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1、(10)申请公布号 CN 102716477 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102716477 A *CN102716477A* (21)申请号 201210157195.1 (22)申请日 2003.10.08 0223355.9 2002.10.08 GB 200310101562.7 2003.10.08 A61K 39/295(2006.01) A61K 47/02(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 31/04(2006.01) (71)申请人 诺华疫苗和诊断有限责任公司 地址 英国利物浦 (72)发明人 M肯托尼 (74)专利代。
2、理机构 上海专利商标事务所有限公 司 31100 代理人 范征 (54) 发明名称 蛋白质在水溶液中的稳定性 (57) 摘要 本发明涉及蛋白质在水溶液中的稳定性。本 发明提供了一种制造抗原组合物悬浮液的方法， 该方法包括 ： (a) 在酸性环境下使用磷酸铝液混 合 B 型肝炎病毒表面抗原 HBsAg ； (b) 以任何顺序 加入白喉抗原、 破伤风抗原和百日咳抗原至液体 内 ； 并 (c) 加入 Hib- 结合抗原至液体内。本发明 还提供了用该方法制得的组合物及其应用。 (30)优先权数据 (62)分案原申请数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 4 页 (19。
3、)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 13 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种制造抗原配方悬浮液的方法， 该方法包括 ： (a) 在酸性环境下使用磷化铝液混合 B 型肝炎病毒表面抗原 HBsAg ； (b) 以任何顺序加入白喉抗原、 破伤风抗原和百日咳抗原至液体内 ； 并 (c) 加入 Hib- 结合抗原至液体内。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其中白喉抗原比破伤风和百日咳抗原先加入。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中加入了每一种抗原后都调整 pH。 4. 如权利要求 1-3 任一所述的方法， 其中在步骤 (c) 后 。
4、pH 调整至 6.0 至 7.0 之间。 5. 如权利要求 1-4 任一所述的方法， 其中该方法在 15和 30之间进行。 6. 一种配方， 其特征在于， 它用权利要求 1-5 任一所述的方法制得。 7. 一种液状配方， 它包含下列成分 ： 磷化铝、 B 型肝炎病毒表面抗原 HBsAg、 白喉抗原、 破伤风抗原、 百日咳抗原和 Hib- 结合抗原， 其中 B 型肝炎病毒表面抗原 HBsAg 被吸附至磷 化铝而 Hib- 结合抗原却不为磷化铝所吸附。 8. 如权利要求 6 或 7 所述的配方， 其特征在于， 它是一种产生免疫的配方。 9. 一种提高患者免疫反应的方法， 该方法包括给予病人权利要求。
5、 6-8 任一所述的配 方。 10. 一种药物， 其特征在于， 它含有权利要求 6-8 任一所述的配方。 11. 权利要求 6-8 任一所述的配方在制备用于治疗和 / 或预防 B 型肝炎、 白喉杆菌、 破 伤风杆菌、 百日咳杆菌和 / 或 b 型流感嗜血杆菌的药物中的用途。 12. 一种输注装置， 其特征在于， 它含有权利要求 6-8 任一所述的配方。 权 利 要 求 书 CN 102716477 A 2 1/13 页 3 蛋白质在水溶液中的稳定性 0001 本申请是申请号为 200310101562.7、 申请日为 2003 年 10 月 8 日、 发明名称为 “蛋 白质在水溶液中的稳定性”。
