一种紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法。该制备方法包括将紫芝发酵制得的紫芝菌丝体采用常规的多糖提取方法进行提取，其中紫芝发酵的方法包括将紫芝菌株依次进行斜面培养、一级种子培养和发酵培养的深层液体发酵。本发明通过对紫芝深层发酵工艺参数和培养基的改进，使获得的紫芝菌丝体中提取的胞内多糖中多糖含量达到39～75％，并具有较强的抗肿瘤活性。

权利要求书
1、  一种紫芝菌丝体胞内多糖的制备方法，其包括将紫芝发酵制得的紫芝菌丝体采用常规的多糖提取方法进行提取，其特征在于所述的紫芝发酵的方法包括将紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd或Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang]菌株依次进行PDA培养基的斜面培养、一级种子培养和发酵培养的深层液体发酵，其中，一级种子培养的培养基为含有豆饼粉1～3％、葡萄糖1.5～5％、无水硫酸镁0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.4％的液体培养基，发酵培养的培养基为含有蔗糖2.5～6％、蛋白胨0.2～0.6％、酵母膏0.1～0.3％、无水硫酸镁0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.2～0.5％、pH5.5-6.5的液体培养基，所述的一级种子培养和发酵培养为振荡培养；上述百分比均为重量百分比。

2、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的PDA培养基含有重量百分比为30～40％的土豆、2～3％的葡萄糖、0.2～0.5％的麦芽提取物及1.4～2.0％的琼脂，所述的斜面培养为25℃培养6～7天。

3、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的振荡培养为温度在25～28℃，频率为190-220rpm的摇瓶培养。

4、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的一级种子培养4～6天，发酵培养4～7天，发酵培养的接种量为5～15v/v％。

5、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的紫芝菌丝体由紫芝发酵方法制得的发酵产物经过4000rpm离心1～3次去除上清液后得到。

6、  如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的多糖提取方法包括下列步骤：
①将菌丝体用水加热至80-95℃进行提取；
②将提取液浓缩后，加入乙醇，过滤所得沉淀即为紫芝胞内多糖。

7、  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于步骤①中菌丝体与水的重量体积比(g/ml)为1:3～5，提取次数为1～3次，每次提取时间0.5～3小时；步骤②中提取液通过减压浓缩至原体积的1/6～1/3，加入3-5倍量85～95％的乙醇。

