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1、(10)申请公布号 CN 102657637 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102657637 A *CN102657637A* (21)申请号 201210160175.X (22)申请日 2012.05.22 A61K 31/137(2006.01) A61P 3/00(2006.01) A61P 3/04(2006.01) (71)申请人 重庆工商大学 地址 400067 重庆市南岸区学府大道 19 号 (72)发明人 郑旭煦 王道庆 陈刚 殷钟意 邓小红 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限 公司 11227 代理人 冯琼 (54) 发明名称 辛弗林的新。
2、应用 (57) 摘要 本发明涉及医药领域， 公开了辛弗林的新应 用， 即辛弗林在制备神经介素 U2 受体激活剂中的 应用。本发明在 NMU2R 细胞株和阴性细胞株培养 液中加入辛弗林， 比较报告基因的表达， 证明辛弗 林对 NMU2R 具有激活效应。本发明用针对 NMU2R 的 siRNA 转染 NMU2R 细胞， 用干扰效率较高的干 扰质粒转染 NMU2R 细胞对辛弗林进行荧光响应检 测， 进一步证明辛弗林对NMU2R具有激活效应。 因 此本发明提供了辛弗林在制备神经介素 U2 受体 激活剂的应用。同时本发明还提供一种调节能量 平衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物制剂， 其由有 效量的辛弗林和。
3、药学上可接受的辅料组成。其中 所述调节能量平衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物 制剂为减肥药。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 辛弗林在制备神经介素 U2 受体激活剂中的应用。 2. 一种调节能量平衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物制剂， 其特征在于， 由有效量的辛 弗林和药学上可接受的辅料组成。 3.根据权利要求2所述药物制剂， 其特征在于， 所述调节能量平衡和/或治疗代谢性疾 病的药物制剂为减肥药。 4. 根据权利要求 2。
4、 或 3 所述药物制剂， 其特征在于， 所述药物制剂为口服液或注射剂。 权 利 要 求 书 CN 102657637 A 2 1/5 页 3 辛弗林的新应用 技术领域 0001 本发明属于医药领域， 尤其涉及辛弗林在制备神经介素 U 2 受体激活剂中的应 用。 背景技术 0002 神经介素 U (Neuromedin U， NMU） 是一种神经调节肽， 不同物种的 NMU 具有不同 的形式， 人的 NMU（Neuromedin U-25） 由 25 个氨基酸组成， 广泛分布在下丘脑、 脑回、 垂体 和延髓等中枢神经系统以及胃肠道和泌尿生殖系统等外周器官中， 同时在胎盘、 前列腺、 脾 脏、 淋。
5、巴组织和脂肪组织中也均有所表达。 0003 NMU 的主要生理功能表现为刺激平滑肌收缩、 抑制摄食、 调节能量平衡、 抑制胃酸 分泌、 延缓胃排空和参与下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的调节等多种功能。1985 年， NMU 首次发 现和分离于猪的脊髓中， 并因其对子宫平滑肌的收缩作用而命名。之后， 研究者发现， 向下 丘脑注射 NMU， 可迅速降低大鼠的摄食量， 而向中枢注射抗 NMU 的血清能够增加大鼠的摄食 量， 且 NMU 基因敲除的小鼠表现为肥胖， 运动量降低。后来通过进一步研究发现， NMU 的摄 食行为和能量平衡调节作用是通过下丘脑特异性核团进行的。 0004 神经介素U2受体(N。
6、euromedin U2 Receptor， NMU2R)主要分布在大脑中枢神经系 统的特定区域， 尤其在黑质、 延髓、 脑桥的网状结构、 脊髓和丘脑， 在海马、 下丘脑和大脑皮 质也有大量的分布。NMU2R 在一些脑区的特殊区域， 如海马的 CAI 脑区、 下丘脑的特异性核 团室旁核和第三脑室壁均有高效的表达。 NMU2R能识别NMU并与之结合， 并能把识别和接受 的信号正确无误地放大并传递到细胞内部， 进而引起生物学效应， 因此认为 NMU 对中枢神 经系统的生理作用是通过 NMU2R 来介导的。NMU2R 的这一生理功能使其可以作为调节能量 代谢药物的作用靶点。 0005 辛弗林， 英文。