6、 的中国专利申请的分案申请。 技术领域 0002 本发明与蛋白质在水溶液中的稳定性有关。 背景技术 0003 在单一小瓶内混合悬浮抗原的做法很具吸引力 1， 2， 3， 但由于不同成分混合后 产生相互作用而导致问题， 液体制剂尤其如此4。 出现的问题包括抗原干扰、 抗原竞争、 抗 原降解、 抗原决定部位抑制和辅剂兼容性。混合剂的质量控制也比较困难。 0004 不过， 混合抗原并不一定有害。 例如在产生免疫制剂中混合白喉、 破伤风和百日咳 ( 英文简称 DTP) 的抗原 ( 使用整细胞 (Pw) 或无细胞 (Pa) 百日咳抗原 ) 的做法已行之多 年， 实际上， 在 DTP 进一步加入结合 B 。
7、型流感嗜血杆菌 (H.influenzae)(Hib) 囊状多糖能加 强对 Hib 成分产生的抗体反应。5。混合抗原来预防麻疹、 流行性腮腺炎和风疹 ( 英文简 称 MMR) 也是常见的。 0005 不过， 产生免疫的药品， 例如 DTP、 Hib， 灭活脊髓灰质炎病毒 (IPV)B 型肝炎病毒 (HBV) 等都有效能测验问题的报告 6。曾有报告指出关于选择混合 A 型和 B 型肝炎病毒 抗原 7 和 Hib 混合剂 8， 9 的免疫助剂问题。例如， 氢氧化铝是 DTP 抗原常用的免疫助 剂， 但 Hib 囊状多糖抗原在液体制剂中会被此盐水解 6， 10。 0006 已知一种五价 Hib+DT。
8、Pw+HBV 液体免疫配方的 HBV 成分的免疫反应由于混合制造 而降低 11， 12， 导致这一情况的可能原因是 Hib 和 DTP 成分协同抑制抗 -HBV 反应。反之， 未有报告指出一种混合 Hib+DTPa+polio+HBV 的六价液体制剂配方的免疫性受不良的影响 13。这种六价产品 HEXAVACTM 在欧洲已获核准在人体使用。 0007 本发明的目标是改善 ( 例如稳定性 ) 液体混合疫苗和制造。尤其是改进包括 HBV 抗原在内的混合产品。 发明内容 0008 本发明提供制造抗原混合物的工序， 步骤如下 ： (a) 在酸性环境下使用磷化铝液 混合 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBs。
9、Ag) ； (b) 以任何顺序加入白喉抗原、 破伤风抗原和百日咳 抗原至液体内 ； 并 (c) 加入 Hib- 结合抗原至液体内。 0009 当吸附至磷化铝免疫助剂时， HBsAg 的免疫性最佳， 但当吸附至氢氧化铝或磷化铝 时， Hib结合物会水解。 本发明的工序的优点是制造一种HBsAg被吸附至磷化铝， 而Hib-结 合物却不为磷化铝所吸附的液体制剂。本工序提供高 HBsAg 吸附能力和整体稳定性。 0010 此外， 本发明更提供一种包含磷化铝、 HbsAg、 白喉抗原、 破伤风抗原、 百日咳抗原 和 Hib- 结合抗原， 其中 HBsAg 被吸附至磷化铝免疫助剂而 Hib- 结合抗原却不。
10、为铝免疫助 剂所吸附。 说 明 书 CN 102716477 A 3 2/13 页 4 0011 混合抗原的顺序 0012 工序步骤 (a) 至 (c) 应以特定的顺序进行， 即 HBsAg 比 DTP 抗原先加入磷化铝液 内， Hib- 结合物则在加入 DTP 抗原后才加入。 0013 在步骤 (b)， 比较好的顺序是先加白喉抗原， 然后加破伤风和百日咳抗原， 但不一 定要这样做。这样可支持白喉抗原吸附至铝免疫助剂。 0014 破伤风和百日咳抗原可在步骤 (b) 内以任何顺序加入。 0015 加入每一种抗原后， 最好混合 ( 例如搅拌 ) 液体至少 10 分钟 ( 例如约 30 分钟 )。 。
