一种鱼蛋白水解螯合物制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102669401 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102669401 A *CN102669401A* (21)申请号 201110360779.4 (22)申请日 2011.11.15 A23J 1/04(2006.01) (71)申请人 浙江省海洋开发研究院 地址 316100 浙江省舟山市普陀区东海西路 2119 号 (72)发明人 杨会成 钟明杰 郑斌 廖妙飞 周宇芳 付万冬 傅光明 (74)专利代理机构 杭州杭诚专利事务所有限公 司 33109 代理人 尉伟敏 (54) 发明名称 一种鱼蛋白水解螯合物制备方法 (57) 摘要 本发明公开。

2、了一种鱼蛋白水解螯合物的制备 方法， 以低值海水鱼如带鱼下脚料为原料， 经过前 处理、 加入复合酶水解、 多肽螯合修饰制备同时具 有抗菌、 抗氧化和铁强化作用的鱼蛋白水解螯合 物， 产品具有纯天然的特点， 具有良好的抗氧化能 力， 对大肠杆菌， 枯草牙孢杆菌， 金黄色葡萄球菌， 沙门氏菌有显著的抗菌效果。生产过程中的无水 乙醇可以回收利用， 生产成本低， 可以实现水产品 高值化开发与高度利用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1。

3、. 一种鱼蛋白水解螯合物的制备方法， 其特征在于， 所述的制备方法步骤如下 ： a） 原料处理 ： 带鱼下脚料， 去头、 去尾、 去骨， 留取鱼肉以作备用 ； b） 前处理 ： 用清水将步骤 a 所得的鱼肉洗净， 沥干水分， 切碎后室温条件下匀浆， 冷冻 贮藏 ； c） 复合酶水解 ： 将步骤 b 所得鱼肉浆按 2-5 倍重量比加入去离子水， 调节 pH 为 6-7， 加入复合酶， 温度40-50水解， 复合酶的重量百分比为鱼肉浆的0.2%-0.8%， 水解1.5-6小 时， 水解结束后于沸水中保持 8-15min 灭酶， 冷却后抽滤， 再离心过滤， 最后超滤膜过滤水 解液去除分子量低于 10。

4、kDa 的水解产物， 收集超滤水解液于 4条件下储存 ； d） 多肽螯合物制备 ： 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH7-8.3， 按重量向 40-50 份超滤水 解液中缓慢加入 1 份质量分数为 1%-3% 的 FeCl2 溶液， 在温度 20-30， 螯合反应 20-30 分 钟， 螯合反应结束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物与初级滤液， 之后对初级滤 液进行无水乙醇分级梯度沉淀得到次级螯合沉淀物， 将以上无水乙醇分级梯度沉淀所得的 螯合沉淀物与第一次沉淀所得的初级螯合沉淀物合并 40-60下干燥 3-5h， 得到鱼蛋白水 解螯合物。 2. 根据权利要求 1 所述的一种鱼蛋白。

5、水解螯合物的制备方法， 其特征在于， 所述复合 酶由风味酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶两种以上组成， 风味酶的酶活力为40万U/克， 木瓜蛋 白酶的酶活力为 200 万 U/ 克， 中性蛋白酶的酶活力为 10 万 U/ 克。 3. 根据权利要求 2 所述的一种鱼蛋白水解螯合物的制备方法， 其特征在于， 所述复合 酶中风味酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶重量比为 1 ： 3 ： 2。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的一种鱼蛋白水解螯合物的制备方法， 其特征在于， 步骤 b 中匀浆所用仪器转速为 2000 -3000r/min。 5.根据权利要求1或2或3所述的一种鱼蛋白水解螯合物的制备方法，。

6、 其特征在于， 所 述步骤 d 中无水乙醇分级梯度沉淀分为 3 级， 乙醇的质量百分浓度分别为 60%、 80%、 95%。 权 利 要 求 书 CN 102669401 A 2 1/5 页 3 一种鱼蛋白水解螯合物制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种水解螯合物的制备方法， 尤其涉及一种鱼蛋白水解螯合物的制备 方法。 背景技术 0002 蛋白质水解物中的小分子多肽可由肠道直接吸收消化， 可作为肠道营养剂或 以流质食物形式提供给需要人群， 因此蛋白质水解物在医药、 保健食品中有广泛的应用。 因 此， 也一直都是营养研究的重要课题。蛋白质经酶催化等方法水解得到的产物称为水解蛋 白或蛋白水解。

