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1、(10)申请公布号 CN 102755356 A (43)申请公布日 2012.10.31 CN 102755356 A *CN102755356A* (21)申请号 201110109524.0 (22)申请日 2011.04.28 A61K 36/06(2006.01) A61K 31/365(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61P 31/16(2006.01) (71)申请人 丽丰实业股份有限公司 地址 中国台湾台南市官田区二镇里工业路 48 号 (72)发明人 黄瑞龄 陈立耿 黄俊智 (74)专利代理机构 广州三环专利代理有限公司 44202 代理人 倪小敏。
2、 (54) 发明名称 抗病毒药物组合物 (57) 摘要 本发明公开一种抗病毒的药物组合物， 尤其 是一种抗 B 型肝炎病毒的药物组合物。一种抗病 毒药物组合物， 包含有效剂量的樟芝萃取物， 所述 樟芝萃取物含有抗病毒成分 4- 乙酰樟芝醌醇 B。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种病毒药物组合物， 其特征在于包含有效剂量的樟芝萃取物， 所述樟芝萃取物中 含有 4- 乙酰樟芝醌醇 B。 2.如权利要求1所述的抗病毒药物组合。
3、物， 其特征在于4-乙酰樟芝醌醇B具有抑制病 毒的效果。 3.如权利要求2所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于所述病毒为B型肝炎病毒、 肠病 毒或 A 型流感病毒。 4. 如权利要求 2 所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于所述病毒为野生型 B 型肝炎病 毒或抗干安能 B 型肝炎突变病毒。 5.如权利要求4所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗野生型B型肝炎病毒的4-乙 酰樟芝醌醇 B 的浓度为 0.17188g/ml 0.39063g/ml。 6.如权利要求4所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗野生型B型肝炎病毒的4-乙 酰樟芝醌醇 B 的浓度为 0.97656g/ml 0.58594g/。
4、ml。 7.如权利要求4所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗野生型B型肝炎病毒的4-乙 酰樟芝醌醇 B 的浓度为 0.78125g/ml。 8. 如权利要求 4 所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗干安能 B 型肝炎突变病毒的 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的浓度为 4.6875g/ml 1.5625g/ml。 9. 如权利要求 4 所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗干安能 B 型肝炎突变病毒的 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的浓度为 3.9063g/ml 2.3438g/ml。 10.如权利要求4所述的抗病毒药物组合物， 其特征在于抗干安能B型肝炎突变病毒的 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的浓度为 3。
5、.125g/ml。 权 利 要 求 书 CN 102755356 A 2 1/6 页 3 抗病毒药物组合物 技术领域 0001 本发明涉及一种抗病毒药物组合物， 尤其涉及一种抗 B 型肝炎病毒的药物组合 物。 背景技术 0002 B 型肝炎是世界上最为常见的传染性肝病， 它是由 B 型肝炎病毒 (HBV) 引起， 这一 病毒侵害肝脏。通常大多数成人都能够抵抗 B 型肝炎病毒， 并能复原， 但是也有许多成人无 法抵抗B型肝炎病毒， 也包括大多数受到传染的婴儿和儿童， 他们被诊断为B型肝炎的慢性 病毒带原者， 病毒可在其血液和肝脏很长时间， 且他们可能将病毒传染给他人。 目前全球有 二十亿人 ( 。
6、将近有三分之一人口 ) 已受到 B 型肝炎病毒传染， 许多人成功抵抗病毒并痊愈， 但是也有四亿人口无法抵抗病毒而变成慢性携带病毒者， 在所有族裔中， 亚裔患 B 型肝炎 的比率最高 ； 美国亚太裔患慢性 B 肝炎的比率多达 15， 其它美国人只占 0.3， 在美国大 概有一百五十万的 B 型肝炎病毒携带者， 亚太裔占了一半以上。 0003 目前治疗B型肝炎病毒的方法中， 干扰素注射剂可以抑制B肝病毒的复制， 降低肝 脏发炎程度， 但是副作用大， 疗效有限， 因此使用的机会并不多。近年来， 口服抗 B 型肝炎病 毒药物陆续被开发出来， 最早上市的为干安能拉米夫定 (Lamivudine)， 商品。