11、0016 pH 和温度 0017 本发明工序的步骤 (a) 中， 磷化铝和 HBsAg 是在液状中混合。这一步骤使 HBsAg 吸附至磷化铝免疫助剂。混合时， 如果 pH 过低， HBsAg 会变性。如果 pH 太高， HBsAg 将不会 吸附至磷化铝。 0018 加入每一种抗原后， 工序可能涉及调整 pH 的步骤。在步骤 (a) 加入 HBsAg 后， 如 必要， 可调整 pH 至原来或与原来相似的 pH。在步骤 (b) 加入个别的 DTP 后， 可调整 pH。步 骤 (b) 后， 并在步骤 (c) 加入 Hib- 结合抗原前， 最好先调整 pH 大约至中性。 0019 在步骤 (c) 加入。
12、 Hib- 结合抗原后， 最好调整 pH 以便更适合病人使用。pH 最好在 7.0 以下以预防白喉类毒素转化成有毒状态。因此， pH 最好保持在 6.2 和 6.9 之间。 0020 本发明的工序最好在15和30之间进行(例如在19和27， 或在234)。 0021 磷化铝 0022 本发明的工序基础是在液状混合抗原和磷化铝。一般都称这样的液状磷化铝为 “溶液” ， 但从严格的物理化学角度来说， 此盐在水中不溶化， 并形成悬浮液。 0023 磷化铝最好使用液状， 以便加入HbsAg， 并随后加入其它抗原。 加入抗原混合物前， 最好先稀释磷化铝至要求的浓度， 确保有一个均匀的溶液。 0024 加。
13、入 HBsAg 前 Al3+的浓度通常在 0 和 10mg/ml 之间 0025 磷化铝液体可以含缓冲剂， 但并非必要。 0026 磷化铝液最好经过消毒。磷化铝不能采用过滤消毒， 最好采用高压消毒法。 0027 磷化铝液最好是无发热质。 0028 磷化铝液也可含氯化钠。 0029 B 型肝炎病毒表面抗原 0030 HBsAg 的制剂已有充分的文书说明。多种形式的抗原已有说明 ( 例如包括全部或 部分 pre-S 序列 ； 参考 14 的 L* 抗原 ； 参考 15 所述的 preSl-preS2-S 缩多氨酸或参考 16 所 述的类似物 ； 参考 17 和 18 所述的 逃跑突变体 ， 例如含。
14、 Gly145 Arg 突变的 HBsAg)。上 述任何一种都可以在本发明使用。 0031 HBsAg 可从血清或像酵母菌 CHO 细胞的真核压榨系统中压出 19。最好是从酵母 菌压出。 0032 HBsAg 通常是微粒状。最好从酵母菌榨出时就已成微粒状。 0033 HBsAg 可以灭活， 例如使用甲醛溶液处理。 0034 白喉抗原 0035 白喉抗原最好是白喉类毒素。白喉类毒素的制剂已有充分的文书说明 例如参考 20 的第 3 章 ； 参考 21 的第 9 章 。可使用任何适合的白喉类毒素。 说 明 书 CN 102716477 A 4 3/13 页 5 0036 破伤风抗原 0037 破伤。
15、风抗原最好是破伤风类毒素。破伤风类毒素的制剂已有充分的文书说明 例 如参考 20 的第 4 章 ； 参考 20 的第 18 章 。可使用任何适合的破伤风类毒素。 0038 百日咳抗原 0039 本发明使用的百日咳抗原可以是细胞 ( 例如整个细胞 ) 或非细胞抗原。两种抗原 的制剂都有充分的文书说明 例如见参考 201 的第 14 章 ； 也见参考 22。 0040 使用无细胞抗原时最好使用百日咳全毒素 (PT) 和丝状血凝素 (FHA)， 最好与附 属肌动蛋白 ( 又称为 PRN 或 69kDa 抗原 ) 混合， 并可选择性加入凝集原 ( 又称菌毛 )2 和 323。每一疫苗剂量所含百日咳抗原。