7、物 （Protein hydrolysate） 。 0003 前一个时期对蛋白水解物的开发研究主要停留在乳蛋白、 大豆蛋白、 蛋清蛋白等 种类， 其中以乳蛋白水解物和活性肽的研究开发最为深入。 近年来， 有关动物源性水解蛋白 和活性肽的产品研究和开发日益受到重视， 如畜血、 水产蛋白等方面文章不断有报道。 因为 我国海洋生物资源蕴藏量十分丰富， 其中海洋蛋白资源种类尤其繁多， 由于海洋环境不同 于陆地环境， 为适应某些极端生存环境， 构成海洋生物的蛋白无论在氨基酸组成成分上还 是在氨基酸排列顺序上都与陆生动植物源蛋白有很大不同。因而向海洋进军， 索取海洋药 物食物、 功能蛋白和特殊活性物质， 。

8、已成为世界各沿海国家海洋开发的一项重要内容。 0004 长期以来， 带鱼 ( 产量在 100 万吨以上 ) 由于市场价格低、 加工技术水平和回收 手段落后， 其中很大一部分被直接切碎， 只是用于简单加工的养殖饵料鱼粉， 造成产品价值 利用率低， 经济效益不高， 资源浪费严重等现象， 同时由于优质蛋白质、 氨基酸、 活性矿物质 等大量营养成分流失， 更造成了环境的污染。 近年来， 鱼类资源的匮乏越来越引起人们的关 注， 而大量的鱼类下脚料因加工性能差而被抛弃， 浪费了大量的蛋白源。 同时海洋鱼类蛋白 质产生于特殊的地理环境， 所含氨基酸比值与人的肌肉成分又极为接近， 对于人体吸收利 用而言其品位。

9、极高， 因而开发鱼蛋白水解物和分离物引起了人们的广泛兴趣。 因此， 必须开 展鱼类资源特别是带鱼的精深加工， 为提高其利用价值和经济价值寻找新的途径。 0005 中国专利公告号 CN 1883289A, 公开日 2006 年 12 月 27 日， 发明名称为淡水鱼蛋 白活性多肽水解液的制备方法， 该申请案公开了一种淡水鱼蛋白活性多肽水解液的制备方 法， 通过添加动物蛋白复合酶、 风味酶进行水解， 加入酵母菌和乳酸菌发酵等五次去腥工艺 流程， 既可以彻底祛除水解液的腥味、 苦味， 又使该水解液具备了普通鱼蛋白水解液没有的 特殊香味和口感。其不足之处为， 适用于淡水鱼， 制的的水解液抗氧化性， 抗。

10、菌低。 发明内容 0006 本发明为了解决现有技术中对于海水鱼下脚料利用少， 水解液抗氧化性， 抗菌低 的缺陷， 以提供了一种同时具有抗氧化性、 抗菌和铁强化作用的鱼蛋白水解螯合物的制备 方法。 0007 本发明主要是通过下述技术方案得以解决上述技术问题的 ： 一种鱼蛋白水解螯合物的制备方法， 所述的制备方法步骤如下 ： 说 明 书 CN 102669401 A 3 2/5 页 4 a） 原料处理 ： 带鱼下脚料， 去头、 去尾、 去骨， 留取鱼肉以作备用 ； b） 前处理 ： 用清水将步骤 a 所得的鱼肉洗净， 沥干水分， 切碎后室温条件下匀浆， 冷冻 贮藏 ； c） 复合酶水解 ： 将步骤。

11、 b 所得鱼肉浆按 2-5 倍重量比加入去离子水， 调节 pH 为 6-7， 加入复合酶， 温度40-50水解， 复合酶的重量百分比为鱼肉浆的0.2%-0.8%， 水解1.5-6小 时， 水解结束后于沸水中保持 8-15min 灭酶， 冷却后抽滤， 再离心过滤， 最后超滤膜过滤水 解液去除分子量低于 10kDa 的水解产物， 收集超滤水解液于 4条件下储存 ； d） 多肽螯合物制备 ： 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH7-8.3， 按重量向 40-50 份超滤水 解液中缓慢加入 1 份质量分数为 1%-3% 的 FeCl2 溶液， 在温度 20-30， 螯合反应 20-30 分 钟， 螯合。

