一种检测人体汗液分泌物的方法.pdf

《一种检测人体汗液分泌物的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种检测人体汗液分泌物的方法.pdf（18页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 103536296 A (43)申请公布日 2014.01.29 CN 103536296 A (21)申请号 201310493627.0 (22)申请日 2013.10.18 A61B 5/117(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/532(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 苏彬 何亚芸 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 一种检测人体汗液分泌物的方法 (57) 摘要 本发明公开了。

2、一种检测人体汗液分泌物的方 法， 包括 ： 将指印转移到基底上， 得到指印样本 ； 往所述指印样本的指印上加入纳米金标记的待检 测目标分泌物抗体溶液进行孵育， 孵育完成后用 洗涤溶液进行冲洗 ； 将所述的指印样本干燥， 然 后向指印上加入银染液， 避光显色后， 将指印样本 冲洗、 干燥， 判断 ： 若显示指纹， 则指印中含有待 检测目标分泌物 ； 否则， 则指印中不含有待检测 目标分泌物。 本发明检测手指分泌物的方法， 可简 单、 快速、 特异的检测目标分泌物， 同时还可对含 目标分泌物的对象进行人身识别。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 6 页 (19)中。

3、华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图6页 (10)申请公布号 CN 103536296 A CN 103536296 A 1/1 页 2 1. 一种检测人体汗液分泌物的方法， 其特征在于， 包括 ： （1） 将汗潜指印转移到基底上， 得到指印样本 ； （2） 往所述指印样本的汗潜指印上加入纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液进行 孵育， 孵育完成后用洗涤溶液进行冲洗 ； （3） 将所述的指印样本干燥， 然后向汗潜指印上加入银染液， 避光显色后， 将指印样本 冲洗、 干燥， 判断 ： 若显示指纹， 则汗潜指印中含有待检测目标分泌物 ； 否则， 则汗。

4、潜指印中不含有待检测 目标分泌物。 2. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 若显示指纹， 通过扫描电化学显 微镜读取指印样本的指纹特征。 3. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的基底为玻璃板、 塑料板、 不锈钢板、 锡 箔、 硬纸片或胶带。 4. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的待检测目标分泌物为表皮生长因子、 溶菌酶或可替宁。 5. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体 溶液的浓度为 0.05 0.2mg/mL。 6. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述纳米金标记的待检测。

5、目标分泌物抗体 溶液的溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 PBS。 7. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述孵育的时间为 10-45min。 8. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述的洗涤溶液为含 0.1% 吐温 -20 的 PBS。 9. 如权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述避光显色的时间为 15 20min。 权 利 要 求 书 CN 103536296 A 2 1/10 页 3 一种检测人体汗液分泌物的方法 技术领域 0001 本发明属于生物分析和指纹检测技术领域， 尤其涉及一种检测人体汗液分泌物的 方法。 背景技术 0002 指纹。

6、是人类手指末端指腹上由凹凸的皮肤所形成的纹路， 在皮肤发育过程中形成 并定型， 具有特殊的生理结构和特征体系。 在人类的进化过程中， 指纹的生理用途是使手在 接触物件时增加摩擦力， 从而更容易发力及抓紧物件。 后来人们又根据其特异性和不变性， 将其应用于人身识别及法医鉴定， 并延伸到日常生活中的安全检验、 个人认证等领域。 0003 指印根据能否被肉眼直接可见分为明显指印和潜在指印， 明显指印一般由手沾油 漆、 血液、 墨水等物品转印而成 ； 潜在指印则是经身体自然分泌物如汗液， 转移形成的指纹 纹路， 目视不易发现， 是案发现场中最常见的指纹。一枚普通的汗指印约为 0.11mg， 其中 99。

7、% 是水， 剩下 1% 中有一半是氯化钠等无机物， 另一半则是油脂、 溶菌酶、 氨基酸等有机物。 正是这些微量有机物让科学家在常规的光学显现以及物理吸附法之外， 发展出很多化学显 现指纹的方法。近年来研究者利用质谱成像、 红外 / 拉曼成像及免疫标记成像等新技术进 行指纹显现及指纹成分的检测， 从而发掘出更多有价值的生物学和医学信息。 比如， 恐怖分 子是否接触过爆炸物、 一个人是否具有吸烟的习惯， 科学家都可以通过指纹检测来获取相 关信息。 0004 1989年Saunders （74th Annual Enducational Conference,Penacola,USA,1989） 提。

