一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103520372 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103520372 A (21)申请号 201310433236.X (22)申请日 2013.09.22 A61K 36/82(2006.01) A23B 7/154(2006.01) A23L 1/30(2006.01) A61P 17/00(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 徐平 黄虔菲 王岳飞 (74)专利代理机构 杭州中成专利事务所有限公 司 33212 代理人 周世骏 (54) 发明名称 一种从茶叶籽。

2、粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方 法 (57) 摘要 本发明涉及酪氨酸酶抑制剂的提取方法， 旨 在提供一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的 方法。该方法包括以下步骤 ： 将茶叶籽粕预处理 后进行脱脂， 然后加入乙醇水溶液提取， 离心得到 滤渣和提取液 ； 向滤渣中加入缓冲液， 进行浸提、 超声提取、 离心得到提取液 ； 将之前得到的提取 液真空浓缩后， 萃取得到萃余液， 将之后得到的提 取液用 60% 乙醇溶液进行梯度洗脱得到 60% 乙醇 洗脱液 ； 将萃余液和 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥得到酪氨酸酶抑制剂。本发明有效提高 了目标物的萃取精度， 大大提高了提取的效率， 可 以有效提。

3、高茶叶籽粕资源的经济效益， 且制备的 酪氨酸酶抑制剂是一种天然高效的酪氨酸酶抑制 剂， 对酪氨酸酶的抑制效果显著。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103520372 A CN 103520372 A 1/1 页 2 1. 一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 包括粉碎茶叶籽粕， 其特征在于， 包 括以下具体步骤 ： 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理后进行脱脂， 以茶叶籽粕和体积浓度 95% 的乙醇水溶液为 1g ： 15ml。

4、 1g ： 25ml 的比例， 向脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度 95% 的乙醇水溶液， 在 40 50下提取 30 40min， 然后以 12000 转 / 分钟离心 20 分钟后， 得到滤渣和提取液 ； 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和缓冲液为 1g ： 20ml 1g ： 30ml 的比例， 向步骤 A 得到的 滤渣中加入缓冲液， 在 40 60下浸提 2 3h， 再超声提取 10 20min 后， 以 12000 转 / 分钟离心20分钟， 得到提取液 ； 所述缓冲液为PH是79， 且含占脱脂后茶叶籽粕干重3 5% 的碱性蛋白酶的缓冲液 ； 步骤C ： 将步骤A得到的提取液真空浓。

5、缩到原体积的1/51/15， 然后以浓缩后的提取 液和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余液 ； 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/5 1/7， 过 D101 大孔树脂进行 柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱， 洗脱流速为 1ml/ min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后冷冻 干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。 2. 根据权利要求 1 所述的一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。

6、的方法， 其特征在 于， 所述步骤 A 中的预处理是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 40 60 目筛。 3. 根据权利要求 1 所述的一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 其特征在 于， 所述步骤A中的脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为1g ： 10ml1g ： 20ml 的比例， 向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在 30 50下浸提 1 2h， 然后以 5000 转 / 分钟离心 15 分钟后弃上清液， 取残渣烘干。 4. 根据权利要求 1 所述的一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 其特征在 于， 所述步骤 B 中的碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g。 5. 。

7、根据权利要求 1 所述的一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 其特征在 于， 所述步骤 B 中的缓冲液是磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液。 6. 根据权利要求 1 所述的一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 其特征在 于， 所述步骤 B 中的超声提取的频率是 150 250W。 权 利 要 求 书 CN 103520372 A 2 1/5 页 3 一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法 技术领域 0001 本发明是关于酪氨酸酶抑制剂的提取方法， 特别涉及一种从茶叶籽粕中提取酪氨 酸酶抑制剂的方法。 背景技术 0002 黑色素沉积形成的各类色斑给现代人尤其是女性造成了生理和心理的困。

