一种治疗中风类疾病的千草脑脉通药物及其制备方法 【技术领域】
本发明属中药制药技术领域，涉及一种具有活血祛瘀，化痰活络作用，用于治疗痰瘀阻络所致中风，中经络，半身不遂，口眼歪斜，言语不利等症的药物制剂，具体涉及一种治疗中风类疾病的千草脑脉通药物及其制备方法。
背景技术
根据国家药品标准WS-10195(ZD-0195)-2002中给出的配方和提取工艺制备而成的千草脑脉通合剂，是一种具有活血祛瘀，化痰活络作用，用于治疗痰瘀阻络所致中风，中经络，半身不遂，口眼歪斜，言语不利等症的口服中药制剂。
以下是该药品标准中所载的部分内容：
处方：虎尾草133.3g，千斤坠66.7g
制法：以上二味，加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，得流浸膏，加水至1000ml，调节pH值至5.0～7.0，灌装，灭菌，即得。
中药合剂虽为传统剂型，但根据患者临床反映，这种药品口感苦涩，难以坚持长期服用，即服用顺应性较差；同时服用量大，运输、携带及使用都不方便，影响了它的应用范围。另外由于其制备工艺落后，除杂不完全，贮藏过程中容易产生沉淀，影响产品质量。因此亟待开发一种产品质量稳定，服用量小、携带方便、顺应性好的千草脑脉通口服药物制剂。
【发明内容】
本发明为了解决现有千草脑脉通合剂制备工艺落后，质量不稳定、服用顺应性差的缺点，提供一种工艺先进合理、适合工业化大生产，质量稳定、服用量小、顺应性好的千草脑脉通药物及其制备方法。
为解决上述问题本发明提供技术方案如下：
一种千草脑脉通药物，其特征在于该药物是由如下方法制备得到的：
取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份，用60％～80％乙醇提取2～3次，每次1～2小时，乙醇用量为药材重量的6～10倍，提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.10～1.20，浓缩液加水至1～2倍药材重量，搅匀、静置后过滤，滤液上大孔树脂吸附，流速为0.5～3柱体积/小时，上样量为干树脂重量：药材重量＝1：2～4，过柱液重吸附一次，静置12h后洗脱，先用5～8倍柱体积水洗脱，再用6～10倍柱体积60％～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩、干燥为本发明药物的提取干粉；或将乙醇洗脱液浓缩成60℃时相对密度为1.35～1.40的稠膏。
上述千草脑脉通药物可制成片剂、分散片、颗粒剂、胶囊剂或丸剂等。
本发明千草脑脉通药物制备工艺包括下列步骤：取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份，用60％～80％乙醇提取2～3次，每次1～2小时，乙醇用量为药材重量的6～10倍，提取液浓缩至在60℃时相对密度为1.10～1.20，浓缩液加水至1～2倍药材重量，搅匀、静置后过滤，滤液上大孔树脂吸附，流速为0.5～3柱体积/小时，上样量为干树脂重量：药材重量＝1：2～4，过柱液重吸附一次，静置12h后洗脱，先用5～8倍柱体积水洗脱，再用6～10倍柱体积60％～80％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩、干燥为本发明药物的提取干粉；或将乙醇洗脱液浓缩成60℃时相对密度为1.35～1.40的稠膏。
本发明所用大孔吸附树脂可为D101、LS303、LSA40、LSA21或XDA-1。
本发明千草脑脉通药物制备工艺具体可包括下列步骤：以g或Kg为单位，按照重量计算，取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份，用70％乙醇提取3次，时间分别为2h、1h、1h，乙醇用量分别为药材重量的10、8、6倍，合并提取液，过滤，提取液浓缩至在60℃时相对密度1.20，浓缩液加水至2倍药材重量，静置后过滤，滤液上大孔树脂吸附，流速为2柱体积/小时，上样量为干树脂重量：药材重量为1：2，过柱液重吸附一次，静置12h后洗脱，先用6倍柱体积水洗脱，再用8倍柱体积70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩、干燥为本发明药物的提取干粉；或将乙醇洗脱液浓缩成60℃时相对密度为1.35～1.40的稠膏。
本发明有益效果：与现有技术相比，本发明提供的提取工艺先进合理，大大提高了本品的有效成分，减少服用量，制成地制剂疗效确切，质量稳定，达到了发明目的。
