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一种籼稻组织培养的方法.pdf

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文档编号：4823792

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1、(10)申请公布号 CN 102715084 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102715084 A *CN102715084A* (21)申请号 201210199024.5 (22)申请日 2012.06.14 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人中国农业大学地址 100193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人付永彩王超杰杨亚萍韩冰朱颖李倩倩孙传清 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅王慧凤 (54) 发明名称一种籼稻组织培养的方法 (57) 摘要本发明公开了一种籼稻组织培养。

2、方法。本发明所提供的籼稻组织培养方法，包括下述步骤： 1）诱导籼稻愈伤组织； 2）对愈伤组织进行继代培养； 3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养；所述分化培养的培养基为基本培养基添加 a- 萘乙酸、 6-BA 和 20-40g/L 山梨醇的固体培养基。本发明的方法以生产上应用的优良籼稻品种（明恢 86、 C418、特青、 9311 和广占 63s）成熟胚为外植体，分化培养基中以 20 或 40g/L 山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高愈伤组织分化频率。本发明的方法不经过预分化，直接进行分化培养，方法简便、成本低，易操作，并可缩短组织培养周期，。

3、为有效提高籼稻遗传转化频率提供技术基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页说明书 9 页附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 2 页说明书 9 页附图 3 页 1/2 页 2 1. 籼稻组织培养方法，包括下述步骤： 1）诱导籼稻愈伤组织； 2）对愈伤组织进行继代培养； 3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养；所述分化培养的培养基为基本培养基添加 a- 萘乙酸、 6-BA 和 20-40g/L 山梨醇的固体培养基。 2. 根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于：所述分化培养的培养基中的 a- 萘乙酸。

4、添加的终浓度为（0.5-1.2） mg/L，优选为 1mg/L，所述分化培养的培养基中的 6-BA 添加的终浓度为（1.8-3.0） mg/L，优选为 2mg/L ；所述分化培养的培养基的 pH 值为 5.8-6.0，优选为 5.8-5.9。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其特征在于：所述继代培养的培养基为基本培养基添加 2,4-D 和甘露醇获得的固体培养基。 4. 根据权利要求 3 所述的方法，其特征在于：所述继代培养的培养基中 2,4-D 添加的终浓度为1.5-2.5mg/L，优选为2mg/L，甘露醇添加的终浓度为35-37g/L，优选。

5、为36.43g/L，所述继代培养的培养基 pH 值为 5.8-6，优选为 5.8-5.9。 5. 根据权利要求 1-4 中任意一项所述的方法，其特征在于：所述分化培养和继代培养的每 1L 基本培养基均由（1200-1300） mgKNO3、（590-650） mgNH4NO3、（560-590） mg CaCl2.2H2O、（220-250） mg MgSO4.7H2O、（130-150） mg KH2PO4、（27-28） mg FeSO4.7H2O、（37-38） mgNa2-EDTA.2H2O、（3-3.5） mg H3BO3、（10-11.5） mg 。

6、MnSO4.4H2O、（5.1-6.0） mg ZnSO4.7H2O、（0.75-0.85） mg KI、（0.23-0.25） mg NaMoO4.2H2O、（0.023-0.075） mgCuSO4.5H2O、（0.025-0.03） mg CoCl2.6H2O、（5-6.5） mg 烟酸、（8-10） mg 维生素 B1、（0.8-1.2） mg 维生素 B6、（80-100） mg 肌醇、（18-22） g 麦芽糖、（3-4） g 植物凝胶和水组成，用水补足体积； pH 值为 5.8-6.0 ；所述每 1L 基本培养基优选由（1200、 1212 或 1300） mg KN。

7、O3、（590、 640 或 650） mgNH4NO3、（560、 588 或 590） mg CaCl2.2H2O、（220、 247 或 250） mg MgSO4.7H2O、（130、 136 或 150） mg KH2PO4、（27、 27.8 或 28） mg FeSO4.7H2O、（37、 37.3 或 38） mgNa2-EDTA.2H2O、（3、 3.1 或 3.5） mg H3BO3、（10、 11.15 或 11.5） mg MnSO4.4H2O、（5.1、 5.76 或 6.0） mg ZnSO4.7H2O、（0.75、 0.83 或 0.85） mgKI、（0.23。

8、、 0.24 或 0.25） mgNaMoO4.2H2O、（0.023、 0.025 或 0.075） mgCuSO4.5H2O、（0.025、 0.028 或 0.03） mgCoCl2.6H2O、（5、 6 或 6.5） mg 烟酸、（8、 8.5 或 10） mg 维生素 B1、（0.8、 1 或 1.2） mg 维生素 B6、（80、 90 或 100） mg 肌醇、（18、 20 或 22） g 麦芽糖、（3、 3.5 或 4） g 植物凝胶和水组成，用水补足体积； pH 值具体为 5.8 或 6.0。 6. 根据权利要求 1-5 中任意一项所述的方法，其特征在于：所述。

9、继代培养经过两次继代，然后再进行分化培养。 7. 根据权利要求 1-6 中任意一项所述的方法，其特征在于：所述诱导籼稻愈伤组织的培养条件为黑暗条件下，室温度 26 28培养；所述继代培养的培养条件为黑暗条件下，室温度 26 28培养；所述分化培养的培养条件是室温度 26 28培养，每天光照 16 小时，光照强度为 1000-1200Lux。 8. 根据权利要求 7 所述的方法，其特征在于：所述继代培养每次培养时间为 18-22 天，优选为 20 天。权利要求书 CN 102715084 A 2 2/2 页 3 9. 根据权利要求 1-8 中任意一。

10、项所述的方法，其特征在于：所述诱导籼稻愈伤组织的培养基为基本培养基添加 2,4-D 和甘露醇获得的固体培养基；其中， 2,4-D 添加的终浓度为 1.5-2.5mg/L，优选为 2mg/L，甘露醇添加的终浓度为 35-37g/L，优选为 36.43g/L，所述诱导籼稻愈伤组织的培养基 pH 值为 5.8-6.0，优选为 5.8-5.9。 10. 根据权利要求 1-9 中任意一项所述的方法，其特征在于：所述籼稻的品种为明恢 86、 C418、特青、 9311、和广占 63s ；所述诱导籼稻愈伤组织的外植体为籼稻成熟种胚子。权利要求书 CN 10271。

11、5084 A 3 1/9 页 4 一种籼稻组织培养的方法技术领域 0001 本发明涉及一种籼稻组织培养的方法。背景技术 0002 利用转基因技术将外源优良基因导入植物是提高作物育种效率的重要途径。然而要开展大规模的转基因育种，必须具备一个良好的愈伤组织增殖和再生效率高的组织培养体系。水稻做为基因组研究的模式作物，遗传转化技术体系比较完善，但多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低，尽管在外植体、培养基成分及培养条件等方面进行了大量研究，但迄今为止，适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立，严重影响了籼稻转基因的研究与应用。 0003 1、。