12、反应结束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物与初级滤液， 之后对初级滤 液进行无水乙醇分级梯度沉淀得到次级螯合沉淀物， 将以上无水乙醇分级梯度沉淀所得的 螯合沉淀物与第一次沉淀所得的初级螯合沉淀物合并 40-60下干燥 3-5h， 得到鱼蛋白水 解螯合物。 0008 作为优选， 所述复合酶由风味酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶两种以上组成， 风味酶 的酶活力为 40 万 U/ 克， 木瓜蛋白酶的酶活力为 200 万 U/ 克， 中性蛋白酶的酶活力为 10 万 U/ 克。 0009 作为优选， 所述复合酶中风味酶、 木瓜蛋白酶酶、 中性蛋白酶重量比为 1 ： 3 ： 2。 0010 作为优。

13、选， 步骤 b 中匀浆所用仪器转速为 2000 -3000r/min。 0011 作为优选， 所述步骤d中无水乙醇分级梯度沉淀分为3级， 乙醇的质量百分浓度分 别为 60%、 80%、 95%。 0012 该制备工艺为 ： 原料前处理酶解按比例加入金属搅拌调节 pH 震荡合成离心分离无 水乙醇洗涤分级沉淀抽滤鼓风干燥多肽 -Fe2+螯合物成品。 0013 其中， 步骤 c 中抽滤是为了去除水解产物中碎鱼骨和鱼刺， 离心过滤是为了去除 鱼油和未水解的鱼肉。 0014 步骤 d， 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH7-8.3， 按重量比向 45 份超滤水解液中缓 慢加入 1 份质量分数为 1%-。

14、4% 的 FeCl2 溶液， 在温度 20-30， 20-30 分钟进行螯合反应， 螯 合反应结束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物 A 和初级滤液， 之后对初级滤液进 行乙醇分级梯度沉底， 在室温下加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 60%， 沉淀后离心 10 min 获得 2 级螯合物沉淀 B 和次级滤液 ； 向次级滤液中继续加入无水乙醇， 使其质量百分浓 度达到 80%， 离心 10 min 获得 3 级螯合物沉淀 C 和三级滤液 ； 最后向三级滤出液中继续添 加无水乙醇， 使得其质量百分浓度达到 95% 以上， 室温下静置 20 min， 产生悬浮物和沉淀， 对此体系进行旋。

15、转蒸发减压浓缩， 可得 4 级螯合物沉淀 D ； 将以上 14 级螯合物沉淀于真 空条件下 （0.1 MPa） 45烘干 4h 后， 置于硅胶干燥器保存备用。 0015 其中， 风味酶是外切酶， 具有消除苦味的作用， 能水解酪蛋白， 弹性蛋白， 胶原蛋 白， 类粘蛋白和粘蛋白等 ； 木瓜蛋白酶是蛋白内切酶， 水解能力强， 作用时间长， 且价格低 ； 中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的， 属于一种内切酶， 可用于各种蛋白质水 解处理， 在一定温度、 PH 值下， 能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物， 可广泛应用于动植 物蛋白的水解， 价格适中， 水解度高。 说 明 书 CN 102669。

16、401 A 4 3/5 页 5 0016 其中， 按照标准方法测定原料的各成分 ： 水分 ： 常压直接干燥法 总灰分 ： 总灰分测定方法 粗脂肪 ： 索氏抽提法 粗蛋白 ： 微量凯氏定氮法 非蛋白氮 ： 微量凯氏定氮法 总糖 ： 蒽酮比色法 铁含量 ： 邻两氮菲法 钙含量 ： EDTA 滴定法 - 氨基氮 ： 电位滴定法。 0017 亚铁离子多肽螯合物的抗氧化、 抗菌活性测定 ： 多肽螯合物的抗氧化测定TBA 法 ： 以维生素 C、 生育酚为对比， 亚铁离子螯合物具有良好的抗氧化能力， 其抗氧化作用与 其相当 ； 多肽螯合物的抗菌活性测定牛津杯双层平板法 ： 亚铁离子螯合物对大肠杆菌， 枯草牙。