7、名为 Zeffix， 可以抑制病毒的复制降低肝脏发炎， 但缺点是停药后容易复发， 甚至产生抗药性 ； 另一种口 服抗B肝药物则是干适能阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil)， 商品名为Hepsera， 与干安能 疗效差不多， 但较不会发生抗药性， 对干安能无效之案例也有效， 但药价贵许多， 而且有潜 伏的肾毒性， 通常当第二线使用。因此， 开发新的抗病毒药物是目前医界普遍之目标。 0004 樟芝(Antrodia camphorate)(Zang & Su ； S.-H Wu ； Ryvaren &T.T.Chang)， 又 称樟菇， 属于台湾国宝级的珍贵药用真菌， 经常被应用于养。
8、生保健的用途。 一般民间对于樟 芝的称呼为樟菰、 樟内菇、 牛樟菇、 牛樟芝、 红樟或红樟芝， 是台湾特有种的菇菌类， 全世界 只生长在台湾山区海拔 450 1500 公尺间的牛樟树干腐朽的心材内壁或枯死倒伏的牛樟 木材阴暗潮湿的表面， 非常珍贵稀少， 因此又被成为 “台湾森林中的宝石” 。 樟芝中含有的多 醇体可活化细胞、 改善体质， 增进人体内的免疫调节， 其中另一主要有效成份 - 三萜类化合 物， 应用于抗癌 / 抗发炎及保肝功能， 亦已在市场行销广为认可， 因而樟芝有药用真菌之王 的美誉。 发明内容 0005 针对上述内容， 本发明的目的是提供一种新型抗病毒的药物组合物。 0006 为。
9、实现上述目的， 本发明采取的技术方案为 ： 一种抗病毒的药物组合物， 包含有效剂量的樟芝萃取物， 所述樟芝萃取物含有抗病毒成分 ： 4- 乙酰樟芝醌醇 B(4-acetyl-antroquinonol)， 所述 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的结构式 (I) 如下。 0007 说 明 书 CN 102755356 A 3 2/6 页 4 0008 所述樟芝萃取物为樟芝菌丝体萃取物、 樟芝子实体萃取物或樟芝发酵液。 0009 本 发 明 所 述 抗 病 毒 成 分 4- 乙 酰 樟 芝 醌 醇 B，其 英 文 名 称 为 4-acetyl-antroquinonol， 如结构式 (I) 所示。 001。
10、0 本发明所述病毒包括野生型 B 型肝炎病毒、 抗干安能 (Lamivudine-Resistant)B 型肝炎突变病毒、 肠病毒以及 A 型流感病毒。 0011 在本发明的较佳实施例中， 抗野生型 B 型肝炎病毒的 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的浓度为 0.17188g/ml 0.39063g/ml， 较佳地为 0.97656g/ml 0.58594g/ml， 最佳地为 0.78125g/ml ； 抗干安能 (Lamivudine-Resistant)B 型肝炎突变病毒的 4- 乙酰樟芝醌醇 B 的浓度为 4.6875g/ml 1.5625g/ml， 较佳地为 3.9063g/ml 2.3438。
11、g/ml， 最 佳地为 3.125g/ml。 0012 本发明抗 B 型肝炎病毒的药物组合物， 进一步包含药物上可接受的佐剂、 载体或 赋形剂。 所述药物载体包含惰性成分， 所述惰性成分不会与本发明的化合物发生实质反应。 用于非口服施药的适当药物载体可为无菌水、 生理食盐水、 抑菌食盐水 ( 包含约 0.9 mg/ ml 苯基醇的食盐水 )、 磷酸缓冲液食盐水、 汉克溶液。林格式乳糖液及其它相似载体。用于 口服药物， 可依照已知方法， 将其制成粉末状、 颗粒状、 锭状、 液状、 胶状或膏状。 本发明药物 组合物可以食品、 饮品、 药品、 试剂或营养补充品的形式提供， 或是藉由静脉、 肌肉、 上。
12、皮、 腹 腔、 吸入、 口含、 口服、 经皮等途径施用。 0013 本发明中所述 “有效剂量” ， 指该化合物剂量在提供给一对象后能获得有益的结 果， 或者， 该化合物的剂量能在体内或体外获得预期的活性。以本发明为例， 受 B 型肝炎 病毒感染的细胞表面抗原抑制强度在 20 -35为轻度抑制 (+) ； 35 -50为中度抑制 (+) ； 50 -65为强度抑制 (+) ； 大于 65为非常强度抑制 (+)。 0014 本发明以体外细胞培养模式， 利用酶联免疫吸附分析法， 针对 B 型肝炎病毒野生 型细胞株 (MS-G2 细胞系 ) 及干安能 (Lamivudine) 抗药性突变株 (M33 。