8、  如权利要求6所述的制备方法，其特征在于其还可将步骤②中得到的沉淀再溶于水，过滤，将滤液干燥。

9、  如权利要求1～8任一项所述的制备方法制得的紫芝菌丝体胞内多糖。

10、  如权利要求9所述的紫芝菌丝体胞内多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

说明书一种紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种灵芝胞内多糖，特别涉及一种采用深层液体发酵的紫芝发酵方法制得的紫芝菌丝体胞内多糖及其制备方法和应用，该紫芝菌丝体胞内多糖具有高抗肿瘤活性。
背景技术
灵芝[Gamoderma lucidum(Leys ex Fr.)Karst]为担子菌纲、多孔菌科、灵芝属真菌。灵芝味甘、性温、无毒，可补心、肝、脾、肺、肾之气，具滋补强身、扶正固本之功效。有效成分主要有多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸)等。灵芝多糖的药用价值主要有抗癌、降血糖、免疫调节、促进蛋白质和核酸的合成、消炎和辐射保护作用；灵芝酸的药用价值主要有护肝和排毒、降低胆固醇、抑制组织胺的释放、抑制血管紧张肽转化等。中国古代根据灵芝特征把灵芝分为赤芝、紫芝、黄芝、白芝、黑芝、青芝等六类。因为在自然界中野生的灵芝十分稀少，远不能满足人们的需要。而人工栽培灵芝收获时间长，占地面积大，且灵芝的产量与质量易受环境气候及虫害的影响。同人工栽培灵芝相比，发酵法生产灵芝有效成份由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点。目前使用和研究较多的赤芝[Ganoderma lucidum(Leyss.Ex Fr.)Karst.]。
然而，不同种类灵芝的发酵培养条件有所差异，所得到的有效成分及药效方面也有所不同。由于紫芝资源稀少，对其进行上述研究更为重要。然而目前有报道的研究不多，其中张卫国等(张卫国，赵云涛，刘欣.固体发酵9519紫芝菌丝体多糖分子量的分布；韶关学院学报，2003；24(6)：70-73)报道了紫灵芝固体发酵菌丝体多糖的分子量分布；公开号CN1436842A的中国专利(公开日期：2003年8月20日)公开了一种高产多糖的紫芝及其发酵生产工艺，主要采用半固态发酵方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、发酵周期短的采用深层液体发酵的紫芝发酵方法，和由其制得的紫芝菌丝体，以及具有抗肿瘤高活性的该紫芝菌丝体的胞内多糖及其制备方法。
本发明人通过诸多试验，发现在液体深层发酵培养中，紫芝菌丝细胞能在反应器内处于最适温度、酸碱度和氧气等环境下生长，不受外界环境的影响，菌丝生长分裂迅速，能在短时间内生产大量菌丝体，成分与天然相当甚至优于天然，而且液体深层发酵成本低，产量大，可实现规模化、工业化。在对发酵产物进行进一步分离和药效分析后，发现采用深层液体发酵方法得到的紫芝菌丝体，其胞内多糖具有较高抗肿瘤活性。本发明重点筛选出了适合大多数紫灵芝菌株液体深层发酵的培养基和工艺条件。
因此，本发明紫芝菌丝体胞内多糖的制备方法的技术方案为：其包括将紫芝发酵制得的紫芝菌丝体采用常规的多糖提取方法进行提取，其中紫芝发酵地方法包括将紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd或Ganoderma sinenseZhao，Xu et Zhang]菌株依次进行PDA(土豆葡萄糖琼脂)培养基的斜面培养、一级种子培养和发酵培养的深层液体发酵，其中一级种子培养的培养基为含有豆饼粉1～3％、葡萄糖1.5～5％、无水硫酸镁0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.1～0.4％的液体培养基，发酵培养的培养基为含有蔗糖2.5～6％、蛋白胨0.2～0.6％、酵母膏0.1～0.3％、无水硫酸镁0.1～0.3％、磷酸二氢钾0.2～0.5％、pH5.5-6.5的液体培养基，所述的一级种子培养和发酵培养为振荡培养；上述百分比均为重量百分比。
根据本发明，所述的紫芝菌株可以是现市场上可以购买得到的菌株，例如中国科学院微生物研究所分离的紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd]，中国普通微生物菌种保藏中心保藏，保藏号：CGMCC5.69；
中国科学院微生物研究所分离的紫芝[Ganoderma japonicum(Fr.)Lloyd]，中国农业微生物菌种保藏中心ACCC，保藏号分别为：ACCC50045、ACCC50468；
以及上海农科院分离的紫芝(Ganoderma sinense Zhao，Xu et Zhang)，上海农科院食用菌保藏中心，紫芝1号等。
其中，所述的PDA培养基的配方可以同常规，含有重量百分比为30～40％的土豆、2～3％的葡萄糖、0.2～0.5％的麦芽提取物及1.4～2.0％的琼脂；斜面培养条件也可以采用灵芝菌的常规培养条件，通常选用25℃培养6～7天。
而所述的振荡培养优选温度在25～28℃，频率为190-220rpm的摇瓶培养。
较佳地，所述的一级种子培养4～6天，发酵培养4～7天，发酵培养的接种量为5～15v/v％。
根据本发明，将上述紫芝发酵方法制得的发酵产物离心去除上清液即可得到紫芝菌丝体。
较佳地，所述的离心速度优选为4000rpm，离心次数通常为1～3次。
根据本发明，所述的提取方法较佳地包括下列步骤：
①将菌丝体用水加热至85～95℃进行提取；
②将提取液浓缩后，加入乙醇，过滤所得沉淀即为紫芝胞内粗多糖。
较佳地，步骤①中每次提取时菌丝体与水的重量体积比为1:3～5(g/ml)，提取次数为1～3次，每次提取时间0.5～3小时。
