3氨基2羟基4苯基缬氨酰异亮氨酸的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102631664 A (43)申请公布日 2012.08.15 CN 102631664 A *CN102631664A* (21)申请号 201110076555.0 (22)申请日 2011.03.29 CGMCC No.4027 2010.07.20 201110030933.1 2011.01.28 CN A61K 38/05(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 37/04(2006.01) (71)申请人 上海来益生物药物研究开发中心有 限责任公司 地址 201203 上海市浦东新区张江牛顿路 200 号 8 号楼 5 楼 。

2、(72)发明人 饶敏 罗敏玉 阮丽军 朱丽 阮林高 夏兴 戈梅 李秋爽 杨天 (74)专利代理机构 上海华工专利事务所 31104 代理人 应云平 (54) 发明名称 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨 酸的应用 (57) 摘要 本发明涉及 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨 酰-异亮氨酸的应用， 该化合物由小链霉菌CGMCC No.4027 发酵制得， 对氨肽酶具有抑制作用， 用于 制备氨肽酶抑制剂类药物。 (66)本国优先权数据 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 7 页 (19)中华人民共和国国。

3、家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 7 页 1/1 页 2 1.3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸在制备氨肽酶抑制剂中的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于， 所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶 N 抑制剂。 3.如权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述氨肽酶抑制剂用于制备治疗肿瘤的 药物。 4.如权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述氨肽酶抑制剂用于制备辅助治疗肿 瘤的药物。 5.如权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， 所述氨肽酶抑制剂用于制备免疫增强药 物。 6. 一种氨肽酶抑制剂药物组合物。

4、， 其特征在于， 含有治疗有效量的有效成分和药学上 可接受的载体或赋形剂， 所述有效成分为 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸。 7. 如权利要求 6 所述的氨肽酶抑制剂药物组合物， 其特征在于， 所述氨肽酶抑制剂为 氨肽酶 N 抑制剂。 8.如权利要求6或7所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用， 其特征在于， 用于制备治 疗肿瘤的药物。 9.如权利要求6或7所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用， 其特征在于， 用于制备辅 助治疗肿瘤的药物。 10. 如权利要求 6 或 7 所述的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用， 其特征在于， 用于制备 免疫增强药物。 权 利 要 求 。

5、书 CN 102631664 A 2 1/6 页 3 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸的应用 技术领域 0001 本发明涉及 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸的应用。 背景技术 0002 上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司从采集自自然环境中的土壤样品 中进行微生物分离， 得到了一株新型小链霉菌 (Streptomyces parvus)， 且在其次级代谢 产物中分离出一种新的化合物 ( 专利申请号为 201010554703.0)， 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯 基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino-2-h。

6、ydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine) 具有 如下结构 ： 0003 0004 经研究该化合物能用于制备抑制革兰氏阳性菌的药物， 尤其是抑制藤黄微球菌或 枯草芽孢杆菌的药物。小链霉菌 (Streptomyces parvus) 于 2010 年 7 月 20 日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心正式保藏， 保藏号为 ： CGMCC No.4027， 保藏单位地 址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino -2-h。

7、ydroxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine) 的新的应用。 0006 本申请的发明人经过广泛而深入的研究， 在小链霉菌 CGMCC No.4027 的次级代谢 产物中分离出化合物 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino-2-hydroxy -4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)， 发现该化合物具有抑制氨肽酶的作用， 可用作氨 肽酶抑制剂。 0007 根据本发明， 所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶 N 抑制剂。 0008 根据本发明， 所述氨肽酶抑制剂用于制备治疗肿瘤的药物。 0009 根据。

8、本发明， 所述氨肽酶抑制剂用于制备辅助治疗肿瘤的药物。 0010 根据本发明， 所述氨肽酶抑制剂用于制备免疫增强药物。 0011 本发明还提供一种氨肽酶抑制剂药物组合物， 含有治疗有效量的有效成分和药学 上可接受的载体或赋形剂， 所述有效成分为3-氨基-2-羟基-4-苯基-缬氨酰-异亮氨酸。 进一步地， 所述氨肽酶抑制剂为氨肽酶 N 抑制剂。 0012 本发明提供的氨肽酶抑制剂药物组合物的应用， 用于制备治疗肿瘤的药物、 或用 说 明 书 CN 102631664 A 3 2/6 页 4 于制备辅助治疗肿瘤的药物、 或用于制备免疫增强药物。 0013 本发明的 3- 氨基 -2- 羟基 -4-。

9、 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino-2-hydroxy-4 -phenylbutanoyl-valyl-isoleucine)， 用于制备氨肽酶抑制剂类药物， 有望通过抑制氨肽 酶 N(APN) 的活性， 控制肿瘤的侵袭和转移以及血管生成， 并提高机体的免疫力。 附图说明 0014 图 1 为 HPLC 分析图。 0015 图 2 为正离子高分辨质谱图。 0016 图 3 为正离子二级质谱图。 0017 图 4 为氢谱谱图。 0018 图 5 为碳谱谱图。 0019 图 6 为 H-H COSY 谱图。 0020 图 7 为 HMBC 谱谱图。 具体实施方式 0021 以下结合。