7、名为 Synephrine， 又称辛佛宁， 对羟福林， 辛内福林， 交感醇， 脱氧 肾上腺素。辛弗林为白色结晶粉末， 有苦味， 分子式为 C9H13NO2， 分子量为 167.21， 熔点 184 -185， 易溶于水， 其分子结构式如下 ： 0006 0007 辛弗林主要存在于芸香科柑橘属 (Citrus) 植物及其栽培变种的干燥幼果或果皮 中， 常用中药陈皮、 青皮、 枳壳和枳实均为该属植物果皮或果实。 据文献报道， 辛弗林是枳实 中起主要药理作用的有效成分， 并且 中国药典 一部 2010 年版中也以辛弗林作为枳实的 质控指标。中医药书记载， 积实有破气消积， 化痰散痞， 理气宽中， 行。
8、滞消胀等功效。现代药 理研究表明辛弗林为肾上腺素受体兴奋剂， 对心脏受体也有一定的兴奋作用， 其主要 药理作用是收缩血管、 升高血压、 扩张气管和支气管， 还能够提高新陈代谢、 增加能量水平、 说 明 书 CN 102657637 A 3 2/5 页 4 氧化脂肪。 目前辛弗林临床主要用于治疗支气管哮喘及手术和麻醉时低血压、 虚脱及休克、 体位性低血压等。辛弗林是 21 世纪天然兴奋剂， 无任何副作用和阳性反应， 广泛用于医药、 食品、 饮料等保健行业。但是， 至今尚未见到有关辛弗林可激活 NMU2R 的报道。 发明内容 0008 有鉴于此， 本发明的目的在于提供辛弗林的新应用， 即辛弗林在制。
9、备神经介素 U2 受体激活剂中的应用。 0009 本发明首先通过 NMU2R 细胞及阴性对照细胞， 检测辛弗林的 NMU2R 活性。 0010 NMU2R细胞是能够稳定表达内源配体NMU、 且在受到NMU2R激动剂刺激后剂量依赖 地表达荧光素酶的一种稳定细胞株。NMU2R 细胞是由 NMU2R 表达质粒 （NMU2R-pCDNA3.1+） 和报告基因质粒 (3MRE/3CRE/SRE-Luciferase/pGL3) 按 1:5 比例共转染到 HEK293 细 胞中后筛选所得。 NMU2R细胞受到待测样品作用后， 可通过检测荧光素酶的响应值来判断待 测样品是否对 NMU2R 有激活效应。 00。
10、11 阴 性 细 胞 是 由 不 含 NMU2R 的 空 载 体 质 粒 （pCDNA3.1+）和 报 告 基 因 质 粒 (3MRE/3CRE/SRE-Luciferase/pGL3) 按 1:5 比例共转染到 HEK293 细胞中后筛选所得。 该细胞在受到NMU2R的内源配体NMU作用后， 其荧光素酶响应值与对照组一致， 所以称这种 不表达 NMU2R 的细胞为阴性细胞。阴性细胞可用来判断待测样品对 NMU2R 的激活效应不是 通过载体质粒和相应元件 (3MRE/3CRE/SRE） 起作用的。 0012 在一个具体实施方式中， 本发明在 NMU2R 细胞株和阴性细胞株培养液中加入辛弗 林，。
11、 比较报告基因的表达。结果显示， 辛弗林在 NMU2R 细胞株中激活报告基因大量表达， 而 在阴性细胞株中不激活报告基因表达， 证明辛弗林对 NMU2R 具有激活效应。 0013 在另一个具体实施方式中， 本发明用针对 NMU2R 的 siRNA 转染 NMU2R 细胞， 验 证辛弗林对 NMU2R 的激活效应。根据 NMU2R（AF272363）基因信息， 设计 2 条针对 NMU2R （AF272363） 基因 CDs 区的 siRNA 序列， 构建两个 NMU2R 的 siRNA 质粒， 分别转染 NMU2R 细 胞， 检测两个干扰质粒的干扰效率， 然后用干扰效率较高的干扰质粒转染 NM。
12、U2R 细胞， 再次 对辛弗林进行荧光响应检测。结果显示， 当 NMU2R 表达受到干扰时， 辛弗林激活报告基因表 达受到抑制， 进一步证明辛弗林对 NMU2R 具有激活效应。 0014 因此本发明提供了辛弗林在制备神经介素 U2 受体激活剂中的应用。 0015 本发明所述辛弗林可以通过商业渠道购买得到， 也可按照现有方法从其主要来 源 - 陈皮、 青皮、 枳壳和 / 或枳实中提取得到。 0016 由于辛弗林对 NMU2R 具有激活效应， 而 NMU2R 可作为调节能量代谢药物的作用靶 点， 辛弗林的促进新陈代谢、 增加能量水平、 氧化脂肪等药理作用可能通过 NMU2R 介导， 因 此还提供了。
13、一种调节能量平衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物制剂， 其由有效量的辛弗林和 药学上可接受的辅料组成。 0017 进一步的， 所述调节能量平衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物制剂为减肥药。 0018 本领域技术人员可将所述辛弗林直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上 可接受的各种常用辅料， 以常规药物制剂方法， 制成常用剂型如口服剂、 注射剂等剂型。所 述制剂可以通过以下方式中的适合方式给药 ： 局部给药、 静脉、 肌肉、 或输入， 或借助一种外 植的储器用药， 其中优选肌注、 腹膜内或静脉内用药方式。 说 明 书 CN 102657637 A 4 3/5 页 5 0019 本发明所述调节能量平。