8、扰， 祛斑 已是众多女性美容的首要目标。研究表明， 酪氨酸酶是黑色素形成的关键酶。酪氨酸酶是 一类广泛存在于生物体内的铜结合酶， 通过将酪氨酸羟化， 产生 L-3,4- 二羟基苯丙氨酸 （L-DOPA） ， 然后再将 L-DOPA 进一步氧化成多巴醌， 从而形成黑色素。同时， 酪氨酸酶在果蔬 保存和运输过程产生的褐变中扮演着重要角色， 能降低果蔬的外观和品质， 从而降低其价 值。因此， 对酪氨酸酶的抑制不仅能有效抑制黑色素形成， 从而阻滞人体各类色斑的形成， 而且能有效防止果蔬褐变， 保持其品质和价值。 0003 茶叶籽粕是茶叶籽榨油后的固体残渣。自 2009 年 12 月卫生部批准将茶叶籽油。

9、列 入新食品资源， 茶叶籽油生产规模不断扩大， 造成茶叶籽粕这一加工副产物的产量也不断 增加。 研究表明， 茶叶籽粕中含有包括多酚、 多糖、 皂苷和蛋白等多种生物活性成分， 具有极 高的开发价值。 然而， 目前除少量茶叶籽粕被作为肥料低价值利用外， 这一生物资源还未被 有效开发。近年来， 从植物中提取安全而有效的天然酪氨酸酶抑制剂备受关注。目前还未 见从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的相关报道或专利。 发明内容 0004 本发明的主要目的在于克服现有技术中的不足， 提供一种能有效利用茶叶籽粕资 源， 且能提取出天然酪氨酸酶抑制剂的方法。为解决上述技术问题， 本发明的解决方案是 ： 0005 提供。

10、一种从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂的方法， 包括粉碎茶叶籽粕， 包括以 下具体步骤 ： 0006 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理后进行脱脂， 以茶叶籽粕和体积浓度 95% 的乙醇水溶液 为1g ： 15ml1g ： 25ml的比例， 向脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇水溶液， 在 40 50下提取 30 40min， 然后以 12000 转 / 分钟离心 20 分钟后， 得到滤渣和提取液 ； 0007 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和缓冲液为 1g ： 20ml 1g ： 30ml 的比例， 向步骤 A 得 到的滤渣中加入缓冲液， 在 40 60下浸提 2 3h， 再超声提取 。

11、10 20min 后， 以 12000 转 / 分钟离心 20 分钟， 得到提取液 ； 所述缓冲液为 PH 是 7 9， 且含占脱脂后茶叶籽粕干 重 3 5% 的碱性蛋白酶的缓冲液 ； 0008 步骤C ： 将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/51/15， 然后以浓缩后的 提取液和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余 液 ； 0009 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/5 1/7， 过 D101 大孔树脂 进行柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱， 洗脱流速为 说 明 书 CN。

12、 103520372 A 3 2/5 页 4 1ml/min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 0010 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。 0011 作为进一步的改进， 所述步骤 A 中的预处理是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 40 60 目 筛。 0012 作为进一步的改进， 所述步骤 A 中的脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正 己烷为 1g ： 10ml 1g ： 20ml 的比例， 向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在 30 50下 浸提 1 2h， 然后以 5000 转 。

13、/ 分钟离心 15 分钟后弃上清液， 取残渣烘干。 0013 作为进一步的改进， 所述步骤 B 中的碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g。 0014 作为进一步的改进， 所述步骤 B 中的缓冲液是磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液。 0015 作为进一步的改进， 所述步骤 B 中的超声提取的频率是 150 250W。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果是 ： 0017 本发明通过极性区别提取有效提高了目标物的萃取精度， 并通过酶法结合超声提 取大大提高了提取的效率， 适用于产业化生产。 同时， 本发明中制备的酪氨酸酶抑制剂一种 天然高效的酪氨酸酶抑制剂， 对酪氨酸酶的抑制效果显著。。

14、 此外， 本发明技术可以有效提高 茶叶籽粕资源的经济效益。 附图说明 0018 图 1 为本发明实施例中提取的酪氨酸酶抑制剂对酪氨酸酶的抑制效果对比图。 具体实施方式 0019 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述 ： 0020 本发明从茶果皮中提取血管紧张素转化酶抑制剂的方法具体步骤包括 ： 0021 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理， 预处理方法是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 40 60 目 筛 ； 茶叶籽粕预处理后进行脱脂， 脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为 1g ： 10ml 1g ： 20ml 的比例， 向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在 30 50下浸提。