在研究提取工艺的过程中，考虑到虎尾草的主要有效成为黄酮类，千斤坠的主要有效成分为木脂素类，两者均在醇中溶解度较大，故考虑采用醇提，以增大有效成分的提取率，同时考虑到虎尾草中含有大量的叶绿素等脂溶性杂质，故醇提取液浓缩后加水静置以除去脂溶性杂质。为了进一步富集有效成分，减少服用量，故选用大孔吸附树脂进一步纯化，使其有效部位总黄酮类成分含量大于50％，有效成分松脂素单葡萄糖苷含量大于15％。
通过一系列的实验，以选择本发明提供的提取工艺加药剂学上可接受的辅料制成的制剂，质量稳定，疗效明显。
含量测定方法：
(一)总黄酮(以芦丁计)测定：
对照品溶液的制备精密称取经芦丁对照品适量，加甲醇制成1.0mg/mL的对照品贮备液；精密量取贮备液造量，加水稀释成0.2mg/mL的对照品溶液。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置25mL量瓶中，各加5％亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6分钟，加4％氢氧化钠溶液10mL，水稀释至刻度，摇匀，放置15～20分钟，照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V B)，以相应试剂作空白，在500nm波长处测定吸收度。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法精密称取相当于含生药材2g的本发明药物，加水10mL溶解，加氯仿-醋酸乙酯(4:1)，轻摇提取4次，每次15mL，弃去氯仿-醋酸乙酯提取液，水液加水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次15mL，合并正丁醇提取液，用少许无水硫酸钠脱水，置水浴上蒸至约2mL，加水溶解，转移至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过；精密量取续滤液1mL，置25mL量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加5％亚硝酸钠溶液1mL”起，依法测定吸收度，由标准曲线读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
(二)松脂素单葡萄糖苷测定
以用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇-水(35：65)为流动相，检测波长为230nm，流速为1.0mL/min，柱温为室温；取松脂素单葡萄糖苷对照品适量，加甲醇制成0.28mg/mL的对照品溶液；精密称取相当于含千斤坠药材0.25g的本发明药物，具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；
试验例1：提取纯化工艺研究
(1)提取工艺醇浓度试验
取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份(两药材总重量为100g)，分别用60％、70％、80％乙醇提取3次，第一次2h，第二次1.5h，第三次1h，乙醇用量第一次10倍量，第二次8倍量，第三次6倍量，合并提取液，过滤，滤液浓缩并干燥，计算提取物重量并测定含量，结果见表1。
表1 不同浓度乙醇提取试验结果
注：提取率％＝(提取物含量×提取物重量)÷药材该成分总量×100％
结果表明：三种浓度的醇提取率均大于90％，说明有效成分均能提取完全，而80％醇提取时提取率没有明显提高，且提取物重量增加、有效成分含量降低，表明杂质提出增多，故优选70％的醇提取。
以70％乙醇为提取溶媒，按以上提取工艺提取，提取液合并，过滤，滤液减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)的稠膏，加水至每ml提取液含生药材0.5g(简称提取液A)，测定含量为总黄酮25.2mg/mL，松脂素单葡萄糖苷7.2mg/mL，供以下大孔吸附树脂实验筛选用。
(2)树脂型号筛选
静态吸附解吸实验：准确称取一定量处理好的各种树脂各5g，置于100mL锥形瓶中，分别加入上述提取液A10mL，每隔10min振摇20s，持续2h，静止24h后，过滤，得液体样品①，测定浓度。将滤出后的树脂用蒸馏水洗去树脂表面的提取液A，另置100mL锥形瓶中，精确加入70％乙醇20mL，每隔10min振摇20s，24h后，过滤，得液体样品②，测定浓度。按照下式计算各树脂对总黄酮与松脂素单氧葡萄糖苷的静态饱和吸附量(mg/g)、解吸量(mg/g)和解吸率(％)，结果见表2。