8、出用多金属沉积法显现潜在指印。其原理是将按有指印的样本放入柠檬酸金中浸泡， 一 段时间后其中的纳米金粒子就会吸附到指印的嵴上， 接着用银染液显影样本， 由于纳米金 对银离子的还原具有催化的能力， 所以银单质会更快的在嵴上析出， 使指印的嵴变黑加粗 显现出来。该方法中纳米金对指印吸附时的选择性会直接影响显现效果， 而且影响结果的 因素很多， 如溶液pH。后来又有很多科学家对该方法进行改进 （如公开号为 CN 101703404A 的中国专利共公开的 “显现多种客体表面指纹且保留 DNA 信息的方法” ） ， 利用的都是纳米 金与指印的亲疏水性和静电吸附， 但是仍然非特异性吸附严重， 影响指纹成像。

9、效果， 且操作 繁琐。 发明内容 0005 本发明提供了一种检测人体汗液分泌物的方法， 可简单、 快速、 特异的检测目标分 泌物， 同时还可对含目标分泌物的对象进行人身识别。 0006 一种检测人体汗液分泌物的方法， 包括 ： 0007 （1） 将汗潜指印转移到基底上， 得到指印样本 ； 0008 （2） 往所述指印样本的汗潜指印上加入纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液 进行孵育， 孵育完成后用洗涤溶液进行冲洗 ； 0009 （3） 将所述的指印样本干燥， 然后向汗潜指印上加入银染液， 避光显色后， 将指印 说 明 书 CN 103536296 A 3 2/10 页 4 样本冲洗、 干燥， 。

10、判断 ： 0010 若显示指纹， 则汗潜指印中含有待检测目标分泌物 ； 否则， 则汗潜指印中不含有待 检测目标分泌物。 0011 当手指皮肤接触到物体时， 皮肤上的分泌物就会在其表面留下痕迹， 形成指纹的 镜像图。指印由汗垢和油垢组成的嵴线区域和空白的峪线区域组成。指纹的嵴线除大部分 水分外， 还含有机脂肪酸、 氨基酸、 溶菌酶和表皮生长因子等人体分泌物。 0012 2006 年， 英国东英格兰大学的法医学专家 David Russell 曾提出， 吸烟者的汗液 里会分泌可替宁 （尼古丁的一种代谢产物） ， 借此鉴识人员可以通过检测指纹中的可替宁， 来判断指纹所有者是否吸烟。2007 年， R。

11、ussell 研究组成功实现了这一设想， 后来其还证实 了吸毒人员的汗液中会存在相关的毒品代谢物。因此， 若人具有吸烟、 吸毒习惯等等， 其汗 液中便会分泌出与烟、 毒品相应的特征代谢物。 0013 因此， 本申请利用免疫反应的特异性识别机制实现代谢物检测与人身识别的结 合。若汗潜指印中含有待检测目标代谢物， 则携带有待检测目标分泌物抗体的纳米金颗粒 即可定向结合到指纹嵴线上， 经银单质沉积显色就可区分出指纹的轮廓和结构， 显现出可 视化的指纹纹路， 同时还可进一步根据显现的指纹来达到人身识别的目的， 若经本申请的 方法处理后未显现指纹， 则汗潜指印中不含有待检测的目标代谢物。 0014 步骤。

12、 （3） 中， 将指印样本冲洗、 干燥后， 若指纹显现， 则可通过扫描电化学显微镜进 一步读取指印样本的指纹特征。扫描电化学显微镜 （SECM） 在含有银单质的嵴线上和几乎 不含银的峪线处扫描得到的电流大小具有差异， 可将地理位置特征转化成电流信号， 进一 步转化为图像后放大指纹细节。SECM 能精确到纳米级尺寸， 可最大限度地放大指纹细节。 0015 作为指印的承载物， 本申请对基底并没有严格要求， 所述的基底为玻璃板、 塑料 板、 不锈钢板、 锡箔、 硬纸片、 胶带、 合金、 载玻片、 导电铜贴、 手机膜、 糖果纸等。 0016 所述的待检测目标分泌物为表皮生长因子、 溶菌酶或可替宁。 0。