12、基本培养基类型对籼稻愈伤组织分化影响 0004 易自立等人在实验中证明 CC 培养基对籼稻的分化效果较好。曾桂萍在 NB、 MS1、 MS2和NMB四种分化培养基的分化培养的对比实验中，得出以下结果， MS2培养基是最适合作籼稻分化的培养基，其次是 NMB，再次是 NB，效果最差的是 MS1。 0005 2、植物激素对籼稻愈伤组织分化的影响 0006 崔广荣等以中籼 898 成熟种子为材料的研究结果显示， NAA、 6-BA 的不同浓度组合对籼稻的分化成苗具有显著作用。认为分化培养基中 6-BA 浓度为 1.0mg/L， NAA 浓度为 0.5mg/L为最好。王亚琴等以籼稻不育。

13、系中A的种子为外植体的研究结果表明，添加外源激素 3.0mg/L6-BA 和 0.5mg/LNAA 有利于提高其分化率（王亚琴 , 梁承邺 . 籼稻不育系中 A 完善再生系统的研究 . 中山大学学报（自然科学版） ,2006,45(5) ： 81 84）。 0007 张平等人分析几种不同的激素配比对籼稻愈伤组织分化率的影响。结果表明，在分化过程中，以 6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L 的激素配方，其愈伤组织的分化率最高。尹福强等的实验结果却认为以 6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L 的激素配比效果。

14、为最佳，其愈伤组织现绿时间早、绿点多、分化频率高（尹福强 , 刘铭 , 菜光泽 , 等 . 农杆菌介导转化水稻成熟胚影响因素研究 . 西昌学院学报（自然科学版） ,2005,19 （4）： 37 40）。 0008 高三基等人的实验表明，外加一定浓度的 ABA 对促进胚性愈伤组织的生长和胚状体发生、发育具有一定作用，从而提高成熟胚愈伤组织的分化率（高三基 , 陈如凯 , 马宏敏.影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素.作物学报,2004,30(12) ： 1254 1258）。 0009 3、微量元素对愈伤组织绿苗分化的作用 0010 铜是植物正常生命活动所。

15、必需的微量元素。Yang 等研究发现，在培养基中添加各种浓度为对照 N6 基本培养基的 2 倍的常量微量元素，结果显示只有铜能明显提高水稻成熟胚培养的愈伤组织植株再生频率（YangYS， ZhengYD， ChenYL， et a1.Improvement of plant regeneration from long term cultured calluses of Taipei309， a model rice varieties in in vitro studiesJPlant Cell Tissue Organ Culture， 1999， 57 ：说明书 CN 1。

16、02715084 A 4 2/9 页 5 199-206）。 0011 袁玲通过研究发现铜、银元素能明显提高水稻愈伤组织绿苗再生，而且使用浓度范围较广（2-20mol/L），这给籼稻成熟胚培养的实际应用带来了很大的方便。 0012 4、干燥处理对水稻愈伤组织分化的影响 0013 田文忠曾报道干燥处理能提高籼稻愈伤组织的再生频率（田文忠提高籼稻愈伤组织再生频率的研究 J遗传学报， 1994， 21(3) ： 215-221）。赵成章等人以浙 733、广陆矮 4 号、中优早 2 号等 3 个籼稻品种的成熟胚和秀水 11、春江 03、宝龙等 3 个粳稻品种的成熟胚的愈。

17、伤组织为试验材料，干燥处理 4 天后再接种于分化培养基中，发现干燥处理均能提高水稻愈伤组织绿苗分化频率，但各基因型间差异较大。对籼稻的效果比粳稻稍明显（赵成章，吴连斌，杨长登，等干燥处理对水稻愈伤组织绿苗再生和若干生理生化特性的影响J 作物学报， 1997， 23(1) ： 39-43）。肖向文等人以籼稻恢复系品种 JH35 的愈伤组织干燥处理 2-5 天，使其失水 50% 左右，再转移到分化培养基中获得了 59.4的分化率，而对照处理只有 43.5% 的分化率。因此，在愈伤组织转入分化培养基之前，可采用干燥处理的方式来提高籼稻成熟胚愈伤组织的分化率。。

18、0014 5、不同再生途径对籼稻成熟胚愈伤组织分化的影响 0015 在植物组织培养中，愈伤组织的分化途径有 2 种，即直接再生培养法和两步再生法。两步再生法是指在愈伤组织接入分化培养基之前进行一个预分化培养过程。刘传光等人以 2 种分化途径对香花占、特青 2 号、胜泰 1 号、小丰占、新桂占等 5 个籼稻品种成熟胚愈伤组织进行分化培养，结果发现，采用两步分化法的愈伤组织分化率明显提高，提高幅度为 51.8%-67.5%。郑贵朝等人以水稻光温敏核不育系 N19S、 N22S 和 RN20S 等 3 个品种成熟胚为试验材料，研究发现采用两步分化培养法的效果远优于直接分。

19、化培养法。因此，对于体外再生能力较差或因长期继代而愈伤组织分化能力降低的愈伤组织，可以采用两步分化培养法来提高其分化率。 0016 5、山梨醇、甘露醇对愈伤组织分化的影响 0017 Kishor 等以籼稻品种 “Bala”的种胚和幼根为外植体，诱导产生的愈伤组织在 3% 浓度的山梨醇或甘露醇的作用下经多次继代培养， 49%-61% 的愈伤组织仍可再生出植株（Kishor PBK,Raddy GM.Regeneration of rice plants from long-term root and embryo-derived callus cultureJ.Current。

20、 Sci,1986,55(14):664-665）。黄惠君等报道甘露醇单独作为培养基的碳源使用，会导致水稻体细胞死亡；山梨醇单独作为培养基碳源时，能维持体细胞的生存与分化（黄惠君，黄道强 . 山梨醇对水稻体细胞培养的特殊作用 J. 中国水稻科学 ,1999,13(4):248-250）。 0018 多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低，尽管在外植体、培养基成分及培养条件等方面进行了大量研究，但迄今为止，适合不同籼稻品种特别是适合生产上应用的优良籼稻品种的高效再生体系尚未建立，严重影响了籼稻转基因的研究与应用。发明内容 0019 本发明的。

21、目的是提供一种分化频率高的籼稻组织培养方法。 0020 本发明所提供的籼稻组织培养方法，包括下述步骤：说明书 CN 102715084 A 5 3/9 页 6 0021 1）诱导籼稻愈伤组织； 0022 2）对愈伤组织进行继代培养； 0023 3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养； 0024 所述分化培养的培养基为基本培养基添加 a- 萘乙酸、 6-BA 和 20-40g/L 山梨醇的固体培养基。 0025 所述分化培养的培养基中的 a- 萘乙酸添加的终浓度为（0.5-1.2） mg/L，优选为 1mg/L，所述分化培养的培养基中的6-BA添加的终浓度为（1。