13、细胞系 ) 测定樟 芝萃取物 4- 乙酰樟芝醌醇 B 对人类 B 型肝炎病毒表面抗原及 e 抗原的作用。试验结果显 示 ： 4- 乙酰樟芝醌醇 B 对 B 型肝炎病毒野生型细胞株 (MS-G2 细胞系 ) 及干安能抗药性突 变株 (M33 细胞系 )， 无细胞生长抑制作用下， 对表面抗原具强度 (+) 抑制作用， 浓度分别 为 0.78125g/ml 及 3.125g/ml ； 对干安能抗药性突变株 (M33 细胞系 ) 的 e 抗原具中度 (+) 抑制作用， 浓度为 3.125g/ml。 附图说明 0015 图 1 为本发明一种实施例 4- 乙酰樟芝醌醇 B 在野生型肝炎病毒细胞株 (MS-。
14、G2) 中抗 HBsAg 的效果图。 0016 图 2 为本发明一种实施例 4- 乙酰樟芝醌醇 B 在抗干安能突变 B 型肝炎病毒细胞 说 明 书 CN 102755356 A 4 3/6 页 5 株 (M33) 中抗 HBsAg 以及 HBeAg 的效果图。 具体实施方式 0017 为更好的说明本发明的目的、 技术方案以及优点， 下面结合具体实施例对本发明 作进一步说明。 0018 细胞株及细胞培养 0019 本发明使用两种人类肝癌细胞株， 一为 MS-G2， 此系哈佛大学 Dr.Max Essex 实验室所建立 (Sureau， C. 等， 1986.Production of hepat。
15、itis Bvirus by a differentiatedhuman hepatoma cell line after transfection with cloned circular HBV DNA.Cell47 ： 37-47)， 是利用肝癌细胞株 HepG2 经转染带有完整 HBV DNA(ayw) 及新霉 素抗性基因的质体后， 以 G418 筛选， 再经由系列稀释得到的细胞株， 命名为 MS-G2。由于此 细胞株有完整的 HBV DNA 的嵌入 (integrated)， 且已形成一个稳定的细胞株， 故可持续高 量的分泌 B 型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)、 e 抗原 (HB。
16、eAg) 及病毒颗粒体 (42nm 丹氏颗粒 (Dane particles) 和 22nm 亚病毒颗粒 (subviral particles)， 本计划将以此作为 B 型肝 炎病毒野生型模式， 进行抗病毒作用及分子生物层次的探讨。另一为本实验室执行国科会 计划， 所建立的干安能 ( 又称 3TC) 抗药性突变株的稳定转殖细胞株， 也是利用肝癌细胞株 HepG2 经转染带有耐药基因位点 (YMDD) 突变的 HBV DNA 及抗潮霉素基因的质体后， 以潮霉 素筛选， 再经由系列稀释得到的细胞株， 命名为 M33， 以此作为 B 型肝炎病毒抗干安能突变 型模式， 进行抗病毒作用及分子生物层次的。
17、探讨。 0020 实施例 1 0021 樟芝菌丝体 3 公斤， 以 95乙醇 10 公升加热回流萃取四次， 萃取液经过滤后浓 缩， 减压干燥得乙醇萃取物 384 公克， 将乙醇萃取物悬浮于水， 以等量乙酸乙酯进行分萃 (partition) 划分， 乙酸乙酯层经减压浓缩可得乙酸乙酯层划分部 157.57 公克及水层划分 部 159.51 公克。 0022 上述乙酸乙酯层划分部 157.57 公克以硅胶管柱 (10cm i.d x 30cm) 进行层析， 依次以正己烷正己烷-乙酸乙酯(1011021031041051112 ， v/v)乙酸乙酯甲醇每种比例各10L进行冲提， 每1L收集成一划分部。
18、。 其中正己烷-乙 酸乙酯(104)冲提的划分部56-63(3.015g)， 以逆相制备级管柱Tosoh ODS-80Ts(21.5mm x 300mm， 10m) 进行层析， 以 H2O-CH3CN(20 80) 为移动相， 流速 10ml/min 进行层析， 以 265nm 为检测波长， 管柱控温 40， 可获得 4- 乙酰樟芝醌醇 B(131mg)。 0023 实施例 2 0024 在24孔槽的细胞培养皿(petri-dish)， 种入MS-G2细胞2105细胞/ml， 或M33细 胞1.5105细胞/ml， 待隔夜后细胞充分附着， 更新培养基， 同时给予不同浓度的4-乙酰樟 芝醌醇B，。
19、 每个浓度三重复。 给药处理48小时后， 收集上层培养液， 进行抗病毒活性测定， 并 同时以MTT(3-4， 5-二甲噻唑-2-基2， 5-联苯基-四唑溴)测试留在24孔槽内的细胞存 活情形及药物是否毒害及抑制细胞生长。 MTT是一种黄色的染剂， 会被活细胞所吸收并经由 粒线体中的琥珀酸去氢酶 (succinate dehydrogenase) 还原成蓝紫色的甲臜 (formazan)， 可用来检测细胞的存活与生长变化， 在 24 孔槽的细胞培养皿中， 加入 1mg/ml MTT 溶液， 于 37下作用4小时， 吸除上清液， 加入100l DMSO将蓝紫色的结晶析出 ； 最后， 以分光比色 说。