15、 1 2h， 然后以5000转/分钟离心15分钟后弃上清液， 取残渣烘干。 以茶叶籽粕和体积浓度95% 的乙醇水溶液为 1g ： 15ml 1g ： 25ml 的比例， 向脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度 95% 的 乙醇水溶液， 在 40 50下提取 30 40min， 然后以 12000 转 / 分钟离心 20 分钟后， 得到 滤渣和提取液。 0022 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和缓冲液为 1g ： 20ml 1g ： 30ml 的比例， 向步骤 A 得 到的滤渣中加入缓冲液， 在 40 60下浸提 2 3h， 再用频率为 150 250W 的超声提取 10 20min 后， 以 。

16、12000 转 / 分钟离心 20 分钟， 得到提取液。所述缓冲液为 PH 是 7 9， 且含占脱脂后茶叶籽粕干重35%的碱性蛋白酶的缓冲液， 所述碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g， 缓冲液优选磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液。 0023 步骤C ： 将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/51/15， 然后以浓缩后的 提取液和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余 液 ； 0024 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/5 1/7， 过 D101 大孔树脂 说 明 书 CN 103520372 A 4 3/5 页。

17、 5 进行柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱， 洗脱流速为 1ml/min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 0025 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂。 0026 下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面地理解本发明， 但不以任何方 式限制本发明。 0027 实施例 1 0028 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理， 预处理方法是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 40 目筛 ； 茶叶 籽粕预处理后进行脱脂， 脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷。

18、为 1g ： 10ml 的比 例， 向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在 30下浸提 2h， 然后 5000 转 / 分钟， 离心 15 分钟后弃上清液， 取残渣烘干 ； 以茶叶籽粕和体积浓度 95% 的乙醇为 1g ： 15mlml 的比例， 向 20g 脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度 95% 的乙醇， 在 40下提取 40min， 然后 12000 转 / 分钟， 离心 20 分钟后， 得到滤渣和提取液 ； 0029 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 1g ： 20ml 的比 例， 向步骤 A 得到的滤渣中加入磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液， 在。

19、 40下浸提 3h， 再用频 率为 150W 的超声提取 20min 后， 12000 转 / 分钟， 离心 20 分钟， 得到提取液 ； 所述磷酸氢二 钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 PH 是 7， 且含占脱脂后茶叶籽粕干重 3% 的碱性蛋白酶的缓冲液， 所述碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g ； 0030 步骤 C ： 将步骤 A 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/5， 然后以浓缩后的提取液 和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余液 ； 0031 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/5， 过 D101 大孔树脂进。

20、行 柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱， 洗脱流速为 1ml/ min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 0032 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂 0.72g， 得率为 3.6%（占脱脂后茶叶籽 粕干重） 。 0033 实施例 2 0034 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理， 预处理方法是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 50 目筛 ； 茶叶 籽粕预处理后进行脱脂， 脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为 1g ： 15ml 的比 例， 向预处理。

21、后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在 40下浸提 1.5h， 然后 5000 转 / 分钟， 离心 15分钟后弃上清液， 取残渣烘干 ； 以茶叶籽粕和体积浓度95%的乙醇为1g ： 20ml的比例， 向 20g 脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度 95% 的乙醇， 在 45下提取 35min， 然后 12000 转 / 分钟， 离心 20 分钟后， 得到滤渣和提取液 ； 0035 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 1g ： 25ml 的比 例， 向步骤 A 得到的滤渣中加入磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液， 在 50下浸提 2.5h， 再用 频率为 200W 的超。

22、声提取 15min 后， 12000 转 / 分钟， 离心 20 分钟， 得到提取液 ； 所述磷酸氢 二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 PH 是 8， 且含占脱脂后茶叶籽粕干重 4% 的碱性蛋白酶的缓冲 液， 所述碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g ； 0036 步骤C ： 将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/10， 然后以浓缩后的提取液 说 明 书 CN 103520372 A 5 4/5 页 6 和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余液 ； 0037 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/6， 过 D101 大。