16、的一般水平为 ： 10g PT、 5g FHA、 3g PRN、 5g 混合菌毛。 0041 PT是一种有毒的蛋白质， 当在百日咳抗原中存在时， 最好加以解毒。 解毒的方法可 使用化学和 / 或基因法。最好的解毒突变体是 9K/129G 双突变体 24， 以下简称 rPT 。 0042 Hib- 结合抗原 0043 一般的多糖结合物， 尤其是 B 型流感嗜血杆菌 (Hib) 的制剂已有充分的文书说明 例如参考 25to 33 等 。本发明可使用任何适合的 Hib 结合物。 0044 结合物的糖部分可以是多糖 ( 例如全长 PRP)， 但最好使用水解多糖 ( 例如使用酸 水解 ) 形成低聚糖 (。
17、 例如从 1 至 5kDa 的 MW)。如果进行水解， 水解物可根据大小分类， 以便排除低聚糖， 这种糖太短， 不能产生免疫功能。按大小分开的低聚糖是最好的糖类抗 原。 0045 结合物的载体部分通常是一种蛋白质。最好的载体蛋白质是细菌毒素或类毒素， 例如白喉或破伤风类毒素。这些都是常用的结合疫苗。尤其最常用的是 CRM197白喉类毒 素 34， 35， 36。其它适合的载体蛋白质包括脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白质 37、 合成缩氨酸 38， 39、 热震蛋白质40， 41、 百日咳蛋白质42， 43、 流感嗜血杆菌的D蛋白质44、 细胞 活素 45、 淋巴因子 45、 荷尔蒙 45、 生长激素 4。
18、5、 艰难梭状芽胞杆菌毒素 A 或 B46 等。也可以使用混合载体蛋白质。 0046 可使用任何适当的激活化学和 / 或连接化学结合 Hib 糖。通常， 在结合前， 糖会先被激活或功能化。激活程序可能涉及， 例如 cyanylating 试剂， 如 CDAP( 例如 1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate47， 48). 其它适当的技术使 用碳化二亚胺、 hydrazides、 激活酯、 降冰片烷、 p- 硝基苯甲酸、 N- 羟基丁二醯亚胺、 S-NHS、 EDC、 TSTU ； 也请见参考 49 的简介 )。 0047 连接可。
19、通过使用任何已知的程序制造的连接组， 例如参考50和51所述的程序。 一 种连接法涉及多糖的还原胺化， 偶合所得氨基组与己二酸连接组的一端， 然后偶合一个蛋 白质至己二酸连接组的另一端 52， 53， 54。其它的连接物包括 B- 丙醯胺基 55、 乙胺硝 基苯酯 56、 卤代醯卤 57、 配糖键 58、 6- 氨基己酸 59、 ADH60、 C4至 C12部分 61 等。除了使用连接物以外， 可使用直接连接。直接连接至蛋白质的步骤可能包括氧化多糖， 然后与蛋白质还原胺化， 如参考 62 和 63 所述。 0048 最好的结合法是通过己二酸琥珀双酯共价连接 Hib 糖至 CRM19764， 6。
20、5。 0049 本发明配方的特征 0050 本发明的工序的配方包含抗原， 其中一些吸附在磷化铝免疫助剂。这些配方最好 说 明 书 CN 102716477 A 5 4/13 页 6 是产生免疫的配方。本发明的配方有预防性 ( 即预防感染 ) 或治疗性 ( 即能治疗所感染后 的疾病 ) 功能。 0051 配方最好是液体制剂 ( 即非冻干配方 )。这通常表示配方为液状， 例如悬浮液。 0052 本发明的成分最好经过杀菌消毒。 磷化铝和完整细胞的百日咳抗原都不能使用过 滤消毒， 因此， 本发明的成分最好使用高压消毒法和 / 或在制造时使用经过消毒的成分。 0053 本发明的成分最好无发热质。 005。
21、4 本发明的成分的 pH 是 6.0 和 7.0 之间。成分最好缓冲至这一 pH。 0055 本发明成分的 Al3+浓度通常在 0.1 和 2.0mg/ml 之间。 0056 成分可含氯化钠。配方内的氯化钠含量最好在 0.1 至 100mg/ml 之间。 0057 HBsAg 的含量通常是 5 和 50g/ml 之间。最理想的含量是 10 和 30mg/ml 之间。 0058 白喉类毒素的含量通常是 5 和 50Lf/ml 之间。最理想的含量是 7.5 和 30Lf/ml 之 间。 0059 破伤风类毒素的含量通常是 1 和 20Lf/ml 之间。最理想的含量是 2 和 9Lf/ml 之 间。。