20、 明 书 CN 102755356 A 5 4/6 页 6 计自动酵素免疫分析仪(ELISAreader)在540nm测定吸光值， 反映存活细胞的多寡， 用以作 为药物是否具细胞毒性的指标。 0025 实施例 3 0026 利用酶联免疫吸附分析法， 使用抗人类 B 型肝炎病毒表面抗原的单株抗体及抗人 类 B 型肝炎病毒核心 /e 抗原的多源抗体的酵素免疫检验试剂 ( 普生股份有限公司， 新竹 县， 台湾)， 利用抗体-抗原-抗体酵素接合体的三明治复合体， 以四甲基联苯胺(TMB)呈色 剂呈色， 再以分光比色计BioTek ELX800型自动酵素免疫分析仪在450nm测定， 所得的吸光 值(O.。
21、D.value)反映出抗原的多寡。 并以对照组的吸光值作为100， 依以下公式计算其抑制 百分比 (Inhibition ) ： 0027 ( 对照组吸光值 - 给药组吸光值 )/ 对照组吸光值 100抑制百分比 0028 抑制百分比在 20-35为轻度抑制 (+)， 抑制百分比在 35-50为中度抑制 (+)， 抑制百分比在50-65为强度抑制(+)， 抑制百分比在65以上为非常强度抑制(+)。 0029 实施例 4 0030 如下表 1 及表 2 所示， B 型肝炎病毒野生型细胞株 (MS-G2 细胞系 ) 五个测试浓度 (12.5、 6.25、 3.125、 1.5625 及 0.781。
22、25g/m1)， 12.5、 6.25、 3.125 及 1.5625g/ml 具有细 胞生长抑制作用 ( 抑制百分比 20 )， 0.78125g/ml 无细胞生长抑制作用， 对表面抗原 具强度 (+) 抑制作用， 其抑制百分比为 61.31.8。 0031 表 1.4- 乙酰樟芝醌醇 B 在野生型 HBV 细胞株 (MS-G2) 中抗 -HBsAg 以及抗 -HBeAg 的效果 0032 0033 说 明 书 CN 102755356 A 6 5/6 页 7 0034 1. 实验数值为单一实验三重复结果 0035 2.ND ： 无侦测结果 0036 3.DMSO 组为溶剂控制组 0037 。
23、4. 蛇床子素 (Osthole) 为正对照组 0038 抑制百分比 ： 介于 20 -35为轻度抑制 (+) 0039 介于 35 -50为中度抑制 (+) 0040 介于 50 -65为强度抑制 (+) 0041 大于 65为非常强度抑制 (+) 0042 表 2 野生型 HBV 细胞株 (MS-G2) 0043 0044 实施例 5 0045 如下表 3 及表 4 所示， 干安能抗药性突变株 (M33 细胞系 ) 八个测试浓度 (100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.125、 1.5625 及 0.78125g/m1)， 100、 50、 25、 12.5 及 6.25g。
24、/ml 具有 细胞生长抑制作用 ( 抑制百分比 20 )， 0.78125、 1.5625 及 3.125g/ml 无细胞生长抑 制作用， 对表面抗原具轻度 (+) 至强度 (+) 抑制作用， 其抑制百分比分别为 24.80.8、 35.71.0 及 56.61.5 ； 1.5625 及 3.125g/ml 对 e 抗原具轻度 (+) 至中度 (+) 抑制作 用， 其抑制百分比分别为 28.10.9 及 45.12.0。 0046 表 3.4- 乙酰樟芝醌醇 B 在抗干安能 HBV 突变细胞株 (M33) 中的抗 -HBsAg 以及 抗 -HBeAg 的效果 0047 说 明 书 CN 102。
25、755356 A 7 6/6 页 8 0048 1. 实验数值为单一实验三重复结果 0049 2.ND ： 无侦测结果 0050 3.DMSO 组为溶剂控制组 0051 4. 蛇床子素为正对照组 0052 抑制百分比 ： 介于 20 -35为轻度抑制 (+) 0053 介于 35 -50为中度抑制 (+) 0054 介于 50 -65为强度抑制 (+) 0055 大于 65为非常强度抑制 (+) 0056 表 4. 抗干安能 HBV 突变细胞株 (M33) 0057 0058 0059 以上所述仅是本发明的优选实施方式而非对本发明保护范围的限制， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 可以对本发明技术 方案进行修改或等同替换， 这些修改或等同替换也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102755356 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102755356 A 9 。