17、孢杆菌， 金黄色葡萄球菌， 绿脓杆菌进行实验， 结 构表明对革兰氏阳性菌有较好的抗菌效果。 0018 本发明的有益效果是 ： （1） 以海洋低值鱼带鱼加工后下脚料为原料， 制备同时具有抗菌、 抗氧化和铁强化作用 的鱼蛋白水解螯合物， 生产过程中的无水乙醇可以回收利用， 生产成本低， 可以实现水产品 高值化开发与高度利用 ； （2） 生产工艺技术对设备要求不高， 设备投资少， 一般水产加工企业都具备开发的条件 和能力 ； （3） 产品具有纯天然的特点， 具有良好的抗氧化能力， 对大肠杆菌， 枯草牙孢杆菌， 金黄 色葡萄球菌， 沙门氏菌有显著的抗菌效果。 附图说明 0019 图 1 是本发明抗氧化。

18、活性示意图。 0020 图中， A: 一级螯合物沉淀 ； B ： 二级螯合物沉淀 ； C ： 三级螯合物沉淀 ； D ： 四级螯合 物沉淀 ； E ： Vit.E。 具体实施方式 0021 实施例一 ： a） 原料处理 ： 带鱼下脚料， 去头、 去尾、 去骨， 留取鱼肉以作备用 ； b） 前处理 ： 用清水将步骤 a 所得的鱼肉洗净， 沥干水分， 切碎后室温条件下匀浆， 冷冻 贮藏 ； c） 复合酶水解 ： 将步骤 b 所得鱼肉浆按 3 倍重量比加入去离子水， 调节 pH 为 6.8， 加入 复合酶， 温度 45水解， 复合酶的重量为鱼肉浆的 0.5%， 复合酶由风味酶与木瓜蛋白酶组 成， 风。

19、味酶与木瓜蛋白酶的重量比为 1 ： 3， 水解时间为 4 小时， 水解结束后于沸水中保持 10 说 明 书 CN 102669401 A 5 4/5 页 6 min 灭酶， 冷却后抽滤， 再离心过滤， 最后超滤膜过滤去除分子量低于 10kDa 的水解产物， 收 集超滤水解液于 4条件下储存 ； d） 多肽螯合物制备 ： 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH7.3， 按重量比向 45 份超滤水解 液中缓慢加入1份质量分数为1%的FeCl2溶液， 在温度24， 螯合反应30分钟， 螯合反应结 束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物 A 和初级滤液， 之后对初级滤液进行无水乙 醇分级梯度沉底。

20、， 在室温下加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 60%， 沉淀后离心 10 min 获得2级螯合物沉淀B和次级滤液 ； 向次级滤液继续加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 80%， 离心10 min获得3级螯合物沉淀C和三级滤液 ； 最后向三级滤出液中继续添加无水乙 醇， 使得其浓度达到 95% 以上， 室温下静置 20 min， 产生悬浮物和沉淀， 对此体系进行旋转 蒸发减压浓缩， 可得4级螯合物沉淀D ； 将以上14级螯合物沉淀于真空条件下 （0.1 MPa） 45烘干 4h 后， 置于硅胶干燥器保存备用。 0022 实施例二 ： a） 原料处理 ： 带鱼下脚料， 去头、 去尾、 去骨，。

21、 留取鱼肉以作备用 ； b） 前处理 ： 用清水将步骤 a 所得的鱼肉洗净， 沥干水分， 切碎后室温条件下匀浆， 冷冻 贮藏 ； c） 复合酶水解 ： 将步骤 b 所得鱼肉浆按 2 倍重量比加入去离子水， 调节 pH 为 6.0， 加入 复合酶， 温度 40水解， 复合酶的重量为鱼肉浆的 0.2%， 复合酶由风味酶、 木瓜蛋白酶与中 性蛋白酶组成， 风味酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶的重量比为 1 ： 3 ： 2， 水解时间为 1.5 小时， 水解结束后于沸水中保持 8 min 灭酶， 冷却后抽滤， 再离心过滤， 最后超滤膜过滤去除分子 量低于 10kDa 的水解产物， 收集超滤水解液于 4条。