14、衡和 / 或治疗代谢性疾病的药物制剂的使用剂量和使用 方法取决于诸多因素， 包括患者的年龄、 体重、 性别、 自然健康状况、 营养状况、 化合物的活 性强度、 给药时间、 代谢速率、 病程严重程度以及诊治医师的主观判断。本领域的技术人员 根据上述因素可以容易地决定使用剂量和使用方法。 附图说明 0020 图 1 示实施例 1 不同浓度的辛弗林对荧光素酶的激活效应统计图， 其中横坐标为 辛弗林的对数浓度， 纵坐标为荧光素酶响应倍数 ； 0021 图 2 示实施例 4siRNA 干扰 NMU2R 表达的 Western blot 结果图， 上面一组为 -actin 内参， 下面一组为 NMU2R 。
15、； 0022 图 3 示实施例 4siRNA 干扰 NMU2R 表达的干扰效率结果图 ； 0023 图 4 示实施例 5siRNA 干扰后样品对荧光素酶的激活效应统计图。 具体实施方式 0024 本发明实施例公开了辛弗林在制备神经介素 U2 受体激活剂中的应用。本领域技 术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。 特别需要指出的是， 所有类似的替换和 改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已 经通过较佳实施例进行了描述， 相关人员明显能在不脱离本发明内容、 精神和范围内对本 文所述的应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。 0025。
16、 为了进一步理解本发明， 下面结合实施例对本发明进行详细说明。 0026 实施例 1 ： 辛弗林在 NMU2R 细胞中的荧光响应检测 0027 用含 10%FBS 的 H-DMEM 培养液， 在 37孵箱， 5% 二氧化碳条件下培养 NMU2R 细 胞。细胞达到 7090融合后， 2.5g/L 胰酶消化， 用 3% 血清的 DMEM 培养基收集细胞并接 种于 96 孔板， 每孔细胞数为 25104个， 培养液为 90l， 孵育过夜。向每孔加入辛弗林 +Forskolin、 NMU+Forskolin、 Forskolin， 每组三个复孔， NMU 和 Forskolin 的给药浓度为 5mol。
17、/L， 辛弗林的给药浓度分别为1mol/L、 10mol/L、 100mol/L。 培养68h后， 向每 孔中加入与培养液同体积的 0.5Bright-GloTM溶液， 并用荧光检测仪测定荧光素酶响应 信号值， 用药品-Forskolin叠加作用组响应值除以Forskolin对照组响应值得到荧光素酶 响应倍数， 结果如表 1 所示。 0028 表 1 辛弗林和 NMU 在 NMU2R 细胞中的荧光响应倍数 0029 0030 由表 1 结果可见， 浓度为 10mol/L 的辛弗林对 NMU2R 细胞的激活效应与 NMU2R 的内源配体的激活效应相当， 且辛弗林对 NMU2R 细胞的激活效应呈剂。
18、量相关。 0031 实施例 2 ： 辛弗林在阴性细胞中的荧光响应检测 0032 用 3% 血清的 DMEM 培养基收转染 24h 后的阴性细胞， 并接种于 96 孔板， 每孔 说 明 书 CN 102657637 A 5 4/5 页 6 细胞数为 25104个， 培养液为 90l， 孵育过夜。向每孔加入辛弗林 +Forskolin、 NMU+Forskolin、 Forskolin， 每组三个复孔， NMU和Forskolin的给药浓度为5mol/L， 辛弗 林的给药浓度分别为10mol/L和100mol/L。 培养68h后， 向每孔中加入与培养液同体 积的 0.5Bright-GloTM溶液。
19、， 并用荧光检测仪测定荧光素酶响应信号值， 并计算荧光响应 倍数， 结果如表 2 所示。 0033 表 2 辛弗林和 NMU 在阴性细胞中的荧光响应倍数 0034 0035 由表 2 结果可见， 不同浓度辛弗林对阴性细胞的激活效应与 NMU2R 的内源配体的 激活效应相当， 且荧光响应倍数均接近 1， 表明与空白对照组 （Forskolin 组） 一致， 表明辛 弗林和 NMU 在不表达 NMU2R 的细胞株中不激活报告基因的表达。 0036 实施例 3 ： 辛弗林的效能、 半效浓度及效价强度测定 0037 用含 10%FBS 的 H-DMEM 培养液， 在 37孵箱， 5% 二氧化碳条件下培。