10、具体实施例， 对本发明做进一步说明。 应理解， 以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限制本发明的范围。 0022 本发明所用的菌种为小链霉菌(Streptomyces parvus)， 已于2010年7月20日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)， 保藏号 CGMCC No.4027。 0023 以下实施例中所述斜面培养基、 所述种子培养基、 所述发酵培养基的配方 (w/v) 如下 ： 0024 斜面培养基 ： 高氏一号培养基。 0025 种子培养基 ： 葡萄糖 (2 )、 甘油 (2 )、 可溶性淀粉 (6 )、 黄豆饼粉 (5 )、 磷 酸二氢钾 (0.02 。

11、)、 七水合硫酸镁 (0.04 )， 其余为水。初始 pH 为 7.3-7.5。 0026 发酵培养基 ： 黄豆饼粉(2.2)、 糊精(3.6)、 葡萄糖(0.8)、 六水合硫酸亚铁 铵 (Fe(NH4)2(SO4)26H2O)(0.1 )， 其余为水。初始 pH 为 7.3-7.5。 0027 实施例 1 化合物的制备 0028 1.1 发酵 0029 将菌株 CGMCC No.4027 从冻干管中接种到高氏一号斜面培养基上， 于 28 -30 培养四天后， 转入装有经 121高压灭菌 30min 的种子培养基的三角瓶中， 置于摇床进行种 子培养， 其中， 摇床转速为200-230rpm， 。

12、温度为28-30， 培养时间为46-50h。 种子培养结束 后再转入装有已灭菌的发酵培养基的 5L 玻璃发酵罐内。转种量为 5， 在发酵罐内进行发 酵， 搅拌转速为400-500rpm， 温度控制在28-30， 通气量为7-9L/min， 培养4-6天后结束发 酵。 0030 1.2 分离提取 0031 将经发酵后得到的发酵液置于 4冰箱中过夜， 沉淀蛋白。之后将发酵液于 4、 4000rpm 离心 30min。弃下层沉淀， 上清液用大孔吸附树脂吸附， 大孔吸附树脂可以采用 XAD-1600， SP850， 或JD-1， 于静态或动态进行吸附皆可。 吸附后用两倍柱体积的纯水， 10， 30， 。

13、50， 75， 100乙醇依次洗脱， 粗品集中在 50乙醇洗脱液中。粗品液用旋转蒸发 说 明 书 CN 102631664 A 4 3/6 页 5 仪于 40减压浓缩， 再采用中压系统进行粗制。条件如下 ： 粗品浓缩液用 30乙腈稀释 10 倍， 12000rpm离心10min， 上清为进样样品。 上样量为15-25ml， 采用中压柱(型号 ： Biotage Si 25+M 1603-2， USA) 进行分离， 柱温自然， 流动相为 30乙腈 500ml， 等度洗脱。流速约 3-5ml/min， 样品集中于200-400ml的洗脱液中。 洗脱液用旋转蒸发仪于40减压浓缩后采 用 DIONEX。

14、P680 双元泵制备液相系统或制备型 Agilent 1100 DAD 单泵液相系统进行制备， 收集到的制备液于 40旋蒸浓缩至干获得目标化合物纯品， 得到的纯品为淡黄色粉末， 易 溶于甲醇， 乙醇， 水， 乙腈。不溶于氯仿。液相制备条件如下 ： 0032 制备柱 ： YMC CombiPreP ODS-A 5m 20250mm 0033 柱温 ： 自然 检测器 ： DAD(210nm， 223nm， 254nm， 280nm) 0034 流动相 ( 体积比 ) ： 25乙腈 +75含 0.1 TFA 的水溶液 0035 流速 ： 8ml/min 进样量 ： 60-700l 0036 等度洗脱。

15、 0037 实施例 2 化合物的结构鉴定 0038 将经制备液相系统制备收集的纯品上分析型 Agilent 1100 DAD 双元泵液相系统 进行分析， 条件如下 ： 0039 分析用柱 ： 菲罗门 C18 柱 5m 4.6250mm 0040 柱温 ： 30 检测器 ： VWD 210nm 0041 流动相 ( 体积比 ) ： 25乙腈 +75含 0.1 TFA 的水溶液 0042 流速 ： 1ml/min 进样量 ： 5l 0043 等度洗脱 0044 如图 1 所示， 目标化合物在此条件下出峰保留时间在 8.6min 左右， 除去 3min 左右 的两个溶剂峰， 纯度 95。 0045 。

16、经高分辨质谱检测 ( 图谱如图 2 所示 )， 目标化合物精确分子量为 407.2522， 分子 式为 C21H33N3O5。进一步， 经二维质谱 ( 图 3) 检测， 结合目标化合物的氢谱 ( 图 4)、 碳谱 ( 图 5) 及 COSY 谱 ( 图 6)、 HMBC 谱 ( 图 7) 进行结构分析， 核磁数据如表 1 所示。 0046 表 1 NMR 核磁数据 0047 说 明 书 CN 102631664 A 5 4/6 页 6 0048 对其结构进行分析， 确定了所有碳原子和氢原子的归属， 得到了小链霉菌的次级 代谢产物的结构如下 ： 0049 说 明 书 CN 102631664 A。