13、017 所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的浓度为 0.05 0.2mg/mL， 优选 为0.10.2mg/mL。 抗体溶液的浓度过高不仅浪费试剂， 还会导致非特异性结合， 或显色背 景重， 而浓度过低， 则会导致抗原与抗体的反应不完全， 银染效果差， 从而影响指纹成像效 果。其中， 纳米金的粒径为一般为 15nm。 0018 所述纳米金标记的待检测目标分泌物抗体溶液的溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 PBS， PBS 的浓度为 0.01M， pH 为 7.4。PBS 中添加适量的 BSA 和吐温 -20 后可降低抗体对 基底的吸附作用， 使指纹图像更清晰。 0019 。

14、为使反应充分进行， 所述孵育的时间为 10-45min， 优选为 15min。 0020 所述的洗涤溶液为含 0.1% 吐温 -20 的 PBS。 0021 所述的银染液为 Sigma-aldrich 银增强溶液， 购买公司为 Sigma-aldrich， 包括 A 液和 B 液， 其中 A 液货号为 S5020， B 液货号为 S5145， 使用时将 A 液和 B 液按体积比 1 ： 1 混 合。 0022 所述避光显色的时间为 15 20min， 优选为 15min。显色时间过长过短均不利于 指纹的清晰成像， 若时间太短反应不充分， 时间太长则背景过深。 0023 与现有技术相比， 本发明。

15、的有益效果为 ： 0024 （1） 本发明的方法基于免疫与多金属沉积， 特异性高， 并且还可通过显现的指纹对 说 明 书 CN 103536296 A 4 3/10 页 5 含目标分泌物的对象进行人身识别， 且指纹显现清晰， 指纹显现后可通过肉眼观察到指纹 细节特征的一级和二级结构， 目标分泌物含量高的情况下可以观察到三级结构汗腺孔。 0025 （2） 电化学扫描显微镜 （SECM） 发明于 1989 年， 并得以商业化。SECM 测量的是由化 学物质氧化或还原给出的电化学电流， 样品不限制于导体， 也可以是绝缘体或半导体。 SECM 除了能给出样品表面的形貌外， 还能提供丰富的化学信息。本发。

16、明的方法在利用 SECM 显现 后可克服深色背景的干扰， 对基底的导电性无要求， 并能清晰地显现三级汗腺孔结构， 是残 缺指印识别的重要依据。 0026 （3） 本发明在指纹显现方面与刷粉等传统方法相比， 所需药品毒害小， 有利于保护 操作人员的安全和减少对环境的污染。 0027 （4） 在汗液分泌物检测方面， 该方法与质谱、 红外等相比， 具有无需大型仪器辅助、 操作简便、 结果目视可见等优点。 0028 （5） 与荧光法相比， 本发明的方法不需要外加激发光源， 因此不存在背景光干扰， 指纹图像更加显著清晰。 0029 （6） 本发明的方法在对人体代谢物测试的同时可获取被测试者的身份信息， 。

17、故可 推广使用于违禁药品毒品的纠察、 刑侦及日常安全如毒驾、 酒驾的监察中。 附图说明 0030 图 1 为人体汗液分泌物检测的操作流程图。 0031 图 2 为 SECM 成像系统的结构示意图 ； 0032 图 3 为图 2 所示的 SECM 成像系统中样品反应池的结构示意图 ； 0033 其中， 1、 样本反应池 ； 2、 双恒电位控制仪 ； 3、 三维定位装置 ； 4、 底座 ； 5、 池体 ； 6、 凹 槽 ； 7、 O 型密封圈 ； 8、 螺栓 ； 9、 电极孔 ； 10、 工作电极 ； 11、 对电极 ； 12、 参比电极 ； 13、 计算机。 0034 图 4a 为用纳米金标记的。

18、羊抗人 IgG 抗体 （PBS 稀释） 检测得到的人免疫球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0035 图 4b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （PBS-T-BSA 稀释） 检测得到的人免疫球 蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0036 图 5a 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 浓度为 0.02mg/mL) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0037 图 5b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 浓度为 0.20mg/mL) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0038 图 5c 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 浓度为 0.40mg。

19、/mL) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0039 图 6a 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 显色时间为 10min) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0040 图 6b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 显色时间为 15min) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0041 图 6c 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 ( 显色时间为 20min) 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0042 图 7a 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （孵育时间为 5min） 检测得到的人免疫球 说 明 书 C。