饱和吸附量＝(提取液A浓度-样品①浓度)×样品①体积÷干树脂重量；
解吸量＝样品②浓度×样品②体积÷干树脂重量；
解吸率＝解吸量÷饱和吸附量×100％
表2 5种树脂静态吸附量和解吸率测定结果
动态吸附解吸实验：准确称取一定量处理好的各种树脂5g，湿法装柱，吸取上述提取液A20mL，上样吸附，过柱液重吸附一次，静置12h，蒸馏水洗脱至无色后，用70％乙醇洗脱，将各吸附后残液、水洗液、醇洗脱液浓缩至一定体积，测定含量。按下列公式计算比吸附量(mg/g)、比洗脱量(mg/g)和回收率(％)，结果见表3。
比吸附量＝(上柱液成分总量-残液成分总量-水洗液成分总量)÷干树脂重量
比洗脱量＝醇洗液成分总量÷干树脂重量
回收率＝醇洗液成分总量÷上柱液成分总量×100％
表3 5种树脂动态吸附量和回收率测定结果
由表2、表3结果可知，D101树脂对总黄酮与松脂素单葡萄糖苷无论是在静态饱和吸附量、解吸率还是动态比吸附量、醇洗液成分总量及回收率均优于其它树脂，故优选用D101树脂。
(3)D101树脂分离纯化工艺研究
A.上样量及上样浓度的研究
上样量的确定：取处理好的树脂5份，湿法装柱，分别吸取提取液A适量按生药材与干树脂重量比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1上柱吸附，上柱吸附完全后用6BV(BV为柱床体积，下同)的蒸馏水洗柱，再用8BV的70％的乙醇洗脱，将醇洗脱液浓缩至一定体积，测定成分总量，计算回收率，见表4。
上样液浓度的确定：取处理好的树脂5份，湿法装柱，取提取液A100mL5份，其中2份分别浓缩至25mL、50mL，一份不处理，另2份分别加水稀释1、2倍，即每mL含生药材2、1、0.5、0.25、0.125g。上柱吸附完全后，用6BV的蒸馏水洗柱，再用8BV的70％乙醇洗脱，将醇洗脱液浓缩至一定体积，测定成分总量，计算回收率，见表4。
表4 上样量与上样浓度试验结果
由表4结果可知，当干树脂重量：生药材重量比为1：1～4时两成分回收率均大于50％，但结合工业化大生产的适用性与生产成本，优选干树指质量与上柱生药材量比1:2～4。当上样液生药材量固定的情况下，当上样液的浓度增大时，回收率增大，但当生药材量为2g/mL时，因浓度过大，发生絮凝和沉淀，回收率稍有下降；而上样液浓度偏低时，时间增加，工效降低，0.5g/mL与1.0g/mL总黄酮与松脂素单葡萄糖苷的回收率均相差不大，故大生产时上样液浓度可以为0.5～1.0g生药/mL，即可以将醇提浓缩液加水至药材重量的1～2倍。
B.洗脱剂乙醇浓度的筛选
取处理好的树脂5份，湿法装柱，取20mL提取液A上柱吸附完全后，用6BV蒸馏水洗柱后，再分别用30％、50％、60％、70％、80％乙醇洗脱，每种洗脱液收集8BV，浓缩各部分液体样品，测定含量，计算回收率，见附图1及表5。
表5 洗脱剂乙醇浓度试验结果
由结果可知，乙醇浓度为60～80％时，两成分回收率均大于50％，70％、80％回收率无明显增大，故优选70％。
C.水洗体积的筛选
取处理好的树脂4份，湿法装柱，取20mL提取液A上柱吸附完全后，分别用3、5、6和8BV的蒸馏水洗脱，再用8BV的70％乙醇洗脱，将醇洗液浓缩到一定体积，测定各成分的含量并计算回收率与纯度，结果见表6。
纯度＝醇洗液成分总量/醇洗液干浸膏量×100％
表6 水洗体积试验结果
由结果可知，用5～8BV的水洗脱后，醇洗液回收率均大于50％，两成分纯度之和均大于80％，故生产上可先用5～8BV的水洗脱，优选5～6BV。
D.洗脱终点确定
取处理好的树脂适量，湿法装柱，取20mL提取液A吸附完全后，用5BV蒸馏水洗柱，再用70％的乙醇洗脱，按柱床体积收集，共收集10个洗脱份，测定每个洗脱份的成分含量，计算回收率，结果见表7。
表7 洗脱终点确定试验
由结果可知，当洗脱液70％乙醇用量为6BV时，总黄酮与松脂素单葡萄糖苷的总回收率均已达到60％以上，故生产上乙醇用量为6～10BV，优选6～8BV，最优选为6BV。
E.洗脱速度的考察
取处理好的树脂适量，湿法装柱，取20mL提取液A吸附完全后，用5BV蒸馏水洗柱，再用6BV70％的乙醇洗脱，洗脱速度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0BV/h，收集乙醇洗脱液，测定含量与干浸膏重量，结果均无明显差别，说明洗脱速度为0.5～3BV/h时对产品收率及含量无明显影响。
试验例2：临床有效性研究
本试验例用于说明本发明药物对痰瘀阻络所致中风，中经络，半身不遂，口眼歪斜，言语不利等症的治疗效果。