22、.8-3.0） mg/L，优选为2mg/L ；所述分化培养的培养基的 pH 值为 5.8-6.0，优选为 5.8-5.9。 0026 所述继代培养的培养基为基本培养基添加 2,4-D 和甘露醇获得的固体培养基。 0027 所述继代培养的培养基中 2,4-D 添加的终浓度为（1.5-2.5） mg/L，优选为 2mg/ L，甘露醇添加的终浓度为（35-37） g/L，优选为 36.43g/L，所述继代培养的培养基 pH 值为 5.8-6.0，优选为 5.8-5.9。 0028 所述分化培养和继代培养的基本培养基均为每 1L 基本培养基由（1200-1300） mgKNO3。

23、、（590-650） mgNH4NO3、（560-590） mg CaCl2.2H2O、（220-250） mg MgSO4.7H2O、（130-150） mg KH2PO4、（27-28） mg FeSO4.7H2O、（37-38） mgNa2-EDTA.2H2O、（3-3.5） mg H3BO3、（10-11.5） mg MnSO4.4H2O、（5.1-6.0） mg ZnSO4.7H2O、（0.75-0.85） mg KI、（0.23-0.25） mg NaMoO4.2H2O、（0.023-0.075） mgCuSO4.5H2O、（0.025-0.03） mgCoCl2.6H2O、（5。

24、-6.5） mg 烟酸、（8-10） mg 维生素 B1、（0.8-1.2） mg 维生素 B6、（80-100） mg 肌醇、（18-22） g 麦芽糖、（3-4） g 植物凝胶和水组成，用水补足体积； pH 值为 5.8-6.0 ； 0029 每 1L 基本培养基具体由（1200、 1212 或 1300） mg KNO3、（590、 640 或 650） mgNH4NO3、（560、 588 或 590） mg CaCl2.2H2O、（220、 247 或 250） mg MgSO4.7H2O、（130、 136 或 150） mg KH2PO4、（27、 27.8 或 28。

25、） mg FeSO4.7H2O、（37、 37.3 或 38） mgNa2-EDTA.2H2O、（3、 3.1 或 3.5） mg H3BO3、（10、 11.15 或 11.5） mg MnSO4.4H2O、（5.1、 5.76 或 6.0） mg ZnSO4.7H2O、（0.75、 0.83 或 0.85） mgKI、（0.23、 0.24 或 0.25） mgNaMoO4.2H2O、（0.023、 0.025 或 0.075） mgCuSO4.5H2O、（0.025、 0.028 或 0.03） mgCoCl2.6H2O、（5、 6 或 6.5） mg 烟酸、（8、 8.5 或 10）。

26、 mg 维生素 B1、（0.8、 1 或 1.2） mg 维生素 B6、（80、 90 或 100） mg 肌醇、（18、 20 或 22） g 麦芽糖、（3、 3.5 或 4） g 植物凝胶和水组成，用水补足体积； pH 值具体为 5.8 或 6.0 ； 0030 所述继代培养经过两次继代，然后在进行分化培养。 0031 所述诱导籼稻愈伤组织的培养条件为黑暗条件下，室温度 26 28培养；所述继代培养的培养条件为黑暗条件下，室温度 26 28培养；所述分化培养的培养条件是室温度 26 28培养，每天光照 16 小时，光照强度为 1000-1200Lux。 0032。

27、所述继代培养每次培养时间为 18-22 天，优选为 20 天。 0033 所述诱导籼稻愈伤组织的培养基为基本培养基添加 2,4-D 和甘露醇获得的固体培养基；其中， 2,4-D 添加的终浓度为（1.5-2.5） mg/L，优选为 2mg/L，甘露醇添加的终浓度为(35-37)g/L，优选为36.43g/L，所述诱导籼稻愈伤组织的培养基pH值为5.8-6.0，优选为 5.8-5.9。 0034 所述籼稻的品种为明恢 86、 C418、特青、 9311 和广占 63s ；所述诱导籼稻愈伤组织所用的外植体为成熟种胚。 0035 本发明通过实验对籼稻明恢86、 C418、。

28、特青、 9311和广占63s进行了甘露醇和山梨说明书 CN 102715084 A 6 4/9 页 7 醇不同浓度处理的组合试验，探讨 CC 基本培养基中不同甘露醇和山梨醇浓度配比对成熟胚诱导的愈伤组织分化的影响。结果表明，在分化培养基中加入 20g/L 山梨醇替换甘露醇能使明恢 86、 C418、 9311 和广占 63s 的分化频率提高到 70% 以上，山梨醇增加到 40g/L 能显著提高特青的愈伤组织分化频率，分化频率达 86%。因此，以 20-40g/L 山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高所选 5 个籼稻品种愈伤组织分化频率。 0036 因此，本发明的方法以生产。

29、上应用的优良籼稻品种（明恢 86、 C418、特青、 9311 和广占 63s）成熟胚为外植体，以 CC 为基本培养基，诱导愈伤组织，经两次继代，分化培养基中以 20-40g/L 山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高愈伤组织分化频率。同时，继代培养基中只使用甘露醇而不使用山梨醇可以降低愈伤组织的褐化率。 0037 并且，本发明的方法对籼稻品种明恢 86、 C418、特青、 9311 和广占 63s 成熟胚诱导的愈伤组织经两次继代（每次20天），不经过预分化，直接进行分化培养，方法简便、成本低，易操作，并可缩短分化培养周期，为有效提高籼稻遗传转化频率提供。

30、技术基础。附图说明 0038 图 1 为明恢 86 愈伤组织分化图，图中，左为使用表 1 所述批次编号 1 的培养基，右为使用表 1 所述批次编号 2 的培养基。 0039 图 2 为 C418 愈伤组织分化图，图中，左为使用表 1 所述批次编号 1 的培养基，右为使用表 1 所述批次编号 2 的培养基。 0040 图 3 为特青愈伤组织分化图，图中，左为使用表 2 所述批次编号 1 的培养基，右为使用表 2 所述批次编号 5 的培养基。 0041 图 4 为 9311 愈伤组织分化图，图中，左为使用表 3 所述批次编号 1 的培养基，右为使用表 3 所述批次。

31、编号 6 的培养基。 0042 图 5 为广占 63s 愈伤组织分化图，图中，左为使用表 4 所述批次编号 1 的培养基，右为使用表 4 所述批次编号 2 的培养基。具体实施方式 0043 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 0044 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量 0045 实施例 1、籼稻组织培养方法及其效果 0046 一、籼稻种子的组织培养前处理 0047 选取下述品种进行组织培养（公众可从中国农业大学获得） 0048 明恢 86、 C418、 9311 ：利用 ILP 标记分析水稻籼粳杂交亲本和衍生系的籼粳分化，中国农。

32、业科学 2009,42(10):3388-3396 ； 0049 特青：特高产常规釉稻新良种 “特青” ，种子 1988 年第 6 期 ,59-60 ； 0050 广占 63s ：籼型光温敏核不育系广占 63S 生育特性的研究，安徽农业科学 ,2003,31(6):927-928。 0051 健康饱满无病斑的成熟种子，除去颖壳，用 70% 乙醇浸泡 1min，然后将种子置于刚配制的 20% 次氯酸钠溶液中，于 28 摄氏度 180 转的摇床摇 40min。后于超净工作台用无菌水冲洗 4 次，最后将种子取出分别置于铺有灭过菌的滤。