20、N 103536296 A 5 4/10 页 6 蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0043 图 7b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （孵育时间为 15min） 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0044 图 7c 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （孵育时间为 60min） 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0045 图 8a 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （孵育温度为常温 202） 检测得到的 人免疫球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0046 图 8b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （孵育温度为 37） 检测得到的人免疫球 蛋白。

21、 G 模拟指印银染显色图。 0047 图 9a 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （洗涤溶液为 PBS） 检测得到的人免疫球 蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0048 图 9b 为用纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体 （洗涤溶液为 PBS-T） 检测得到的人免疫 球蛋白 G 模拟指印银染显色图。 0049 图 10 为用纳米金标记的可替宁抗体检测得到的潜在指纹银染显色图。 0050 图 11 为用纳米金标记的溶菌酶抗体检测得到的潜在指纹银染显色图。 0051 图 12 是表皮生长因子 （EGF） 作为检测目标物， 经免疫多金属沉积后的指纹图像。 0052 图 13 为人免疫球蛋白 G（hIg。

22、G） 模拟指印经免疫多金属沉积后的图像及用 SECM 局部放大后的图像。 0053 图 14 为人免疫球蛋白 G（hIgG） 模拟指印在不同基底上经免疫多金属沉积后的图 像。 具体实施方式 0054 下面结合具体实施方式进一步阐释本发明。 0055 SECM 成像系统可采用常规的结构， 具体购自上海辰华仪器公司， 型号为 CHI920C。 0056 如图 2 和图 3 所示， SECM 成像系统包括样本反应池 1、 双恒电位控制仪 2、 高分辨 的三维定位装置 3 和计算机 13。 0057 双恒电位控制仪 2 包括工作电极 10、 对电极 11 和参比电极 12， 计算机 13 对整个 过程。

23、进行操控， 其中， 工作电极为直径 25m 的超微电极 （Pt） ， 对电极为铂丝， 参比电极为 Ag 电极。 0058 三维定位装置 3 由步进电机与压电晶体组成， 可对超微电极进行三维定位， 允许 50 毫米的运行距离并达到纳米的空间分辨。 0059 样本反应池1包括底座4和用于容纳反应液的池体5， 均可采用聚四氟乙烯材料或 其他不会被反应液腐蚀的材料。底座 4 上具有用于样本的凹槽 6。 0060 池体5通过螺栓8固定在底座4上， 池体5的两侧各设有一个电极孔9， 工作时， 参 比电极 12 放置于其中一个电极孔内， 对电极 11 放置于另一个电极孔内， 池体 5 中空， 池体 5 的中。

24、空部位正对凹槽 6， 且该中空部位设有 O 型密封圈 7。 0061 将免疫多金属沉积后的指印样本固定于 SECM 成像系统的样本反应池底座的凹槽 6 中， 向池体 5 内加入反应液 （反应液为含有 1mM 氯铱酸钾的硝酸钾水溶液 （0.1M） ） ， 反应液 液面要能没过参比电极和对电极 ； 将反应池放置于 SECM 平台上， 在 “探针趋近模式” 下施加 说 明 书 CN 103536296 A 6 5/10 页 7 0.8V 的电位将探针靠近指纹表面 ； 确定需要进行扫描的区域， 选择 “探针扫描模式” 分别 沿着 X 和 Y 方向扫描， 根据单线电流的变化趋势调节平台使其尽量趋于水平。。

25、最后选择 “扫 描电化学显微镜模式” 采集指纹细节图像。 0062 下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。 0063 本发明可基于免疫多金属沉积和 SECM 显现指印并检测目标分泌物， 将承载有汗 指印的样本经纳米金修饰的抗体溶液孵育， 洗涤氩气吹干后， 加入银染液显影， 用滤纸吸去 银染液后用水冲洗吹干。 接着将其固定于反应池中， 加入反应液， 施加电位后扫描采集指纹 图像。 0064 在本发明中， SECM 的探头先移动至指纹表面， 然后在 X-Y 的平面上进行扫描。由 于探头很靠近指纹， 当移动到指纹不同位置时， 其电流会因为指纹嵴上的银单质对溶液中 反应的促进作用而增大， 得到产。