22、 0060 细胞百日咳抗原的百日咳抗原通常是 5 和 50OU/ml 之间。最理想的含量是 10 和 40OU/ml 之间。 0061 Hib- 结合抗原的含量通常是 1 和 50g/ml 之间。最理想的含量是 10 和 30mg/ml 之间。 0062 配方内可能含防腐药， 例如硫柳汞。防腐药最好是低含量 ( 例如容积的 0.01 )。 这可从外源加入， 或是混合进配方内的主体抗原 ( 例如在百日咳或 HbsAg 抗原内存在的防 腐药 )。不过， 最好避免使用含水银的防腐药。 0063 其它适合人体使用的成分在参考 66 内说明。 0064 本发明的成分最好是尽量不含氢氧化铝。 0065 本。
23、发明配方内含的抗原达 有效地产生免疫的分量 ， 即该分量在人体使用时， 无 论是单一剂量或系列剂量的一部分， 都能有效地治疗或预防疾病。这一分量视接受治疗者 的健康和身体状况、 年龄、 接受治疗者的分类 ( 例如非人类灵长、 灵长等 )、 受治疗者免疫系 统合成抗体的能力、 所希望得到的保护程度、 配方的程序、 医生对病况的诊断和其它相关因 素有所改动。预期分量范围广泛， 并由常规试验确定。治疗剂量可使用单一剂量或多剂量 ( 例如包括加强剂量 )。本配方可与其它免疫调节剂并用。 0066 通常， 本发明的配方为注射制剂。本配方通常不经肠胃， 直接注射体内 ( 例如注射 至皮下、 腹膜内、 静脉。
24、内、 肌肉内或组织的间隙 )。此外， 本配方也可以在损伤的部位使用。 0067 一旦制成， 本发明的配方可直接给受治疗者使用。 受治疗者可以是动物 ； 尤其是人 类受治疗者。疫苗尤其适合为儿童和青少年进行免疫注射。 0068 已知标准动物和试管模型和评估 HBV、 Hib 和 DTP 产品的效力的相关保护。 0069 抗原吸附 0070 在本发明的配方中， HBsAg 吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是大部分完成， 例如配 方内的总 HbsAg 重量至少有 80已吸附 ( 例如至少 85、 90、 95、 98、 99或更多 )。 0071 白喉类毒素通常吸附至磷化铝。 吸附的步骤最好是部分完成，。
25、 例如配方内的总白 喉类毒素重量约有 30-80已吸附 ( 例如约 40 -70、 约 50 -60等 )。如果储存在约 说 明 书 CN 102716477 A 6 5/13 页 7 37， 白喉类毒素的吸附会随时间增加。 0072 破伤风类毒素通常吸附至磷化铝。吸附的步骤最好是部分完成， 例如配方内的总 破伤风类毒素重量40以下已吸附(例如30以下、 20以下、 10以下等)。 破伤风类毒 素的吸附水平可能约为 0。 0073 Hib- 结合物不吸附至铝免疫助剂。 0074 治疗法 0075 使用本发明的配方可提高患者的免疫反应。 0076 本发明提供的配方可作药剂使用 ( 例如作为一种产。
26、生免疫的配方 )。 0077 此外， 本发明也提供配方制造药剂来治疗和 / 或预防疾病。 0078 这些方法或用法可保护免受HBV、 白喉杆菌、 破伤风杆菌、 百日咳杆菌和/或b型流 感嗜血杆菌的感染。这些病菌可导致肝炎、 白喉、 破伤风、 百日咳和 / 或细菌脑膜炎。此方 法或用法能更好地提供保护不感染这些疾病。流感嗜血杆菌引起的其它疾病包括中耳炎、 支气管炎、 肺炎、 蜂窝织炎和心包炎。 0079 患者最好是人类。 0080 患者最好是儿童。 0081 此方法在已接受疫苗的患者中可提高加强反应。 0082 配方的单位剂量通常是 0.5ml。 0083 此外， 本发明也提供一个含有本发明配方。