33、纸上，等到种子表面基本干燥时，以说明书 CN 102715084 A 7 5/9 页 8 平摆法将其接种于下述培养基上进行组织培养。组织培养的外植体为种胚，只是接种是将整个种子直接进行接种。 0052 二、籼稻组织培养方法 0053 1、组织培养所用培养基的制备 0054 诱导培养基： CC 基本培养基中添加终浓度为 2mg/L 的 2,4-D，终浓度为 3.0g/L 的植物凝胶（购自 sigma），终浓度为 36.43g/L 的甘露醇，调节 PH5.8-5.9 获得的培养基。 0055 继代培养基： CC 基本培养基中添加终浓度为 2mg/L 的 2,4-D。

34、，终浓度为 3.0g/L 的植物凝胶， PH5.8-5.9，甘露醇山梨醇添加终浓度见表 1-4。 0056 分化培养基： CC 基本培养基中添加终浓度为 1mg/L a- 萘乙酸（NAA），终浓度为 2mg/L 的 6-BA，终浓度为 3.0g/L 的植物凝胶， PH5.8-5.9，甘露醇山梨醇添加终浓度见表 1-3。 0057 CC 基本培养基：每 1L 培养基由 1212mg KNO3、 640mg NH4NO3、 588mg CaCl2.2H2O、 247mg MgSO4.7H2O、 136mg KH2PO4、 27.8mg FeSO4.7H2O、 37.3mg N。

35、a2-EDTA.2H2O、 3.1mg H3BO3、 11.15mg MnSO4.4H2O、 5.76mg ZnSO4.7H2O、 0.83mgKI、 0.24mg NaMoO4.2H2O、 0.025mg CuSO4.5H2O、 0.028mg CoCl2.6H2O、 6mg 烟酸、 8.5mg 维生素 B1、 1mg 维生素 B6、 90mg 肌醇、 20g 麦芽糖、 3.5g 植物凝胶和水组成，用水补足体积； pH 值具体为 5.8。 0058 表 1. 品种明恢 86 与 C418 的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度 0059 0060 表 2. 品种特青的继代培养基和分。

36、化培养基中的甘露醇山梨醇浓度 0061 说明书 CN 102715084 A 8 6/9 页 9 0062 表 3. 品种 9311 的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度 0063 0064 0065 表 4 品种广占 63s 的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度 0066 0067 2、籼稻组织培养 0068 1）籼稻愈伤组织的诱导 0069 将上述处理过的籼稻明恢 86、 C418、特青、 9311、和广占 63s 种子，去壳、消毒分别接种于诱导培养基（步骤1中所述诱导培养基）中，置于黑暗条件下，室温度2628培养，种子接种后 3 5 天观察有无。

37、被污染的培养基，及时处理。接种约 12 天后，开始继代培养。诱导培养培养的外植体为种胚，只是接种是将整个种子直接进行接种。2）籼稻愈伤组织的继代培养 0070 镊子充分灼烧并冷却后将诱导出的愈伤组织从种子中剥下（愈伤组织从种胚发出（继代时拨出种胚和愈伤组织），接种于新鲜的继代培养基（分别使用步骤 1 中所述继代培养基）上，置于黑暗条件下，室温度 26 28培养，每隔约 20d 继代一次，两次继代后统计愈伤组织褐化率。 0071 将愈伤组织褐化程度定为 4 级标准记载统计。3 级：愈伤组织块褐化面积在 2/3-1 之间 ( 包括 2/3 和 1) ； 2 。

38、级：愈伤组织块褐化面积在 1/3-2/3 之间（包括 1/3）； 1 级：愈伤组说明书 CN 102715084 A 9 7/9 页 10 织块褐化面积在 1/10-1/3（包括 1/10）； 0 级：愈伤组织块褐化面积小于 1/10。 0072 3）籼稻愈伤组织的分化培养与愈伤组织分化率的观察与统计 0073 经过两次继代培养的愈伤组织，挑选自然分散的质地致密、呈淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，接种于分化培养基（分别使用步骤 1 中所述分化培养基）上，室温度 26 28 培养，每天光照 16 小时，光照强度为 1000-1200Lux。分化培养 25 。

39、30 天左右统计分化率。 0074 上述 1） -3）所得的数据，先进行整理、合并，剔除极端数据，每个处理重 3-4 盘，计算各个处理褐化率、褐化指数及分化频率的平均数，运用 SPSS 进行分析处理，对有显著性差异的用邓肯氏方法进行比较。 0075 有关公式计算如下： 0076 3 级褐化率 (%)=( 达到 3 级褐化程度的愈伤组织块数 / 转移的愈伤组织块数 )l00%. 0077 2 级褐化率 (%)=( 达到 2 级褐化程度的愈伤组织块数 / 转移的愈伤组织块数 )100%. 0078 1 级褐化率 (%)=( 达到 1 级褐化程度的愈伤组织块数 / 转移的。

40、愈伤组织块数 )100%. 0079 0 级褐化率 (%)=( 达到 0 级褐化程度的愈伤组织块数 / 转移的愈伤组织块数 )100%. 0080 褐化率 (%) 100% 0 级褐化率 (%) 0081 褐化指数（%） = ( 各褐化级的愈伤组织数该褐化级别 )/( 转移的愈伤组织数最高的褐化级别 )100% 0082 愈伤组织分化率 (%) ( 出现绿芽的愈伤组织块数 / 转移的愈伤组织块数 )100% 0083 3. 结果分析 0084 1）甘露醇和山梨醇对明恢 86 和 C418 愈伤组织状态和分化的影响 0085 籼稻组织培养通过预分化可明显提高愈伤组织分化频率，但。

41、预分化会增加愈伤组织培养周期，本研究采用籼稻成熟胚为外植体诱导愈伤组织，经两次继代，不进行预分化直接进行分化，表 5 表明，明恢 86 和 C418 在继代培养基中添加山梨醇，愈伤组织状态未能的得到改善，而单独使用甘露醇有利于降低愈伤组织褐化，在分化培养基中单独添加山梨醇大大提高了愈伤组织分化频率。因此，对于明恢 86 和 C418 在继代培养中添加 36.43g/L 甘露醇，在分化培养基中添加 20g/L 山梨醇可将愈伤组织分化频率提高到 70% 以上（批次 4）。 0086 表 5 甘露醇和山梨醇浓度对明恢 86 和 C418 愈伤组织分化影响 0087 。

42、说明书 CN 102715084 A 10 8/9 页 11 0088 0089 2）甘露醇和山梨醇对特青愈伤组织状态和分化的影响 0090 表6数据表明，特青在继代过程中不同培养基褐化差异不大，只有处理2褐化率有一定升高，而在分化培养基中添加 20g/L 山梨醇（处理 4）虽然能提高愈伤组织分化率，但分化率只达到 38.9%，而当山梨醇提高到 40g/L 则使分化频率提高到 85.58%（批次 5）。 0091 表 6 甘露醇和山梨醇浓度对特青愈伤组织状态和分化影响 0092 0093 3）甘露醇和山梨醇对 9311 愈伤组织状态和分化的影响 0094 表 7 表。