26、生电流与位置相关的图像。将各个点电流用不同颜色的点 代表， 就可以还原指纹细节。 0065 纳米金标记的可替宁抗体由杭州隆基生物技术有限公司合成 ； 纳米金标记的羊抗 人 IgG 抗体纳米金标记的羊抗人表皮生长因子抗体和纳米金标记的溶菌酶抗体由上海生 工生物股份有限公司合成， 其中， 纳米金为粒径 15nm 的柠檬酸修饰的金纳米粒子， 羊抗人 IgG 抗体的货号为 DAC1011（生工生物工程有限公司） ， 溶菌酶抗体的货号为 DAC1011（生工 生物工程有限公司） ， 羊抗人表皮生长因子抗体的货号为 DA1709。 0066 银染液 ： 购买公司为 Sigma-aldrich， 包括 A 。

27、液和 B 液， 其中， A 液货号为 S5020， B 液货号为 S5145。 0067 实施例 1 0068 1、 抗体溶剂对指纹成像的影响 0069 （1） 基底处理 0070 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0071 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0072 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0073 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成。

28、一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4 ； 以 pH 为 7.4 的 PBS 为对照） ， 常温孵育 15min ； 0074 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气。

29、吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。 0075 如图 4a 和图 4b 所示， 采用 PBS 稀释纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体， 抗体对基底吸 附严重 （图 4a） ， 指纹成像不清晰， 在 PBS 中添加了吐温和 BSA 后， 明显减少了其对基底的吸 附， 指纹纹理清晰 （图 4b） 。 0076 2、 不同浓度的纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶液对指纹成像的影响 说 明 书 CN 103536296 A 7 6/10 页 8 0077 （1） 基底处理 0078 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑。

30、物。 0079 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0080 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0081 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶液 （溶剂为 含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 15min ； 0082 孵育完成后用洗涤溶液 （。

31、0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。 0083 图 5a-5c 示出了纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶液的浓度分别为 0.02、 0.20、 0.40mg/mL 时采集的指纹图像， 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶液的浓度太低 （0.02mg/ mL） ， 银染显色效果不够明显 （。

32、图 5a） ； 浓度太高 （0.40mg/mL）会使背景颜色加深 （图 5c） ； 0.20mg/mL 的显色效果最好 （图 5b） 。 0084 3、 银染显色时间对指纹成像的影响 0085 （1） 基底处理 0086 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0087 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0088 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0089 （3） 免疫多金属沉积成像 ：。

33、 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 15min ； 0090 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样。

34、本可直接用肉眼 进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。 0091 图 6a-6c 示出了避光显色时间分别为 10、 15、 25min 时采集的指纹图像， 银染时间 太短 （10min） ， 颜色较浅， 显色不够深 （图 6a） ； 银染时间太长 （25min） ， 会使背景颜色加深 （图 6c） ； 显色 15min 较为合适 （图 6b） 。 0092 4、 孵育时间对指纹成像的影响 0093 （1） 基底处理 0094 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0095 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 说 明 书 CN 10。

35、3536296 A 8 7/10 页 9 0096 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0097 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 ； 0098 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.。

36、4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。 0099 图 7a-7c 示出了孵育时间分别为 5、 15、 60min 时采集的指纹图像， 银染时间太短 （5min） ， 颜色较浅， 显色不够深 （图 7a） ； 孵育时间太长 （60min） ， 会使非特异性吸附增多且浪 费时间 （图 7c） ； 孵育 15min 。

37、较为合适 （图 7b） 。 0100 5、 孵育温度对指纹成像的影响 0101 （1） 基底处理 0102 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0103 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0104 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0105 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/。

38、mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 孵育 15min ； 0106 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。 0107 图 8a-8b 示出了孵育温度分别为常温 。

39、（202） 和 37时采集的指纹图像， 发现 常温条件下 （图 8a） 和 37（图 8b） 时银染效果没有明显差异， 故从实验简便考虑选择常温 下进行孵育。 0108 6、 洗涤剂溶液对指纹成像的影响 0109 （1） 基底处理 0110 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0111 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0112 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0113 （3） 免。

40、疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 15min ； 说 明 书 CN 103536296 A 9 8/10 页 10 0114 孵育完成后用洗涤溶液冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色 后的样本可直接用肉眼进行观察。

