基因 TaMsrA4.1 的研究具有重要理论意义和应用前景。 附图说明 0。

9、011 图 1 ： TaMsrA4.1 基 因 的 cDNA 电 泳 图，其 中 ： M 为 DNA Marker，泳 道 1-2 为 TaMsrA4.1 的 cDNA， 泳道 NC 为阴性对照， 水为模版。 0012 图 2 ： 转 TaMsrA4.1 基因的拟南芥转基因植株筛选， 绿苗为转基因植株。 0013 图 3 ： 甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1 在转基因拟南芥中 RealTime-PCR 表达 分析， Clo-0 为野生型拟南芥， OE1 和 OE2 为不同转基因纯系， Actin 为内标对照。 0014 图 4 ： 转基因的拟南芥中 NaCl 处理分析， WT 为野生。

10、型， OE1 和 OE2 为过表达系。 0015 图 5 ： 转基因小麦 PCR 筛选电泳结果， NC 为阴性对照， M 为 DNA Marker， 其余为检 测的转基因小麦。 具体实施方式 0016 实施例 1、 TaMsrA4.1cDNA 的克隆 0017 1.1SR3 小麦总 RNA 的提取 0018 (1) 将生长到 2 叶一心期小麦剪碎放入研钵中， 加入液氮覆盖材料后将其研磨成 粉 ； 0019 (2) 一旦液氮挥发后， 立即取约 200mg 粉末转入 1.5ml 离心管中， 加入 1ml TrizolRNA 提取液， 涡旋震荡充分混匀于室温静置 5min ； 0020 (3)4， 。

11、12000rpm 条件下离心 10min， 取 0.9ml 上清液移入另一个 1.5ml 离心管 中， 加入 0.2ml 氯仿剧烈振荡 15sec 混匀后于室温静置 5min ； 0021 (4) 在 4， 12000rpm 条件下离心 10min， 取 0.4ml 上清液移入新的 1.5ml 离心管 中， 取 0.4ml 异丙醇加入后混匀于室温静置 15mim ； 0022 (5)4， 12000rpm 条件下离心 10min， 弃上清后用 1ml75的乙醇连续洗涤两次， 4， 8000rpm 条件下离心 5min ； 0023 (6) 弃上清， 在超净工作台中干燥 RNA5min， 加入 。

12、40l RNase-Free 水， 在 60中 溶解 RNA10min ； 0024 (7) 用紫外分光光度计测 RNA 样品的浓度和质量， A260/A280达到 1.7-2.0 为好 ； 再 利用 1.2的琼脂糖凝胶标准电泳检测提取 RNA 的质量。 0025 1.2 合成 TaMsrA4.1cDNA 第一链 0026 (1) 向离心管中依次加入下列物质 (40l 体系 ) ： 0027 说 明 书 CN 104087600 A 4 3/10 页 5 0028 (2) 轻混后于 65下变性 5min， 立即冰浴 1min ； 0029 (3) 之后立即向离心管中依次加入下列试剂 ： 003。

13、0 0031 0032 (4) 轻混后于 42恒温水浴 1h， 之后 65下变性 10min， 于 -20下储存备用。 0033 1.3PCR 反应合成 TaMsrA4.1 的 cDNA 0034 TaMsrA4.1-F ： 5GGACTGACTGAGCCGACGAAGCATC 3 0035 TaMsrA4.1-R ： 5GGTCAGGTCACCAGGCTCGTTCATC 3 0036 (1)PCR 反应体系 (20l) ： 0037 0038 PCR 反应条件如下 ： 0039 0040 反应结束后， PCR 产物于 0.8琼脂糖凝胶电泳检测， 获得了预期大小的电泳条 带， 结果如图 1 所。

14、示。 说 明 书 CN 104087600 A 5 4/10 页 6 0041 (2) 克隆基因片段的纯化回收 ( 使用 DP209 试剂盒以及标准程序 ) 0042 将切下带有目的片段的凝胶放入 1.5ml 离心管并称重， 加入 3 倍体积的溶胶液于 60温育 10min， 期间不断轻摇 ； 凝胶完全融化后， 全部吸取到回收柱中， 放置片刻 ； 室温， 12000rpm， 离心 30sec， 弃溶液 ； 在柱中加入 700l 漂洗液， 12000rpm 下离心 1min， 弃漂洗 液 ； 在柱中加入 500l 的漂洗液， 于 12000rpm 离心 1min， 弃漂洗液 ； 空柱， 1200。