43、明， 9311 在继代培养基中添加山梨醇未降低愈伤组织褐化率，而在分化培养基中添加 20g/L 山梨醇能使分化频率提高至 80% 以上（批次 6、 7）。 0095 表 7 甘露醇和山梨醇浓度对 9311 愈伤组织状态和分化影响 0096 0097 4）甘露醇和山梨醇对广占 63s 愈伤组织状态和分化的影响 0098 广占 63s 愈伤组织培养实验结果（表 8）表明，继代培养基中添加甘露醇有利于抑说明书 CN 102715084 A 11 9/9 页 12 制愈伤组织褐化，用山梨醇代替甘露醇却使愈伤组织褐化率升高（批次 4），而在分化培养基中加入 20g/L 甘。

44、露醇有利于愈伤组织分化，分化频率达 74.7%（批次 2），因此广占 63s 品种继代培养基中添加36.43g/L甘露醇，在分化培养基中添加20g/L山梨醇可将愈伤组织分化频率提高到 70% 以上。 0099 表 8 甘露醇和山梨醇对广占 63s 愈伤组织状态和分化的影响 0100 说明书 CN 102715084 A 12 1/3 页 13 图 1 图 2 说明书附图 CN 102715084 A 13 2/3 页 14 图 3 图 4 说明书附图 CN 102715084 A 14 3/3 页 15 图 5 说明书附图 CN 102715084 A 15 。

摘要
申请专利号：	CN201210199024.5	申请日：	2012.06.14
公开号：	CN102715084A	公开日：	2012.10.10
当前法律状态：	驳回	有效性：	无权
法律详情：	发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):A01H 4/00申请公布日:20121010\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20120614\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	中国农业大学
发明人：	付永彩; 王超杰; 杨亚萍; 韩冰; 朱颖; 李倩倩; 孙传清
地址：	100193 北京市海淀区圆明园西路2号
优先权：
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司 11245	代理人：	关畅;王慧凤
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内容摘要

本发明公开了一种籼稻组织培养方法。本发明所提供的籼稻组织培养方法，包括下述步骤：1）诱导籼稻愈伤组织；2）对愈伤组织进行继代培养；3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养；所述分化培养的培养基为基本培养基添加a-萘乙酸、6-BA和20-40g/L山梨醇的固体培养基。本发明的方法以生产上应用的优良籼稻品种（明恢86、C418、特青、9311和广占63s）成熟胚为外植体，分化培养基中以20或40g/L山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高愈伤组织分化频率。本发明的方法不经过预分化，直接进行分化培养，方法简便、成本低，易操作，并可缩短组织培养周期，为有效提高籼稻遗传转化频率提供技术基础。

权利要求书

权利要求书
1.  籼稻组织培养方法，包括下述步骤：
1）诱导籼稻愈伤组织；
2）对愈伤组织进行继代培养；
3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养；所述分化培养的培养基为基本培养基添加a-萘乙酸、6-BA和20-40g/L山梨醇的固体
培养基。

2.  根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分化培养的培养基中的a-萘乙酸添加的终浓度为（0.5-1.2）mg/L，优选为1mg/L，所述分化培养的培养基中的6-BA添加的终浓度为（1.8-3.0）mg/L，优选为2mg/L；所述分化培养的培养基的pH值为5.8-6.0，优选为

5.  8-5.9。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述继代培养的培养基为基本培养基添加2,4-D和甘露醇获得的固体培养基。

4.  根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述继代培养的培养基中2,4-D添加的终浓度为1.5-2.5mg/L，优选为2mg/L，甘露醇添加的终浓度为35-37g/L，优选为36.43g/L，所述继代培养的培养基pH值为5.8-6，优选为5.8-5.9。

5.  根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述分化培养和继代培养的每1L基本培养基均由（1200-1300）mgKNO3、（590-650）mgNH4NO3、（560-590）mgCaCl2.2H2O、（220-250）mgMgSO4.7H2O、（130-150）mgKH2PO4、（27-28）mgFeSO4.7H2O、
（37-38）mgNa2-EDTA.2H2O、（3-3.5）mgH3BO3、（10-11.5）mgMnSO4.4H2O、（5.1-6.0）mg
ZnSO4.7H2O（、0.75-0.85）mgKI（、0.23-0.25）mgNaMoO4.2H2O（、0.023-0.075）mgCuSO4.5H2O、
（0.025-0.03）mgCoCl2.6H2O、（5-6.5）mg烟酸、（8-10）mg维生素B1、（0.8-1.2）mg维生素B6、（80-100）mg肌醇、（18-22）g麦芽糖、（3-4）g植物凝胶和水组成，用水补足体积；pH值为5.8-6.0；
所述每1L基本培养基优选由（1200、1212或1300）mgKNO3、（590、640或650）mgNH4NO3、
（560、588或590）mgCaCl2.2H2O、（220、247或250）mgMgSO4.7H2O、（130、136或150）mgKH2PO4、（27、27.8或28）mgFeSO4.7H2O、（37、37.3或38）mgNa2-EDTA.2H2O、（3、3.1或3.5）mgH3BO3、（10、11.15或11.5）mgMnSO4.4H2O（、5.1、5.76或6.0）mgZnSO4.7H2O（、0.75、0.83或0.85）mgKI、（0.23、0.24或0.25）mgNaMoO4.2H2O、（0.023、0.025或0.075）mgCuSO4.5H2O、
（0.025、0.028或0.03）mgCoCl2.6H2O、（5、6或6.5）mg烟酸、（8、8.5或10）mg维生素B1、
（0.8、1或1.2）mg维生素B6、（80、90或100）mg肌醇、（18、20或22）g麦芽糖、（3、3.5或
4）g植物凝胶和水组成，用水补足体积；pH值具体为5.8或6.0。

6.  根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于：所述继代培养经过两次继代，然后再进行分化培养。

7.  根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于：所述诱导籼稻愈伤组织的培养条件为黑暗条件下，室温度26－28℃培养；所述继代培养的培养条件为黑暗条件下，室温度26－28℃培养；所述分化培养的培养条件是室温度26－28℃培养，每天光照16小时，光照强度为1000-1200Lux。

8.  根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述继代培养每次培养时间为18-22天，优选为20天。

9.  根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于：所述诱导籼稻愈伤组织的培养基为基本培养基添加2,4-D和甘露醇获得的固体培养基；其中，2,4-D添加的终浓度为

1.  5-2.5mg/L，优选为2mg/L，甘露醇添加的终浓度为35-37g/L，优选为36.43g/L，所述诱导籼稻愈伤组织的培养基pH值为5.8-6.0，优选为5.8-5.9。