27、的输送设备 ( 例如一个针筒， 或免针注 射器 )。设备最好是含有单一剂量。 0084 配方的进一步成分 0085 本发明的成分最好是五价成分 ： (1)HBsAg ； (2)Hib ； (3) 白喉 ； (4) 破伤风 ； (5) 百 日咳。不过， 本发明并不排除加入其它抗原的可能性 ( 例如产生六价、 七价、 八价、 九价、 十 价或以上的配方 )。例如， 配方可包含下列一或多种抗原 ： 0086 - 脑膜炎奈瑟球菌血清群 B 的蛋白抗原， 例如参考 67 至 73， 0087 - 脑膜炎奈瑟球菌血清群 B 的外膜泡 (OMV) 制剂， 例如参考 74， 75， 76， 77 等所述。 0。
28、088 - 脑膜炎奈瑟球菌血清群 A、 C、 W135 和 / 或 Y 的糖抗原， 如参考 78 所述， 来自血清 群 C 的低聚糖 也见参考 79 或参考 80 的低聚糖。 0089 - 来自肺炎链球菌的糖抗原 例如 81， 82， 83。 0090 - 来自 A 型肝炎病毒的抗原， 例如灭活病毒 例如 84， 85。 0091 - 脊髓灰质炎抗原 例如 86， 87 例如 OPV 或最好是 IPV。 0092 配方可能包含以上一或多种抗原。 0093 定义 ： 0094 “包含” 的意思是 “包括” 和 “组成” 例如一个 “包含” X 的配方可单独由 X 组成或可 包括一些其它成分例如 。
29、X+Y。 0095 “约” 与数值 x 的关系表示， 例如 x10。 0096 绘图简介 0097 图 1 显示本发明配方 HBsAg 稳定性的惠斯顿印迹法结果。 0098 图 2 显示本发明配方白喉类毒素的免疫扩散结果。 0099 图 3 显示本发明配方破伤风类毒素的免疫扩散结果。 说 明 书 CN 102716477 A 7 6/13 页 8 0100 图 4 显示本发明配方 pH 随时间的变化。 0101 实行发明的模式 0102 液体制剂 0103 基本制剂法 ： (1) 加入酵母压榨的 HBsAg 至磷化铝液 ； (2) 加入 D 然后 T 然后 P 抗 原 ； (3) 调整 pH 。
30、和 (4) 加入 Hib-CRM197 结合物。以下是进一步详情 ： 0104 - 先用磷化铝免疫助剂 0105 - 加入 HBsAg 液 (pH 7.0 在 PBS) 至最后浓度 20g/ml 0106 - 调整 pH 0107 - 搅拌 305 分钟 ( 让 HBsAg 吸附至免疫助剂 ) 0108 - 加入白喉类毒素至最后浓度 15Lf/ml 0109 - 搅拌 30 分钟 0110 - 加入破伤风类毒素至最后浓度 6.5Lf/ml 0111 - 搅拌 30 分钟 0112 - 加入细胞百日咳抗原至最后浓度 30OU/ml 0113 - 搅拌 30 分钟 0114 - 如必要， 调整 p。
31、H 0115 - 加入 CRM197-Hib 结合物至最后浓度 20g/ml 0116 - 搅拌 15 分钟 0117 配方的最后抗原成分主要如下 ： 0118 成分 浓度 白喉类毒素 15Lf/ml 破伤风类毒素 6.5Lf/ml 完整细胞百日咳抗原 30OU/ml HBsAg 20g/ml CRM197-Hib20g/ml( 糖 ) 0119 本配方共使用三批进行测试。 0120 稳定性测试 0121 进行测试时， 使用 3500rpm 离心分离 10ml 本配方 20 分钟， 然后使用 Millex-GV 0.22m 过滤器过滤上清液， 收集未吸附的抗原。 0122 在零时间测试过滤了的。