17、 6 5/6 页 7 0050 实施例 3 化合物的活性分析 0051 本实施例参照文献 J.Microbiol.Biotechnol.， 1995， 5(1) ： 36-40 报道方法对实 施例 1 2 得到的化合物 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino-2-hyd roxy-4-phenylbutanoyl-valyl-isoleucine) 进行活性分析。Bestatin 是典型的 APN 抑制 剂， 作为白血病治疗药物已经上市多年， 在本实施例中作为对照组。具体实验步骤为 ： 在 96 孔板中加入底物 (L- 亮氨酰对硝基苯胺 )100l(。

18、1mg/ml in a 0.1M Tris-HCl， pH 7.0)， 不同浓度 (0.86， 1.71， 2.57， 4.29， 8.57g/ml) 梯度的待测化合物 20l(0.1M Tris-HCl， pH 7.0)， 37， 3min 反应， 再加入氨肽酶 N(L5006-25UN， Sigma) 溶液 20l(2mU， 0.1M Tris-HCl， pH 7.0)， 37， 30min 反应， 后于 405nm 波长处测定吸收值。 0052 按照如下公式计算抑制率 ： 0053 抑制率 (A-B)/A*100 0054 其中 A 为不含抑制剂的反应体系测得的吸收度， B 为含有不同浓。

19、度待测化合物的 反应体系测得的吸收度， 用 0.1M Tris-HCl， pH 7.0 的缓冲液调零， 结果如表 2 所示， 为 5 个 浓度下对照品与本发明的化合物对氨肽酶 N 的抑制率。 0055 表 2 氨肽酶 N 的抑制率 0056 化合物浓度 (g/ml) 0.86 1.71 2.57 4.29 8.57 对照组抑制率 ( ) 41.61 44.37 47.13 52.65 66.45 实验组抑制率 ( ) 42.02 51.40 65.14 70.79 77.91 0057 从上表可以看出， 本发明从小链霉菌 CGMCC No.4027 的次级代谢产物中分离出的 化合物 3- 氨基。

20、 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸 (3-amino-2-hydroxy-4-phenylbuta noyl-valyl-isoleucine) 具有氨肽酶 N 抑制活性， 且在同浓度下对氨肽酶 N 的抑制活性比 Bestatin 好。 0058 氨肽酶 N(APN) 是一种含锌离子的膜结合型外肽酶， 在肿瘤细胞表面有大量的 APN 表达。 对原发肿瘤和继发肿瘤的生长， 和血管生成密切相关， 甚至对肿瘤细胞的增殖分化过 程也起促进作用。对恶性肿瘤细胞的侵袭和转移过程起重要作用， 可使细胞基质 (ECM) 的 主要成分降解， 促进肿瘤细胞的生长和转移， 另外， 它还能够表达于。

21、抗原递呈细胞表面， 降 解多种免疫活性物质， 使机体免疫力下降， 削弱巨噬细胞和 NK 细胞对肿瘤细胞的识别和杀 伤能力。因此， 通过抑制 APN 的活性可以对肿瘤的侵袭和转移以及血管生成进行干预， 同时 增强粒细胞的趋化性， 提高机体的免疫力。 APN已经成为抗肿瘤抗病毒药物发挥作用的一个 重要靶点， 开发高效低毒、 高选择性的 APN 抑制剂， 可用于治疗肿瘤。Bestatin 是从橄榄网 状链霉菌 (Streptomyces olivoreticuli) 的培养液中发现的具有氨肽酶抑制活性的化合 物， 作为APN抑制剂类抗肿瘤药物于1987年上市， 对急性白血病、 恶性黑色素瘤等有显著疗。

22、 效。 0059 由本实施例的实验结果可知， 与 Bestatin 相比， 化合物 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯 基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸对氨肽酶 N 的抑制活性更好， 能作为氨肽酶抑制剂， 用于制备治疗肿 瘤、 或辅助治疗肿瘤、 或增强免疫药物。 进一步地， 本领域技术人员可知， 这些药物中除了包 说 明 书 CN 102631664 A 7 6/6 页 8 含治疗有效量的 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸外， 还能包含药学上可接受 的载体或赋形剂、 如溶剂、 稀释剂等， 3- 氨基 -2- 羟基 -4- 苯基 - 缬氨酰 - 异亮氨酸与一种 或多。

23、种药学上可接受的载体或赋形剂混合， 从而形成药物制剂， 用于治疗肿瘤、 或辅助治疗 肿瘤、 或增强免疫。 说 明 书 CN 102631664 A 8 1/7 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 9 2/7 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 10 3/7 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 11 4/7 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 12 5/7 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 13 6/7 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 14 7/7 页 15 图 7 说 明 书 附 图 CN 102631664 A 15 。