10.  根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于：所述籼稻的品种为明恢

86、  C418、特青、9311、和广占63s；所述诱导籼稻愈伤组织的外植体为籼稻成熟种胚子。

说明书

说明书一种籼稻组织培养的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种籼稻组织培养的方法。
背景技术
[0002]利用转基因技术将外源优良基因导入植物是提高作物育种效率的重要途径。然而要开展大规模的转基因育种，必须具备一个良好的愈伤组织增殖和再生效率高的组织培养体系。水稻做为基因组研究的模式作物，遗传转化技术体系比较完善，但多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低，尽管在外植体、培养基成分及培养条件等方面进行了大量研究，但迄今为止，适合不同籼稻品种的有效组织培养体系还未建立，严重影响了籼稻转基因的研究与应用。
[0003]1、基本培养基类型对籼稻愈伤组织分化影响
[0004] 易自立等人在实验中证明CC培养基对籼稻的分化效果较好。曾桂萍在NB、MS1、MS2和NMB四种分化培养基的分化培养的对比实验中，得出以下结果，MS2培养基是最适合作籼稻分化的培养基，其次是NMB，再次是NB，效果最差的是MS1。
[0005]2、植物激素对籼稻愈伤组织分化的影响
[0006] 崔广荣等以中籼898成熟种子为材料的研究结果显示，NAA、6-BA的不同浓度组合对籼稻的分化成苗具有显著作用。认为分化培养基中6-BA浓度为1.0mg/L，NAA浓度为
0.5mg/L为最好。王亚琴等以籼稻不育系中A的种子为外植体的研究结果表明，添加外源激素3.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA有利于提高其分化率（王亚琴,梁承邺.籼稻不育系中A完善再生系统的研究.中山大学学报（自然科学版）,2006,45(5)：81～84）。
[0007]张平等人分析几种不同的激素配比对籼稻愈伤组织分化率的影响。结果表明，在分化过程中，以6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L的激素配方，其愈伤组织的分化率最高。尹福强等的实验结果却认为以6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L+KT1.0mg/L的激素配比效果为最佳，其愈伤组织现绿时间早、绿点多、分化频率高（尹福强,刘铭,菜光泽,等.农杆菌介导转化水稻成熟胚影响因素研究.西昌学院学报（自然科学版）,2005,19（4）：
37～40）。
[0008]高三基等人的实验表明，外加一定浓度的ABA对促进胚性愈伤组织的生长和胚状体发生、发育具有一定作用，从而提高成熟胚愈伤组织的分化率（高三基,陈如凯,马宏敏.影响籼稻成熟胚愈伤组织植株再生频率的几个因素.作物学报,2004,30(12)：1254～
1258）。
[0009]3、微量元素对愈伤组织绿苗分化的作用
[0010]铜是植物正常生命活动所必需的微量元素。Yang等研究发现，在培养基中添加各种浓度为对照N6基本培养基的2倍的常量微量元素，结果显示只有铜能明显提高水稻成熟胚培养的愈伤组织植株再生频率（YangYS，ZhengYD，ChenYL，eta1.ImprovementofplantregenerationfromlongtermculturedcallusesofTaipei309，amodelricevarietiesininvitrostudies[J]．PlantCellTissueOrganCulture，1999，57：
199-206）。
[0011]袁玲通过研究发现铜、银元素能明显提高水稻愈伤组织绿苗再生，而且使用浓度范围较广（2-20μmol/L），这给籼稻成熟胚培养的实际应用带来了很大的方便。
[0012]4、干燥处理对水稻愈伤组织分化的影响
[0013]田文忠曾报道干燥处理能提高籼稻愈伤组织的再生频率（田文忠．提高籼稻愈伤组织再生频率的研究[J]．遗传学报，1994，21(3)：215-221）。赵成章等人以浙733、广陆矮
4号、中优早2号等3个籼稻品种的成熟胚和秀水11、春江03、宝龙等3个粳稻品种的成熟胚的愈伤组织为试验材料，干燥处理4天后再接种于分化培养基中，发现干燥处理均能提高水稻愈伤组织绿苗分化频率，但各基因型间差异较大。对籼稻的效果比粳稻稍明显（赵成章，吴连斌，杨长登，等．干燥处理对水稻愈伤组织绿苗再生和若干生理生化特性的影响[J]
．作物学报，1997，23(1)：39-43）。肖向文等人以籼稻恢复系品种JH35的愈伤组织干燥处理2-5天，使其失水50%左右，再转移到分化培养基中．获得了59.4％的分化率，而对照处理只有43.5%的分化率。因此，在愈伤组织转入分化培养基之前，可采用干燥处理的方式来提高籼稻成熟胚愈伤组织的分化率。
[0014]5、不同再生途径对籼稻成熟胚愈伤组织分化的影响
[0015]在植物组织培养中，愈伤组织的分化途径有2种，即直接再生培养法和两步再生法。两步再生法是指在愈伤组织接入分化培养基之前进行一个预分化培养过程。刘传光等人以2种分化途径对香花占、特青2号、胜泰1号、小丰占、新桂占等5个籼稻品种成熟胚愈伤组织进行分化培养，结果发现，采用两步分化法的愈伤组织分化率明显提高，提高幅度为
51.8%-67.5%。郑贵朝等人以水稻光温敏核不育系N19S、N22S和RN20S等3个品种成熟胚为试验材料，研究发现采用两步分化培养法的效果远优于直接分化培养法。因此，对于体外再生能力较差或因长期继代而愈伤组织分化能力降低的愈伤组织，可以采用两步分化培养法来提高其分化率。
[0016]5、山梨醇、甘露醇对愈伤组织分化的影响
[0017]Kishor等以籼稻品种“Bala”的种胚和幼根为外植体，诱导产生的愈伤组织在
3%浓度的山梨醇或甘露醇的作用下经多次继代培养，49%-61%的愈伤组织仍可再生出植株（KishorPBK,RaddyGM.Regenerationofriceplantsfromlong-termrootandembryo-derivedcallusculture[J].CurrentSci,1986,55(14):664-665）。黄惠君等报道甘露醇单独作为培养基的碳源使用，会导致水稻体细胞死亡；山梨醇单独作为培养基碳源时，能维持体细胞的生存与分化（黄惠君，黄道强.山梨醇对水稻体细胞培养的特殊作用[J].中国水稻科学,1999,13(4):248-250）。
[0018] 多数籼稻品种在愈伤组织继代过程容易褐化，导致分化能力降低，尽管在外植体、培养基成分及培养条件等方面进行了大量研究，但迄今为止，适合不同籼稻品种特别是适合生产上应用的优良籼稻品种的高效再生体系尚未建立，严重影响了籼稻转基因的研究与应用。
发明内容
[0019]本发明的目的是提供一种分化频率高的籼稻组织培养方法。
[0020]本发明所提供的籼稻组织培养方法，包括下述步骤：
[0021]1）诱导籼稻愈伤组织；
[0022]2）对愈伤组织进行继代培养；
[0023]3）将经过继代培养的愈伤组织进行分化培养；
[0024] 所述分化培养的培养基为基本培养基添加a-萘乙酸、6-BA和20-40g/L山梨醇的固体培养基。