32、上清液是否含 HbsAg( 使用惠斯顿印迹法 )、 白喉和破伤风 类毒素 ( 使用辐射式免疫扩散 ) 和 Hib- 结合物 ( 使用 Dionex， 高速负离子交换 (HPAE) 色 谱分离法， 配合使用脉冲电流测定 (PAD)。此外， 还确定游离磷的含量。 0123 储存在 2-8或 36-38， 为期 2 周或 4 周的样品也进行同样的分析。 0124 HbsAg 惠斯顿印迹分析 说 明 书 CN 102716477 A 8 7/13 页 9 0125 HBsAg 吸附至铝免疫助剂是它产生免疫力的一个重要因素。其后的免疫印迹步骤 极为重要， 描述如下 ： 1ml 容积的制剂上清液进行 DO。
33、C-TCA 沉淀， 并使用 LSB 使变性， 然后装 入一个 12丙烯醯胺 SDS-PAGE ； 每一批 HBsAg 使用 1g 作为对照 ( 这代表 HbsAg 剂量的 5 ) ； 所使用的主要抗体是羊抗 -HBsAg 抗体 ( 稀释比例 1 1000)， 并使用抗 - 羊 POD 结 合物 ( 稀释比例 1 2500) 作为第二抗体。 0126 结果显示如图 1。图 1A 第 6-8 行显示在零时， 五价配方内并没有可检出的 HbsAg， 图 1B 和 1C 第 5-10 行核实在 2-8或 36-38储存 2 周和 4 周后仍然如此。三批不同的样 品在这些不同的情况下 99的 HBsAg。
34、 仍然吸附在免疫助剂上。 0127 在 2-8储存了 6 个月后再做稳定性测试 ( 图 1D)。三批样品， 每一种仍然保持 99吸附率。 0128 图 1 使用的正性对照含 1g HbsAg。可见一条相等于 S 缩氨酸 (24kDa) 的谱带， 和一条结合物特有的谱带 ( 45kDa)。未见 Pre-S2。 0129 白喉和破伤风的辐射式免疫扩散测试 (SRID) 0130 使用 SRID 来观察各批白喉和破伤风反应的一致性。选择一批白喉类毒素和一批 破伤风类毒素来制造标准弧线。分析白喉时在上清液内加入 10Lf/ml， 分析破伤风时加入 5Lf/ml。 0131 白喉标准弧线包括5、 10、。
35、 20、 30Lf/ml白喉类毒素。 破伤风标准弧线包括5、 10、 15、 20Lf/ml 破伤风类毒素。15l 标准样品或其它样品装入 SRID 槽内。槽的排列如下， 图显 示 Lf/ml，S 显示配方的上清液 ： 0132 0133 图 2 显示 0 时间的白喉 SRID 结果 (2A) 和在 2-8 (2B) 或 36-38 (2C)4 周后的 结果。图 3 显示 0 时间的破伤风 SRID 结果 (3A) 和在 2-8 (3B) 或 36-38 (3C)4 周后的 结果。 0134 结果使用计算机分析以便确定抗原浓度 ( 增量抗原修正 )， 并计算白喉和破伤风 成分吸附的大约 (10。
36、以内 ) 百分比。结果如下 ： 0135 说 明 书 CN 102716477 A 9 8/13 页 10 0136 游离和总糖分析 (DIONEX) 0137 抗原稳定性和疗效的一个重要参数是 Hib 结合物的水解百分比， 临床限制为 25 游离糖 ( 参考 10 报告 20未影响临床产生免疫性 )。这一参数由 DIONEX 衡量， 这一方法 允许在皮摩尔水平为非结合碳水化合物直接定量， 而尽量少需要分离和清理。分析集中在 游离糖的分量。 0138 糖测定如下 ： 0139 (a) 以 g/ml 计算的总量 0140 (b) 以 g/ml 计算的上清液 ( 即未吸附 ) 量 0141 (c)。
37、 以 g/ml 计算游离 (CRM197-Hib 结合物水解 ) 的总量 0142 (c) 值以 (d) 即 (b) 的百分比或 (e) 理论上总糖含量 (20g/ml) 的百分比。结果 如下 ： 0143 说 明 书 CN 102716477 A 10 9/13 页 11 0144 临床上最多只能接受 25游离糖。所有值都在这一定值之下， 而且在 2-8至 4 周仍在 6.5以下。在热应力条件下 (4 周， 36-38 ) 可见较高水平的游离糖， 但此值远在 25之下， 最高是第 1 批的 11.6。 0145 较早多价 Hib 抗原配方的工作显示储存在 36-38一个月所产生的 CRM-H。