41、， 或用数码相机拍照采集图像。 0115 图 9a-9b 示出了洗涤溶液分别为 PBS（0.01M， pH7.4） 和 PBS-T（0.01M 含 0.1% 吐 温 -20 的 PBS， pH7.4） 时采集的指纹图像， 使用含 tween-20 的洗涤溶液得到的显色图像 （图 9b） 比不含 tween-20 的洗涤溶液得到的图像 （图 9a） 中二级和三级结构更清晰。 0116 实施例 2 基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的可替宁 0117 （1） 基底处理 0118 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0119 （2） 汗潜指印样。

42、本的制备 ： 吸烟者用香皂将手洗净， 热风吹干后， 戴上 PE 手套捂汗 5min， 然后在基底上按 1min， 得到汗潜指印。 0120 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的可替宁抗体溶液 （溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温培养 15min ； 0121 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲。

43、洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。图像如图 10， 可见指纹图像纹理清晰可见。 0122 实施例 3 基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的溶菌酶 0123 （1） 基底处理 0124 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 （2） 汗潜指印样本的制备 ： 测试者用香皂将手洗净， 热风吹干后， 戴上 PE 手套捂 汗 5min， 然后在基底上按 1mi。

44、n， 得到汗潜指印。 0125 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中添加 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的溶菌酶抗体溶液 （溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 15min ； 0126 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室。

45、中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 0127 经显色后的样本可直接用肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像， 图像如图 11， 可见指纹图像纹理清晰可见。 0128 实施例 4 基于免疫多金属沉积显现指印并检测指纹中的表皮生长因子 0129 （1） 基底处理 0130 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0131 （2） 汗潜指印样本的制备 ： 吸烟者用香皂将手洗净， 热风吹干后， 戴上 PE 手套捂汗 5min， 然后在基底上按 1min， 得到汗潜指印。 0132 （3）免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围。

46、画一个圈， 形成一个反应 说 明 书 CN 103536296 A 10 9/10 页 11 池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的表皮生长因子 （EGF）抗体溶液 （溶剂为含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温培养 15min ； 0133 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗。

47、室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集图像。图像如图 12， 可见指纹图像纹理清晰可见。 0134 实施例 5 基于免疫多金属沉积和 SECM 显现指印并检测人免疫球蛋白 G 模拟指印 0135 （1） 基底处理 0136 基底为专业指印提取胶带， 其没有黏性的一面用双面胶固定在载玻片上， 将其作 为支撑物。 0137 （2） 人免疫球蛋白 G 模拟指印样本的制备 ： 0138 试验者首先用肥皂将手洗净， 去离子水冲洗后用吹风机吹干， 在手指上涂抹上 1mg/mL 的人免疫球蛋白 G 溶液 25L， 待干后轻轻按在。

48、胶带上 2min， 得到模拟的蛋白指印。 0139 （3） 免疫多金属沉积成像 ： 用免疫组化笔在指印周围画一个圈， 形成一个反应池， 以避免抗体溶液扩散， 向反应池中加入 100L 0.1mg/mL 纳米金标记的羊抗人 IgG 抗体溶 液 （含 2%BSA， 0.1% 吐温 -20 的 0.01M PBS， pH 为 7.4） ， 于常温孵育 15min ； 0140 孵育完成后用洗涤溶液 （0.01M， pH 7.4， 含 0.15M NaCl、 0.1%（v/v） Tween-20 的 磷酸盐缓冲溶液） 冲洗以洗去未结合的抗体， 用氩气将表面吹干， 再加入 200L 银染液 （A ： B=1 ： 1） ， 于暗室中避光显色 15min， 用去离子水冲洗后氩气吹干 ； 经显色后的样本可直接用 肉眼进行观察， 或用数码相机拍照采集得图 13 中 （a） 所示图像。 0141 （4） SECM 放大指印细节 0142 将免疫多金属沉积后的指印样本固定于 SECM 成像系统的样本反应池中， 向池体 内加入反应液 （反应液为含有氯铱酸钾 （1mM） 的硝酸钾水溶液 （0.1M） ） ， 放置于 SECM 平台上 并调节使其水平， 施加 0.8V 的电位将探针靠近指纹表面， 选择需要进行扫描的区域， 扫描 采集指纹细节图像如图 1。