[0025]所述分化培养的培养基中的a-萘乙酸添加的终浓度为（0.5-1.2）mg/L，优选为
1mg/L，所述分化培养的培养基中的6-BA添加的终浓度为（1.8-3.0）mg/L，优选为2mg/L；所述分化培养的培养基的pH值为5.8-6.0，优选为5.8-5.9。
[0026] 所述继代培养的培养基为基本培养基添加2,4-D和甘露醇获得的固体培养基。[0027] 所述继代培养的培养基中2,4-D添加的终浓度为（1.5-2.5）mg/L，优选为2mg/L，甘露醇添加的终浓度为（35-37）g/L，优选为36.43g/L，所述继代培养的培养基pH值为
5.8-6.0，优选为5.8-5.9。
[0028]所述分化培养和继代培养的基本培养基均为每1L基本培养基由（1200-1300）mgKNO3、（590-650）mgNH4NO3、（560-590）mgCaCl2.2H2O、（220-250）mgMgSO4.7H2O、（130-150）mgKH2PO4、（27-28）mgFeSO4.7H2O、（37-38）mgNa2-EDTA.2H2O、（3-3.5）mgH3BO3、（10-11.5）mgMnSO4.4H2O（、5.1-6.0）mgZnSO4.7H2O（、0.75-0.85）mgKI（、0.23-0.25）mgNaMoO4.2H2O、
（0.023-0.075）mgCuSO4.5H2O、（0.025-0.03）mgCoCl2.6H2O、（5-6.5）mg烟酸、（8-10）mg维生素B1、（0.8-1.2）mg维生素B6、（80-100）mg肌醇、（18-22）g麦芽糖、（3-4）g植物凝胶和水组成，用水补足体积；pH值为5.8-6.0；
[0029]每1L基本培养基具体由（1200、1212或1300）mgKNO3、（590、640或650）mgNH4NO3、
（560、588或590）mgCaCl2.2H2O、（220、247或250）mgMgSO4.7H2O、（130、136或150）mgKH2PO4、（27、27.8或28）mgFeSO4.7H2O、（37、37.3或38）mgNa2-EDTA.2H2O、（3、3.1或3.5）mgH3BO3、（10、11.15或11.5）mgMnSO4.4H2O（、5.1、5.76或6.0）mgZnSO4.7H2O（、0.75、0.83或0.85）mgKI、（0.23、0.24或0.25）mgNaMoO4.2H2O、（0.023、0.025或0.075）mgCuSO4.5H2O、
（0.025、0.028或0.03）mgCoCl2.6H2O、（5、6或6.5）mg烟酸、（8、8.5或10）mg维生素B1、
（0.8、1或1.2）mg维生素B6、（80、90或100）mg肌醇、（18、20或22）g麦芽糖、（3、3.5或
4）g植物凝胶和水组成，用水补足体积；pH值具体为5.8或6.0；
[0030]所述继代培养经过两次继代，然后在进行分化培养。
[0031]所述诱导籼稻愈伤组织的培养条件为黑暗条件下，室温度26－28℃培养；所述继代培养的培养条件为黑暗条件下，室温度26－28℃培养；所述分化培养的培养条件是室温度26－28℃培养，每天光照16小时，光照强度为1000-1200Lux。
[0032]所述继代培养每次培养时间为18-22天，优选为20天。
[0033]所述诱导籼稻愈伤组织的培养基为基本培养基添加2,4-D和甘露醇获得的固体培养基；其中，2,4-D添加的终浓度为（1.5-2.5）mg/L，优选为2mg/L，甘露醇添加的终浓度为(35-37)g/L，优选为36.43g/L，所述诱导籼稻愈伤组织的培养基pH值为5.8-6.0，优选为
5.8-5.9。
[0034] 所述籼稻的品种为明恢86、C418、特青、9311和广占63s；所述诱导籼稻愈伤组织所用的外植体为成熟种胚。
[0035]本发明通过实验对籼稻明恢86、C418、特青、9311和广占63s进行了甘露醇和山梨
醇不同浓度处理的组合试验，探讨CC基本培养基中不同甘露醇和山梨醇浓度配比对成熟胚诱导的愈伤组织分化的影响。结果表明，在分化培养基中加入20g/L山梨醇替换甘露醇能使明恢86、C418、9311和广占63s的分化频率提高到70%以上，山梨醇增加到40g/L能显著提高特青的愈伤组织分化频率，分化频率达86%。因此，以20-40g/L山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高所选5个籼稻品种愈伤组织分化频率。
[0036]因此，本发明的方法以生产上应用的优良籼稻品种（明恢86、C418、特青、9311和广占63s）成熟胚为外植体，以CC为基本培养基，诱导愈伤组织，经两次继代，分化培养基中以20-40g/L山梨醇代替甘露醇，可大幅度提高愈伤组织分化频率。同时，继代培养基中只使用甘露醇而不使用山梨醇可以降低愈伤组织的褐化率。
[0037] 并且，本发明的方法对籼稻品种明恢86、C418、特青、9311和广占63s成熟胚诱导的愈伤组织经两次继代（每次20天），不经过预分化，直接进行分化培养，方法简便、成本低，易操作，并可缩短分化培养周期，为有效提高籼稻遗传转化频率提供技术基础。
附图说明
[0038] 图1为明恢86愈伤组织分化图，图中，左为使用表1所述批次编号1的培养基，右为使用表1所述批次编号2的培养基。
[0039] 图2为C418愈伤组织分化图，图中，左为使用表1所述批次编号1的培养基，右为使用表1所述批次编号2的培养基。
[0040] 图3为特青愈伤组织分化图，图中，左为使用表2所述批次编号1的培养基，右为使用表2所述批次编号5的培养基。
[0041] 图4为9311愈伤组织分化图，图中，左为使用表3所述批次编号1的培养基，右为使用表3所述批次编号6的培养基。
[0042] 图5为广占63s愈伤组织分化图，图中，左为使用表4所述批次编号1的培养基，右为使用表4所述批次编号2的培养基。
具体实施方式
[0043] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。[0044] 下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量[0045] 实施例1、籼稻组织培养方法及其效果
[0046] 一、籼稻种子的组织培养前处理
[0047] 选取下述品种进行组织培养（公众可从中国农业大学获得）
[0048] 明恢86、C418、9311：利用ILP标记分析水稻籼粳杂交亲本和衍生系的籼粳分化，中国农业科学2009,42(10):3388-3396；
[0049] 特青：特高产常规釉稻新良种“特青”，种子1988年第6期,59-60；
[0050] 广占63s：籼型光温敏核不育系广占63S生育特性的研究，安徽农业科学,2003,31(6):927-928。
[0051]健康饱满无病斑的成熟种子，除去颖壳，用70%乙醇浸泡1min，然后将种子置于刚配制的20%次氯酸钠溶液中，于28摄氏度180转的摇床摇40min。后于超净工作台用无菌水冲洗4次，最后将种子取出分别置于铺有灭过菌的滤纸上，等到种子表面基本干燥时，以
平摆法将其接种于下述培养基上进行组织培养。组织培养的外植体为种胚，只是接种是将整个种子直接进行接种。
[0052] 二、籼稻组织培养方法
[0053] 1、组织培养所用培养基的制备