38、ib 水解 比储存在 2-8两年多。因此， 可预期在正常的储存条件下， 至少 2 年的时间内所产生的水 解作用是可以接受的。 0146 此外， 储存在 2-8 6 个月后再进行游离糖的 DIONEX 分析， 数据如下 ： 0147 批 (c) (d) (e) 1 1.65 9.8 8.3 2 1.09 5.8 5.5 3 1.16 6.6 5.8 0148 6 个月与 4 周比较， 游离糖百分比的增加有限， 仍远在 25值之下。因此， 在三个 制剂中 CRM197-Hib 都非常稳定。 说 明 书 CN 102716477 A 11 10/13 页 12 0149 pH 与渗透性 0150 图。
39、 4A 三批配方储存在 2-8 6 个月的 pH 变化。图 4B 三批配方储存在 36-8 4 周 的 pH 变化。在 2-8时 pH 保持稳定 6 个月， 在热应力的条件下， 2 周后 pH 稍为下降 0.1， 4 周后再稍为下降一点。所有 pH 值都在可接受的 6.0-7.0 范围内。 0151 所有三批的渗透性都在 312 和 315mOsm/Kg 之间， 这是注射疫苗可接受范围 240-360mOsm/Kg 的中间值。 0152 效能与产生免疫力测试 0153 为了评估结合产品的疗效， 评估抗原的效能和产生免疫力极为重要。 已评估白喉、 破伤风和百日咳抗原的效能， 并测试 CRM-Hi。
40、b 和 HBsAg 产生免疫的能力。接受疫苗后进行 ELISA 分析， 以评估特定抗体的水平。HBsAg 产生免疫的能力使用小鼠模型测试， 而且免疫 时间表也与 HBV 效能测试不同。 0154 DTP 的效能值如下 ： 0155 0156 这三种抗原每一种的效能测试结果都明显地在可接受的下限之上， 这些结果显示 这三种抗原都有良好的效能。 0157 为了评估HBsAg产生免疫的能力， 在0和14天为每组10只CD1小鼠进行皮下注射 五价产品(0.5ml， 用盐水稀释的比例是14)。 在第21天为小鼠放血， 并用下列两种ELISA 之一评估HbsAg抗体 ： (a) “Enzygnost An。
41、ti-HBsII” 测验(Dade Behring)或(b) “AusabEIA” 测验 (Abbott)。这些 ELISA 测验有不同的模式， 并对 HbsAg 有不同的敏感度。因此两种测 验几何平均值 (GMT) 无法作比较。不过， 在每一种测验的范围内， 血清的 GMT 值都是最佳。 结果如下 ： 0158 0159 进行这类小鼠产生免疫力测定所得的 GMT 值比文献报告的数值高。两种抗原的反 应数都一致相当高， 在 100的最高水平。 0160 为了评估 Hib 产生免疫的能力， 在 0、 10 和 20 天为每组 8 只 CD1 小鼠进行皮下注 射五价产品 (0.5ml， 用盐水稀释。
42、的比例是 1 4)。在第 34 天为小鼠放血， 并用 ELISA 方法 评估 Hib 抗体。结果如下 ： 说 明 书 CN 102716477 A 12 11/13 页 13 0161 0162 本发明只用例子作说明， 在发明所述的范围及原则下可作修改。 0163 参考 ( 内容纳入仅供参考 ) 0164 1-Corbel(1994)Biologicals 22 ： 353-360. 0165 2-Rappuoli 等人欧洲 COST/STD 委员会， 专家小组报告 VIII 0166 3-Pichichero(2000)PediataClin North Am 47 ： 407-426. 0。
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