23、孔树脂进行 柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱， 洗脱流速为 1ml/ min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 0038 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂 0.86g， 得率为 4.3%（占脱脂后茶叶籽 粕干重） 。 0039 实施例 3 0040 步骤 A ： 将茶叶籽粕预处理， 预处理方法是将茶叶籽粕粉碎， 然后过 60 目筛 ； 茶叶 籽粕预处理后进行脱脂， 脱脂方法是 ： 按照预处理后的茶叶籽粕和正己烷为 1g ： 20ml 的比 例， 。

24、向预处理后的茶叶籽粕中加入正己烷， 在50下浸提1h， 然后5000转/分钟， 离心15分 钟后弃上清液， 取残渣烘干 ； 以茶叶籽粕和体积浓度 95% 的乙醇为 1g ： 25ml 的比例， 向 20g 脱脂后的茶叶籽粕中加入体积浓度95%的乙醇， 在50下提取30min， 然后12000转/分钟， 离心 20 分钟后， 得到滤渣和提取液 ； 0041 步骤 B ： 以步骤 A 得到的滤渣和磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 1g ： 30ml 的比 例， 向步骤 A 得到的滤渣中加入磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液， 在 60下浸提 2h， 再用频 率为 250W 的超声提取 10min 。

25、后， 12000 转 / 分钟， 离心 20 分钟， 得到提取液 ； 所述磷酸氢二 钠 - 磷酸二氢钠缓冲液为 PH 是 9， 且含占脱脂后茶叶籽粕干重 5% 的碱性蛋白酶的缓冲液， 所述碱性蛋白酶的活力不小于 20000U/g ； 0042 步骤C ： 将步骤A得到的提取液真空浓缩到原体积的1/15， 然后以浓缩后的提取液 和氯仿的体积比为 1 ： 1 的比例， 向浓缩后的提取液中加入氯仿进行萃取， 得到萃余液 ； 0043 步骤 D ： 将步骤 B 得到的提取液真空浓缩到原体积的 1/7， 过 D101 大孔树脂进行 柱层析， 用体积浓度分别为 20、 60和 100的乙醇溶液进行梯度洗脱。

26、， 洗脱流速为 1ml/ min， 收集 60% 乙醇洗脱液 ； 0044 步骤 E ： 将步骤 C 中得到的萃余液和步骤 D 中得到的 60% 乙醇洗脱液混合， 浓缩后 冷冻干燥， 即得到从茶叶籽粕中提取酪氨酸酶抑制剂 0.98g， 得率为 4.9%（占脱脂后茶叶籽 粕干重） 。 0045 将上述 3 个实施例的酪氨酸酶抑制剂进行酪氨酸酶抑制效果验证 ： 将从茶叶籽粕 中提取酪氨酸酶抑制剂溶解于蒸馏水中， 取 100l 上述溶液， 加入 PH 为 6.8 的磷酸盐缓冲 液 56l 与 2.0mmol/L 的酪氨酸溶液 94l， 待混合均匀后， 在冰浴中迅速加入酪氨酸酶溶 液 50l(50U)。

27、， 在 37中温育 10min， 于 490nm 处测定吸光度。 0046 酪氨酸酶抑制率计算如下 ： 0047 酪氨酸酶抑制率 (%)=(a-b)-(c-d)/a-b100 0048 a ： 未加提取物而加酶的混合液所测的吸光度 ； 0049 b ： 未加提取物也未加酶的混合液所测的吸光度 ； 0050 c ： 加提取物和酶的混合液所测的吸光度 ； 0051 d ： 加提取物而未加酶的混合液所测的吸光度。 0052 如图 1 所示， 从实验数据可以看出， 应用本发明技术从茶叶籽粕中提取的酪氨酸 酶抑制剂对酪氨酸酶具有显著的抑制作用， 并且呈现剂量依赖效应， 可以应用于美容祛斑 说 明 书 CN 103520372 A 6 5/5 页 7 等药物和保健品开发， 以及果蔬护色保鲜等领域。 说 明 书 CN 103520372 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 103520372 A 8 。