[0054] 诱导培养基：CC基本培养基中添加终浓度为2mg/L的2,4-D，终浓度为3.0g/L的植物凝胶（购自sigma），终浓度为36.43g/L的甘露醇，调节PH5.8-5.9获得的培养基。[0055] 继代培养基：CC基本培养基中添加终浓度为2mg/L的2,4-D，终浓度为3.0g/L的植物凝胶，PH5.8-5.9，甘露醇山梨醇添加终浓度见表1-4。
[0056] 分化培养基：CC基本培养基中添加终浓度为1mg/La-萘乙酸（NAA），终浓度为
2mg/L的6-BA，终浓度为3.0g/L的植物凝胶，PH5.8-5.9，甘露醇山梨醇添加终浓度见表
1-3。
[0057] CC基本培养基：每1L培养基由1212mgKNO3、640mgNH4NO3、588mgCaCl2.2H2O、
247mgMgSO4.7H2O、136mgKH2PO4、27.8mgFeSO4.7H2O、37.3mgNa2-EDTA.2H2O、3.1mgH3BO3、11.15mgMnSO4.4H2O、5.76mgZnSO4.7H2O、0.83mgKI、0.24mgNaMoO4.2H2O、0.025mgCuSO4.5H2O、0.028mgCoCl2.6H2O、6mg烟酸、8.5mg维生素B1、1mg维生素B6、90mg肌醇、20g麦芽糖、3.5g植物凝胶和水组成，用水补足体积；pH值具体为5.8。
[0058] 表1.品种明恢86与C418的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度
[0059] [0060] 表2.品种特青的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度
[0061]
[0062] 表3.品种9311的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度
[0063]
[0064] [0065] 表4品种广占63s的继代培养基和分化培养基中的甘露醇山梨醇浓度
[0066] [0067] 2、籼稻组织培养
[0068] 1）籼稻愈伤组织的诱导
[0069] 将上述处理过的籼稻明恢86、C418、特青、9311、和广占63s种子，去壳、消毒分别接种于诱导培养基（步骤1中所述诱导培养基）中，置于黑暗条件下，室温度26－28℃培养，种子接种后3－5天观察有无被污染的培养基，及时处理。接种约12天后，开始继代培养。诱导培养培养的外植体为种胚，只是接种是将整个种子直接进行接种。2）籼稻愈伤组织的继代培养
[0070] 镊子充分灼烧并冷却后将诱导出的愈伤组织从种子中剥下（愈伤组织从种胚发出
（继代时拨出种胚和愈伤组织），接种于新鲜的继代培养基（分别使用步骤1中所述继代培养基）上，置于黑暗条件下，室温度26－28℃培养，每隔约20d继代一次，两次继代后统计愈伤组织褐化率。
[0071] 将愈伤组织褐化程度定为4级标准记载统计。3级：愈伤组织块褐化面积在2/3-1
之间(包括2/3和1)；2级：愈伤组织块褐化面积在1/3-2/3之间（包括1/3）；1级：愈伤组
织块褐化面积在1/10-1/3（包括1/10）；0级：愈伤组织块褐化面积小于1/10。
[0072] 3）籼稻愈伤组织的分化培养与愈伤组织分化率的观察与统计
[0073] 经过两次继代培养的愈伤组织，挑选自然分散的质地致密、呈淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，接种于分化培养基（分别使用步骤1中所述分化培养基）上，室温度26－28℃培养，每天光照16小时，光照强度为1000-1200Lux。分化培养25－30天左右统计分化率。[0074] 上述1）-3）所得的数据，先进行整理、合并，剔除极端数据，每个处理重3-4盘，计算各个处理褐化率、褐化指数及分化频率的平均数，运用SPSS进行分析处理，对有显著性差异的用邓肯氏方法进行比较。
[0075] 有关公式计算如下：
[0076] 3级褐化率(%)=(达到3级褐化程度的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×l00%.
[0077] 2级褐化率(%)=(达到2级褐化程度的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%.
[0078] 1级褐化率(%)=(达到1级褐化程度的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%.
[0079] 0级褐化率(%)=(达到0级褐化程度的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%.
[0080] 褐化率(%)＝100%－0级褐化率(%)
[0081] 褐化指数（%）=∑(各褐化级的愈伤组织数×该褐化级别)/(转移的愈伤组织数×最高的褐化级别)×100%
[0082] 愈伤组织分化率(%)＝(出现绿芽的愈伤组织块数/转移的愈伤组织块数)×100%
[0083] 3.结果分析
[0084] 1）甘露醇和山梨醇对明恢86和C418愈伤组织状态和分化的影响
[0085] 籼稻组织培养通过预分化可明显提高愈伤组织分化频率，但预分化会增加愈伤组织培养周期，本研究采用籼稻成熟胚为外植体诱导愈伤组织，经两次继代，不进行预分化直接进行分化，表5表明，明恢86和C418在继代培养基中添加山梨醇，愈伤组织状态未能的得到改善，而单独使用甘露醇有利于降低愈伤组织褐化，在分化培养基中单独添加山梨醇大大提高了愈伤组织分化频率。因此，对于明恢86和C418在继代培养中添加36.43g/L甘露醇，在分化培养基中添加20g/L山梨醇可将愈伤组织分化频率提高到70%以上（批次4）。[0086] 表5甘露醇和山梨醇浓度对明恢86和C418愈伤组织分化影响
[0087]
[0088]
[0089] 2）甘露醇和山梨醇对特青愈伤组织状态和分化的影响
[0090] 表6数据表明，特青在继代过程中不同培养基褐化差异不大，只有处理2褐化率有一定升高，而在分化培养基中添加20g/L山梨醇（处理4）虽然能提高愈伤组织分化率，但分化率只达到38.9%，而当山梨醇提高到40g/L则使分化频率提高到85.58%（批次5）。[0091] 表6甘露醇和山梨醇浓度对特青愈伤组织状态和分化影响
[0092] [0093] 3）甘露醇和山梨醇对9311愈伤组织状态和分化的影响
[0094] 表7表明，9311在继代培养基中添加山梨醇未降低愈伤组织褐化率，而在分化培养基中添加20g/L山梨醇能使分化频率提高至80%以上（批次6、7）。
[0095] 表7甘露醇和山梨醇浓度对9311愈伤组织状态和分化影响
[0096] [0097] 4）甘露醇和山梨醇对广占63s愈伤组织状态和分化的影响
[0098] 广占63s愈伤组织培养实验结果（表8）表明，继代培养基中添加甘露醇有利于抑
制愈伤组织褐化，用山梨醇代替甘露醇却使愈伤组织褐化率升高（批次4），而在分化培养基中加入20g/L甘露醇有利于愈伤组织分化，分化频率达74.7%（批次2），因此广占63s品种继代培养基中添加36.43g/L甘露醇，在分化培养基中添加20g/L山梨醇可将愈伤组织分化频率提高到70%以上。
[0099]表8甘露醇和山梨醇对广占63s愈伤组织状态和分化的影响
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