15、0rpm， 离心 2min ； 回收柱开盖晾干1-2min， 放入新的干净的1.5ml离心管， 加入60预热的40l灭菌 水或者 EB 缓冲液， 放置 2min ； 12000rpm 离心 1min， 所得溶液中含有回收的目的片段。 0043 1.4 目的片段的连接和转化 E.coli DH10B 0044 (1) 连接 ： 上述回收的目的片段与 pEasy-T1simple 载体连接。连接体系需要 1lpEasy-T1simple 载体， 4l PCR 回收产物 ( 含目的片段 100 200ng) 的比例， 混匀后 短暂离心， 于 25-30连接 20min。得到重组质粒用于后面的反应。 。

16、0045 (2) 转化 ： 重组体转化使用热击法转化 E.coli DH10B( 试剂购自鼎国生物技术有 限公司， 北京 )。在无菌条件下吸取 100l 感受态细胞加入预冷灭菌的 1.5ml Eppendorf 管中， 加入 10l 连接产物 (1.4 中的重组质粒 )， 轻轻混匀， 立即置于冰上 30min ； 在 42 恒温水浴中热激90sec ； 冰浴5min ； 加入800l不含抗生素的LB液体培养基， 混匀， 37振 荡复苏培养 60min ； 短暂离心收集菌体， 用 150l LB 液体培养基重悬菌体， 转至含抗生素 Amp、 X-gal、 IPTG 的 LB 固体平板上， 用无菌。

17、涂布棒涂布 ； 将平板于 37正向放置 30min 至 液体被吸收， 倒置平板， 于 37培养 16h， 观察平板会有蓝白菌斑发生。白斑用于后面的阳 性重组子的鉴定工作。 0046 1.5 阳性重组子的鉴定 0047 (1) 首先用碱裂解法提取含有重组子的白色菌落 0048 挑取白色单菌落， 接入含抗生素 Amp(50mg/L) 的 3ml LB 液体培养基中， 37震荡 培养 12-16h ； 之后在 12000rpm 下离心 30sec， 弃上清 ； 加入 100l 冰预冷的溶液 I， 在涡 旋器上使菌体充分重悬 ； 加入 200l 溶液 II， 立即将离心管缓缓颠倒数次， 冰浴 10mi。

18、n ； 加入 150l 冰预冷的溶液， 缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成， 冰浴 10min ； 12000rpm 离心 3min， 取上清转入新离心管中， 加入 2 倍体积 95乙醇， 混匀后， 室温静置 3min ； 12000rpm 离心 3min， 使质粒 DNA 沉淀 ； 弃上清， 取 200l TE 溶液溶解沉淀 ； 加入 等体积冰预冷的 5mol/L LiCl 溶液， 冰浴 5min， 沉淀大量 RNA ； 12000rpm， 离心 3min ； 转移 上清到另一离心管中， 加入 2 倍体积的 95乙醇， 混匀后于室温静置 3min， 12000rpm 离心 3min 使质。

19、粒沉淀 ； 弃上清后用 1ml70乙醇洗涤沉淀， 弃尽液体 ； 室温干燥后， 取 20l 含 RNaseA(20g/ml) 的 TE 溶液溶解沉淀， 37水浴 60min 消化残存的 RNA ； TE 溶液将总体积 补充至 200l， 加入等体积的酚 - 氯仿 - 异戊醇， 充分振荡 10min， 12000rpm 离心 5min ； 取 上清， 加入等体积的氯仿-异戊醇， 重复以上操作 ； 取上清， 加入1/10体积的3mol/L醋酸钠 (pH5.3) 和 2 倍体积的无水乙醇 , 混匀后 -20放置 15min 后 ,12000rpm 离心 3min 使质粒 沉淀 ； 弃上清用 1ml70。

20、乙醇洗涤沉淀， 弃液体 , 用 40l 无菌水溶解沉淀。所提取质粒用 于后面的酶切反应。 0049 (2) 酶切验证重组质粒 0050 酶切反应体系如下 ： 0051 重组质粒 16l 说 明 书 CN 104087600 A 6 5/10 页 7 0052 EcoRI 2l 0053 10Buffer 2l 0054 将上述反应体系混匀并 5000rpm 离心 1min， 37水浴反应过夜， 然后进行 1的 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测， 结果发现所提取质粒大小符合所克隆基因的预期长度。 0055 1.6cDNA 测序和基因命名 0056 将酶切验证正确的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)。