22、件下储存 ； d） 多肽螯合物制备 ： 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH7.0， 按重量比向 40 份超滤水解 液中缓慢加入1份质量分数为2%的FeCl2溶液， 在温度20， 螯合反应20分钟， 螯合反应结 束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物 A 和初级滤液， 之后对初级滤液进行无水乙 醇分级梯度沉底， 在室温下加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 60%， 沉淀后离心 10 min 获得2级螯合物沉淀B和次级滤液 ； 向次级滤液继续加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 80%， 离心10 min获得3级螯合物沉淀C和三级滤液 ； 最后向三级滤出液中继续添加无水乙 醇， 使得其。

23、浓度达到 95% 以上， 室温下静置 20 min， 产生悬浮物和沉淀， 对此体系进行旋转 蒸发减压浓缩， 可得4级螯合物沉淀D ； 将以上14级螯合物沉淀于真空条件下 （0.1 MPa） 40烘干 3h 后， 置于硅胶干燥器保存备用。 0023 实施例三 a） 原料处理 ： 带鱼下脚料， 去头、 去尾、 去骨， 留取鱼肉以作备用 ； b） 前处理 ： 用清水将步骤 a 所得的鱼肉洗净， 沥干水分， 切碎后室温条件下匀浆， 冷冻 贮藏 ； c） 复合酶水解 ： 将步骤 b 所得鱼肉浆按 5 倍重量比加入去离子水， 调节 pH 为 7.0， 加入 复合酶， 温度 50水解， 复合酶的重量为鱼肉浆。

24、的 0.8%， 复合酶由木瓜蛋白酶与中性蛋白 酶组成， 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶的重量比为 3 ： 2， 水解时间为 6 小时， 水解结束后于沸水中 保持15 min灭酶， 冷却后抽滤， 再离心过滤， 最后超滤膜过滤去除分子量低于10kDa的水解 产物， 收集超滤水解液于 4条件下储存 ； d） 多肽螯合物制备 ： 将步骤 c 所得超滤水解液调整 pH8.3， 按重量比向 50 份超滤水解 说 明 书 CN 102669401 A 6 5/5 页 7 液中缓慢加入1份质量分数为3%的FeCl2溶液， 在温度30， 螯合反应25分钟， 螯合反应结 束后， 对螯合物进行过滤， 得到初级螯合沉淀物 。

25、A 和初级滤液， 之后对初级滤液进行无水乙 醇分级梯度沉底， 在室温下加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 60%， 沉淀后离心 10 min 获得2级螯合物沉淀B和次级滤液 ； 向次级滤液继续加入无水乙醇， 使其质量百分浓度达到 80%， 离心10 min获得3级螯合物沉淀C和三级滤液 ； 最后向三级滤出液中继续添加无水乙 醇， 使得其浓度达到 95% 以上， 室温下静置 20 min， 产生悬浮物和沉淀， 对此体系进行旋转 蒸发减压浓缩， 可得4级螯合物沉淀D ； 将以上14级螯合物沉淀于真空条件下 （0.1 MPa） 50烘干 5h 后， 置于硅胶干燥器保存备用。 0024 实施例四， 。

26、通过上述实施例制的产物， 测定其抗氧化性， 采用 TBA 法即硫代巴比 妥酸法， 其抗氧化性能效果见图 1 ： B 的抗氧化活性最高， 其氧化活性 Vit.E 抗氧化活性的 92%。A 和 B 疏水性更强， 原因是 它们富含组氨酸， 且它们的螯合环增强了组氨酸咪唑环的抗氧化能力， 因此A和B可以用作 天然抗氧化剂。同 A 和 B 相比， C 和 D 具有较好的亲水性， 在水环境中可溶， 这些提示 C 和 D 可能主要由亲水氨基酸如天冬氨酸、 谷氨酸、 氨基乙酸、 丙氨酸、 苏氨酸和丝氨酸等组成， 仅 含有少量组氨酸， 所以 C 和 D 可以作为亲水性的天然抗氧化剂。 0025 通过上述实施例的产物， 测定其抗菌性， 采用牛津杯双层平板法， 其应用效果如 下 ： A 对大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 沙门氏菌和枯草芽胞杆菌无任何抗菌活性 ； 而 B 对金 黄色葡萄球菌具有较弱的抗菌活性 ； C 对上述 4 种细菌也具有微弱抗菌活性 ； D 对 4 种细菌 的抗菌活性为最高， 这种活性取决于螯合组分的亲水性， 所以在食品工业中， D 可以用作亲 水性的天然抗菌剂。 说 明 书 CN 102669401 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102669401 A 8 。