临床上用本发明片剂(实施例3)治疗由痰瘀阻络所致的急性中风、中经络患者120例，基本恢复32例(26.67％)，显著进步49例(40.83％)，进步28例(23.33％)，总有效率90.83％；治疗前认知障碍为77例(64.17％)，轻、中、重度认知障碍分别为40例、29例、8例，治疗后总例数为41例(34.17％)，轻、中、重分别为22例、15例、4例；治疗前情感障碍为84例(70％)，可能抑郁、抑郁、严重抑郁3级分别为41例、33例、10例，治疗后总例数为52例(43.33％)，3级分别为27例、18例、7例；症状改善总有效率：肢体活动障碍为84.17％，舌强语蹇(言语不利)为68.33％。说明本发明药物可明显改善中风瘫痪症状，改善情感障碍，使患者最大程度地回归家庭与社会。临床试验过程中同时还观察了本发明片剂对血尿常规、肝肾功能等安全性指标的影响，发现治疗前后无明显异常变化，临床服用过程中也未报告有胃肠道及其它不良反应发生，说明本发明服用安全。本发明的服用方法：口服，每日三次，每次2片(或1袋颗粒剂，或2粒胶囊)。30天为一疗程。
【附图说明】
图1为不同浓度乙醇洗脱回收率示意图。
【具体实施方式】
下面通过实施例来更详细地描述本发明。
实施例中所用到的药材：均购自云南大理药材市场，经检验均符合云南省2005年版药材标准项下的各项规定。
实施例1：
取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份(两药材重量和为1Kg)，用80％乙醇提取2次，时间分别为2h、1.5h，乙醇用量分别为药材重量的10倍、8倍，合并提取液，过滤，60℃减压浓缩至相对密度为1.10(60℃)，浓缩液加水至1倍药材重量，搅匀，静置后过滤，滤液上D101大孔树脂吸附，流速为0.3柱体积/小时，上样量为干树脂重量：药材重量(1：4)，过柱液重吸附一次，静置12h后洗脱，先用5倍柱体积水洗脱，再用6倍柱体积80％乙醇洗脱，收集80％乙醇洗脱液，浓缩、干燥为本发明药物的提取物干粉；或将80％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.40(60℃)的稠膏。
实施例2
取虎尾草2重量份，千斤坠1重量份(两药材重量和为1Kg)，用70％乙醇提取3次，时间分别为2h、1h、1h，乙醇用量分别为药材重量的10、8、6倍，合并提取液，过滤，60℃减压浓缩至相对密度为1.20(60℃)，浓缩液加水至2倍药材重量，搅匀，静置后过滤，滤液上D101大孔树脂吸附，流速2柱体积/小时，上样量为干树脂重量：药材重量(1：2)，过柱液重吸附一次，静置12h后洗脱，先用6倍柱体积水洗脱，再用8倍柱体积70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，浓缩、干燥为本发明药物的提取干粉；或将70％乙醇洗脱液浓缩成相对密度为1.35(60℃)的稠膏。
实施例3：片剂
取上述实施例1中提取物干粉，加淀粉120克，微晶纤维素30g，混匀，过筛，用60％乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，加入0.5％硬脂酸镁，混匀，压制成1000片(1g生药/片)，包薄膜衣，即为本发明的片剂。
实施例4：颗粒剂
取上述实施例2中提取物药液，加糊精400g，乳糖100g，阿司帕坦15g，喷雾干燥制粒，整粒，制成颗粒500袋(1.5g/袋)，即为本发明的颗粒剂(2g生药/袋)。
实施例5：胶囊剂
取上述实施例2中提取物干粉，加淀粉150g，混匀，过筛，用60％乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，灌装，制成胶囊1000粒(1g生药/粒)，即为本发明的胶囊剂。
实施例6：分散片
取上述实施例1中提取物干粉，加低取代羟丙基纤维素60g、微晶纤维素33g，羧甲基淀粉素钠15g、阿司帕坦2g，混匀，过五号筛，用95％乙醇制粒，60℃以下干燥，整粒，加入0.5％硬脂酸镁，混匀，压成1000片(1g生药/片)，即为本发明的分散片。
对比例：按千草脑脉通合剂原制备工艺取虎尾草666.5g，千斤坠333.5g，加水10倍量煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10(60℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达70％，静置24小时，滤过，滤液减压回收乙醇，得流浸膏，继续减压干燥得干浸膏，称定重量并测定含量，另取实施例1、2项下的提取物干粉称定重量并测定含量，结果见表8。
表8 本发明工艺与原工艺结果比较