21、的液体LB摇过夜， 然后送上海 博亚生物技术有限公司测序， 得到全长基因 cDNA 序列如序列表 SEQ ID No.1 所示。 0057 经过NCBI blast分析， 与拟南芥和水稻来源的甲硫氨酸亚砜还原酶基因MsrA4存 在保守序列的相似性， 初步命名为小麦甲硫氨酸亚砜还原酶基因 TaMsrA4.1。 0058 实施例 2、 在拟南芥中对 TaMsrA4.1 进行功能验证 0059 2.1 植物过表达载体的构建 0060 (1)设计引物 ： pSTART载体是常见的双元载体， 其含有的T-DNA序列经过农杆菌转 化， 可以整合到拟南芥的染色体组上， 并大量表达。根据其物理图谱及限制性内切。

22、酶位点， 正向引物增加 Xba I， 反向引物增加 BamH I， 设计引物进行扩增 ： 0061 TaMsrA4.1-F-PSTART ： 5TCTAGAATGCCTCCCCTCCTCACCTCAC 3 0062 TaMsrA4.1-R-PSTART ： 5GGATCCTCCATAGCAGCGGATGGGG 3 0063 (2)PCR 反应与连接和转化 ： 除反应模版为含有 TaMsrA4.1 的重组质粒外， 反应体 系和条件同 1.3(1) ； 电泳回收目的片段的方法同 1.3(2) ； 回收片段与 pEasy-T1 连接后转 化大肠杆菌， 阳性重组子鉴定并提取质粒。连接和转化方法同 1.。

23、4， 阳性重组子鉴定和质粒 提取方法同 1.5 ； 0064 (3) 克隆质粒和 pSTART 空载体质粒用相应合适的内切酶进行酶切 ( 引物上引入 的 )， 电泳后回收载体线性片段和目的片段 ； 酶切方法同 1.5， 片段的回收同 1.3(2)。 0065 (4) 使用 T4DNA ligase 把目的基因连入切好的 pSTART 空载体 ； 连接方法同 1.4。 0066 (5) 连接产物热激法转化 E.Coli DH10B 感受态细胞 ； 转化方法同 1.4。 0067 (6) 阳性重组子的酶切验证方法同 1.5。 0068 构建好的双子叶植物表达载体命名为 pSTART-TaMsrA4。

24、.1。 0069 2.2 植物表达载体转化农杆菌 0070 (1)无菌操作制备农杆菌感受态 ： 取保存的农杆菌GV3101接种于10ml YEP液体培 养基中， 28摇床过夜 ； 之后按 1 50 接种于 50ml YEP 液体培养基中， 28振荡培养 3-4 小时， 至 OD600值为 0.4-0.6 ； 4， 4200rpm， 离心 10min， 收集菌体 ； 弃上清， 加入 10ml 预冷 的 0.15M 的 NaCl 悬浮菌体 ； 4， 4200rpm， 离心 10min， 收集菌体 ； 弃上清， 加入 2ml 预冷的 20mM 的 CaCl2悬浮菌体， 分装于 1.5ml 离心管中，。

25、 现用或加入终体积 7 DMSO 经液氮速冻 后 -80保存备用。 0071 (2) 无菌操作下进行农杆菌转化 ： 将 10l 植物表达载体质粒 DNA 加入 50l 的 感受态细胞中， 轻弹离心管混匀， 冰浴 30min ； 液氮速冻 1min ； 然后 37水浴 5min， 立即冰 浴2-3min ； 加入1ml YEP培养基， 28培养2-4h ； 室温， 4000rpm， 离心3min， 收集菌体 ； 将菌 涂布于含有相应抗生素的 YEP 培养平板上， 28倒置培养 48h。 0072 (3) 阳性菌落的 PCR 验证 ： 用菌落 PCR 技术， 反应体系如下 (20l) ： 0073。

26、 说 明 书 CN 104087600 A 7 6/10 页 8 0074 0075 扩增条件 ： 0076 0077 反应结束后， PCR 产物在 0.8 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测， 结果表明 PCR 产物长度 与所插入基因 TaMsrA4.1 长度一致。 0078 2.3 浸花法转化拟南芥 0079 首先将待灭菌 Col-0 拟南芥种子放入 1.5ml 离心管中， 加入 1ml75的乙醇震荡 灭菌 1min， 接着 70的乙醇灭菌两次各 1min， 之后用吸头将种子吸到无菌滤纸上晾干， 之 后用灭菌牙签将其点入1/2MS培养基中 ； 至抽苔1cm时将顶端减掉以诱导侧生花序的生成 ； 在转。