较佳地，步骤②中提取液通过减压浓缩至原体积的1/6～1/3，加入3～5倍量85～95％的乙醇。
更佳地，本发明提取方法还可将步骤②中得到的沉淀再溶于水，过滤，弃去水不溶物，将滤液干燥，得到初步纯化的紫芝菌丝体胞内多糖。
由本发明上述制备方法制得的紫芝菌丝体胞内多糖中，胞内粗多糖中多糖含量为18～50％(w/w)，初步纯化的胞内多糖中多糖含量为39～75％(w/w)。在对小鼠体内抗肿瘤试验中，口服本发明紫芝菌丝体胞内多糖对小鼠肝癌H22、小鼠Lewis肺癌具有较强的抑瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
实施例1 紫芝菌丝体的制备
将紫芝菌株CGMCC5.69转接于PDA琼脂斜面(含土豆35％、葡萄糖2.5％、麦芽提取物0.3％及琼脂1.7％，余量为水)，25℃培养6天获得发酵研究的种斜面；转接于3只装有100ml种子培养基的750ml摇瓶；种子培养基组成为：豆饼粉2％，葡萄糖2.5％，无水硫酸镁0.15％，磷酸二氢钾0.3％，余量为水，pH自然；在25℃、220rpm培养4天，按照10v/v％的接种量将100ml种子液转接于10只装有100ml发酵培养基的750ml摇瓶(发酵培养基组成：蔗糖4％，蛋白胨0.4％，酵母膏0.2％，无水硫酸镁0.15％，磷酸二氢钾0.3％，余量为水，pH6.0)，28℃、190rpm摇床培养5天。发酵结束后，收集发酵液，4000rpm离心10min，去除上清液；加去离子水600ml洗涤菌丝体，离心，去除上清液，菌丝体再同样洗涤二次；称重为0.32g/ml发酵液(计算方法：所得发酵液中菌丝体的重量g/所得发酵液的体积ml)。
实施例2 紫芝菌丝体的制备
将紫芝菌株ACCC50045接种于PDA斜面培养基(含土豆30％、葡萄糖3％、麦芽提取物0.5％及琼脂1.4％)，25℃培养7天，转接于4只装有100ml种子培养基得750ml三角摇瓶(种子培养基：豆饼粉1％，葡萄糖5％，无水硫酸镁0.30％，磷酸二氢钾0.1％，pH自然)，28℃、200rpm培养6天，按照5v/v％接种量转接于装有100ml发酵培养基的10只750ml三角摇瓶，25℃、220rpm培养7天，发酵培养基：蔗糖2.5％，蛋白胨0.6％，酵母膏0.1％，无水硫酸镁0.10％，磷酸二氢钾0.5％，pH6.5。菌丝体分离同实施例1；称重为0.23g/ml发酵液。
实施例3 紫芝菌丝体的制备
将紫芝菌株ACCC50468接种于PDA斜面培养基(含土豆40％、葡萄糖2％、麦芽提取物0.2％及琼脂2.0％)，25℃培养7天，转接于4只装有100ml种子培养基得750ml三角摇瓶(种子培养基：豆饼粉3％，葡萄糖1.5％，无水硫酸镁0.30％，磷酸二氢钾0.4％，pH自然)，26℃、200rpm培养4天，按照15v/v％接种量转接于装有100ml发酵培养基的10只750ml三角摇瓶，26℃、220rpm培养4天，发酵培养基：蔗糖6％，蛋白胨0.2％，酵母膏0.3％，无水硫酸镁0.3％，磷酸二氢钾0.2％，pH5.5。菌丝体分离同实施例1；称重为0.18g/ml发酵液。
实施例4 紫芝菌丝体的制备
将紫芝菌株紫芝1号接种于PDA斜面培养基(同实施例1)，25℃培养7天，转接于4只装有100ml种子培养基的750ml三角摇瓶(种子培养基同实施例3)，25℃、190rpm培养4天，按照10v/v％接种量转接于装有100ml发酵培养基的10只750ml三角摇瓶，28℃、220rpm培养6天，发酵培养基同实施例1。菌丝体分离同实施例1；称重为0.46g/ml发酵液。
实施例5-8 紫芝菌丝体胞内粗多糖的制备
将实施例1-4的菌丝体分别按下述方法提取胞内粗多糖：菌丝体与所加去离子水的重量体积比为1：3～5(g/ml)，加热至85～95℃提取2h左右；抽滤，再同样煮提两次，将三次水煮的提取液合并，减压浓缩至300ml，加900ml95v/v％乙醇，搅拌沉淀24h，过滤得到胞内粗多糖。实施例5～8胞内粗多糖测定总糖(测定方法见文献：叶姜瑜，谈锋.紫芝多糖的纯化和组分分析，西南师范大学学报(自然科学版)，2002，27(6)：945-949)含量分别为43％、32％、20％、50％。
实施例9～12 紫芝菌丝体初步纯化的胞内多糖的制备
将实施例5～8的紫芝菌丝体胞内粗多糖分别溶解于约200～600ml去离子水中，抽滤，弃去水不溶物，将溶液蒸干，得到紫芝菌丝体纯化的胞内多糖(总糖测定方法同实施例5-8)，多糖含量分别为55％、45％、38％、75％。
上述实施例中本发明未特殊说明的百分比均为重量百分比。
试验实施例 紫芝菌丝体胞内多糖的抗肿瘤作用
采用小鼠移植性肿瘤模型，用肿瘤抑制率来评价抗肿瘤活性。具体方法如下：取生长良好的小鼠H22肝癌腹水、小鼠Lewis肺癌瘤块，用生理盐水稀释(细胞浓度约1-2×107个/ml)，每只小鼠右腋皮下接种0.2ml，随机分组，设空白对照组(蒸馏水)、阳性对照双灵固本散(现有灵芝类抗肿瘤中药)组、样品组(本发明实施例5～12)，接种后次日起给药(给药剂量如下表所示)，给药体积为0.5ml/20g体重，连续经口灌胃7-10天。接种后10-14日脱颈处死动物，解剖取瘤块，比较各剂量组瘤重之大小。
根据以下公式判定结果：

结果如表1，表2所示：
表1.实施例5-12所得样品对小鼠肝癌H22的抑瘤作用


与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。
表2.实施例5-12所得样品对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01
可见，本发明紫芝菌丝体胞内多糖，特别是初步纯化的胞内多糖具有较佳的抗肿瘤活性。