20、养 NMU2R 细 胞。细胞达到 7090融合后， 2.5g/L 胰酶消化， 用 3% 血清的 DMEM 培养基收集细胞并接 种于 96 孔板， 每孔细胞数为 25104个， 培养液为 90l， 孵育过夜。向每孔加入辛弗 林 +Forskolin、 NMU+Forskolin、 Forskolin， 每组三个复孔， NMU 和 Forskolin 的给药浓度 为 5mol/L， 辛弗林的给药浓度分别为 0.001mol/L、 0.01mol/L、 0.1mol/L、 1mol/ L、 10mol/L、 100mol/L、 1000mol/L。培养 68h 后， 向每孔中加入与培养液同体积的 0。
21、.5Bright-GloTM溶液， 并用荧光检测仪测定荧光素酶响应信号值， 用药品 -Forskolin 叠 加作用组响应值除以 Forskolin 对照组响应值得到荧光素酶响应倍数， 结果如表 3 所示。 0038 表 3 不同浓度辛弗林在 NMU2R 细胞中的荧光响应倍数 0039 0040 将辛弗林浓度以 10 为底的对数 （Log10C）及荧光素酶响应倍数 (Multiple of response)S曲线拟合结果见图1， 由图1得到曲线关系式， 由关系式求出辛弗林的最大 激活效应 （效能） 、 半数有效浓度及荧光响应倍数为 2 时的效价强度， 结果见表 4。 0041 0042 表 。
22、4 表 1 辛弗林的效能、 半效浓度及效价强度 0043 待测样品 效能 半效浓度 (mol/L) 效价强度 (mol/L) 说 明 书 CN 102657637 A 6 5/5 页 7 辛弗林 7.207 6.604 0.227 0044 由表 4 结果可知， 辛弗林对 NMU2R 的激活效应的半效浓度 （EC50） 为 6.604mol/ L， 效价强度为 0.227mol/L， 有效浓度范围为 0.227mol/L1000mol/L。 0045 实施例 4 ： siRNA 干扰 NMU2R 表达的效率分析 0046 根据 NMU2R（AF272363） 基因信息， 设计 2 条针对 NM。
23、U2R（AF272363） 基因 CDs 区 的 siRNA 序列， 序列如下 ： 0047 NMU2R-1（487， GCGCAACTACCC TTTCTTGTT， 47.6%） ； 0048 NMU2R-2（790， GCCCATGTGGATCTACAATTT， 42.9%） 。 0049 构建两个干扰NMU2R表达的siRNA质粒siRNA-1和siRNA-2， 具体步骤这里不 进行详细介绍。将得到的两个质粒分别转染 NMU2R 细胞。当 siRNA 转染 24h 后， 提取蛋白。 将蛋白用 SDS-PAGE 分离后， 转印到 PVDF 膜上， 随后用 5% 脱脂奶粉的 TBST 室温封。
24、闭 1h， 然 后直接用山羊抗 NMU2R 一抗 4孵育 12h， 抗体用封闭液稀释约 5000 倍， TBST 漂洗 3 次， 每 次 15min ； 再用 HRP 标记的二抗继续孵育 1h， 抗体用封闭液稀释约 8000 倍。在显影之前用 TBST漂洗3次， 每次15min ； 再用HRP底物(Millpore)室温孵育5min后， 暗室显影。 将显影 后的PVDF膜继续用-actin一抗及对应二抗再次进行上述实验， 暗室显影后， 以-actin 蛋白为内参， 分析两条 siRNA 的干扰效率， 结果见图 2 和图 3。 0050 由图 2 和图 3 结果可知， siRNA-1 的干扰效率。
25、为 50.93%， siRNA-2 的干扰效率为 30.64%。因此选用 siRNA-1 来干扰 NMU2R 表达。 0051 实施例 5 ： 辛弗林在 NMU2R 表达受到干扰的细胞中的荧光响应检测 0052 用 siRNA-1 转染 NMU2R 细胞， 转染后 24h， 用 3% 血清的 DMEM 培养基收集细胞并接 种于 96 孔板， 每孔细胞数为 21045104个， 培养液为 90L， 孵育过夜， 以没用 siRNA-1 干扰的 NMU2R 细胞组作为对照， 再次对辛弗林和 NMU 进行荧光响应检测， 结果见图 4。 0053 图 4 结果显示辛弗林与 NMU 类似， 都出现在 NMU2R 表达受到干扰的细胞中， 其激活 报告基因的表达受到了抑制， 进一步证明辛弗林对 NMU2R 有激活效应。 0054 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出， 对 于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以对本发明进行 若干改进和修饰， 这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。 说 明 书 CN 102657637 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102657637 A 8 2/2 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 102657637 A 9 。