27、化前一天， 取 1ml 活化过的含有表达载体质粒的农杆菌加到含相应抗生素及 50g/ ml 利福平的 40ml YEP 培养基中， 28震荡培养至 OD600约为 1.0-1.2 ； 室温， 4200rpm, 离心 10min， 收集菌体， 用浸染液 (5蔗糖， 0.05 Silwet L-77) 重悬菌体， 使 OD600约为 0.8 ； 用 移液器将含有重组质粒的农杆菌滴到花序上， 侵染后立即将拟南芥放入真空干燥器中抽真 空 1min ； 用保鲜袋覆盖花序， 于 20-22避光培养一天剪开顶部露出花序， 再培养一天后揭 去保鲜袋， 培养至种子成熟。 0080 2.4 转基因纯系的获得 00。

28、81 对收获的 T0代种子进行表面灭菌， 然后均匀涂布于 1/2MS 平板上 ( 含相应的抗生 素卡那霉素 )。春化处理 3 天后移入人工气候室生长。萌发约 10 天， 子叶仍为绿色的植株 为转基因植株， 未转基因的枯黄甚至死亡 ( 图 2)。将转基因植株转入土中栽培生长至收获 单株 T1代种子， 每株收取的种子继续筛选， 将后代分离比为 3 1( 阳性阴性 ) 的阳性植 株移栽后生长至收获 T2代种子， 单株收种后， 每株收取的种子经筛选可以得到纯系。2.5 转 说 明 书 CN 104087600 A 8 7/10 页 9 基因植株的 RT-PCR 检测 0082 植株总 RNA 的提取和。

29、 cDNA 第一链的合成方法参照 1.1 和 1.2。TaMsrA4.1 基因的 RT-PCR 引物序列如下 ： 0083 TaMsrA4.1-RT-F ： 5CCACCCCCTCCTCCTCGTC 3 0084 TaMsrA4.1-RT-R ： 5TGGCGATTGGGCGTGGTC 3 0085 将逆转录得到的cDNA第一链进行适当稀释并作为模板进行正常PCR扩增， 用单拷 贝组成型表达的基因 TaActin 作为内参， 在 200l 离心管中加入如下物质 ： 0086 0087 0088 混匀体系并离心， 放入 PCR 仪中进行 PCR 反应。 0089 PCR 反应程序 ： 0090 。

30、0091 之后利用 1琼脂糖电泳分析 PCR 结果， 检测结果如图 (3) 所示， 表明成功获得了 转基因株系。 0092 2.6 不同盐浓度处理过表达拟南芥 0093 将灭菌后的拟南芥野生型 (WT) 及转 TaMsrA4.1 过表达系 (OE) 的种子分别点到 1/2MS 固体培养基上， 4下无光培养 3-4d， 后转移至到光照培养箱 22竖直培养 3d ； 制备 加有不同浓度的 NaCl(0,80mM,130mM) 的 1/2MS 固体培养基 ； 将根长 0.8 1cm 且生长一致 的幼苗移入不同盐浓度 1/2MS 固体培养基中竖直培养， 要求每个培养皿中包括对照野生型 和两个独立的过表。

31、达系幼苗， 培养 10d 后拍照并统计根长， 实验重复 3 次。 0094 结果表明， 过表达系和野生型相比， 在 80mM 和 130mM 浓度 NaCl 下显著增强了对盐 胁迫的抗性 ( 图 4)。 0095 实施例 3、 在小麦济南 17 中过表达甲硫氨酸亚砜还原酶 TaMsrA4.1 0096 3.1 种子灭菌 ： 取济南 17 种子， 在超净工作台上以 75乙醇浸泡 1min， 无菌水洗 说 明 书 CN 104087600 A 9 8/10 页 10 3 4 次， 接着用 0.1的升汞浸泡 10min， 无菌水洗 3 4 次。 0097 3.2 春化处理 ： 灭菌后的种子置于含有适。

32、量无菌水的 100mL 无菌三角瓶中， 在 28 100rpm 摇床过夜， 将露白的种子置于培养皿底用超纯水饱和的滤纸上 ； 之后放入 4 冰箱暗培养四周， 待胚芽鞘长到 1 3cm 即可切苗侵染。 0098 3.3 表达载体的构建和转化农杆菌 ： 利用 pSTART 构建载体， 方法同 2.1， 只是用 ubiquitin 启动子替换了 35S 启动子。转化农杆菌及阳性菌的鉴定同 2.2。 0099 3.4 转化小麦 ： 含有植物表达载体的农杆菌活化 ： 切苗前 3 4 天活化菌种 ( 培 养基 ： 10mLYEP+5L Kan+50L 利福平 ) ： 第一次活化用 20mL 培养基 +50。

33、 100L 菌 液保菌 ( 浓白 ) ； 第二次活化在切苗前一天晚上， 用 100mL 三角瓶将第一次活化后菌液 450L+40 60mL 培养基过夜摇至 OD 略大于 1.0。取 1ml 活化至 OD6oo达 1.0 的农杆菌 菌液 ,10000rpm 离心 30s, 弃上清后加入乙酰丁香酮使其终浓度达到 200M, 加入无菌水 10ml, 置于冰上备用。切苗和农杆菌转化 : 首先将胚芽鞘长至 1 3cm 的幼苗从根部开始 下刀 , 斜切暴露幼苗茎端生长点 ； 接着用微量注射器吸取 4L 菌液 , 滴于暴露的生长点 ； 将处理后的幼苗置于己灭菌的培养皿中， 室温培养至小麦健壮后移栽于土壤中，。

34、 在植株开 花前将每株麦穗进行套袋隔离。 0100 3.5转基因小麦阳性株系的确定 ： (1)待测植株基因组DNA的提取(CTAB法) ： T1 T2代转化小麦长至 3 4 叶时 , 剪取 3-5cm 叶片 , 剪碎叶片后用液氮研磨成粉末， 立即转 移至 1.5ml 离心管中， 然后加入 700l65的 CTAB 提取缓冲液， 置于 65水浴保温 2h， 不时颠倒混匀。之后加入等体积的酚氛仿异戊醇 (25 24 1)， 4下 10000g 离心 10min。将液相转移至一干净离心管中， 加入等体积的氯仿 : 异戊醇 (24:1)， 4下 10000g 离心 10min。将上清转移至一干净离心管。

35、中， 加入两倍体积无水乙醇， 温和混匀， -20放置 30min 沉淀 DNA。4下 10000g 离心 10min， 弃去液体， 并用 70乙醇洗涤两次， 室温干燥 DNA 后， 加入 100l RNA 酶液， 37水浴 30min。加入 200l 无水乙醇， 温和混匀， -20放 置 30min 沉淀 DNA。4 10000rpm 离心 10min， 弃去液体， 并用 70乙醇洗涤两次， 室温干 燥 DNA 后， 加入 40l 无菌水溶解 DNA， 4保存待用。(2)PCR 法检测阳性转基因植株， 釆用 GUS 引物进行筛选 : 0101 GUSr:GACAGCAGCAGTTTCATCAA。

36、TC 0102 GUSf:ATCCCACTATCCTTCGCAAG 0103 PCR 反应体系 (20l) ： 0104 说 明 书 CN 104087600 A 10 9/10 页 11 0105 PCR 扩增条件 ： 0106 0107 0108 反应结束后， 反应液于 1 TAE 琼脂糖凝胶电泳检测 ( 图 5)， 依据电泳结果进行了 相关遗传分析， 获得了阳性小麦纯系。 0109 3.6 过表达小麦耐盐性分析 ： 用 1/2Hoagland 液体培养基 ( 配方见表 1) 培养 JN17( 对照 )， 和两个不同的转基因过表达系 OE1 和 OE2， 22长日照 ( 光照 16h/ 黑。

37、暗 18h) 条件下培养， 待材料长至两叶一心时选择生长一致的进行不同浓度 NaCl(0， 100mM， 150mM) 处理 2 周后看生长状况以及统计根长， 根长实验重复三次。结果如表 2， 可以看出在没有盐 胁迫的条件下， 对照和两个过表达系都生长良好且根长没有显著差异 ； 在不同浓度盐处理 的条件下， 过表达系的生长显著好于对照， 过表达系的根长相比于野生型差异明显， 实验结 果说明该基因在小麦中的过表增强了小麦抗盐的能力。 0110 表 1 ： 1/2Hogland 液体培养基配方如下 ： 0111 说 明 书 CN 104087600 A 11 10/10 页 12 0112 表 2 ： 过表达小麦在盐处理下根长分析 0113 说 明 书 CN 104087600 A 12 1/1 页 13 0001 序 列 表 CN 104087600 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 104087600 A 14 2/3 页 15 图 4 说 明 书 附 图 CN 104087600 A 15 3/3 页 16 图 5 说 明 书 附 图 CN 104087600 A 16 。