一种血管紧张素转化酶抑制剂及其制备.pdf

本发明涉及鹿血活性肽，具体地说是一种血管紧张素转化酶抑制剂及其制备，其以鹿血活性肽为活性成份，鹿血活性肽具有血管紧张素转化酶抑制活性和增强免疫力活性。本发明通过酶解的方法制备鹿血活性肽，制备工艺简单、条件温和，具有良好的应用前景。

权利要求书
1.  一种血管紧张素转化酶抑制剂，其特征在于：其以鹿血活性肽为活性成份，鹿血活性肽具有血管紧张素转化酶抑制活性和增强免疫力活性。

2.  一种权利要求1所述血管紧张素转化酶抑制剂的制备方法，其特征在于：以新鲜的鹿血为原料，鹿血经离心分离后，取上清，上清即为血浆蛋白，血浆蛋白经化学或热变性、变性后的蛋白质冷冻干燥，用pH2～9的磷酸缓冲液溶解成重量浓度1～50％的溶液，加入蛋白质水解酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：10～500，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，再冷冻干燥得到鹿血多肽，活性肽检测具有血管紧张素转化酶抑制活性和免疫增强活性

3.  按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述离心分离过程为，
在4℃、鹿血经3000～15000转/分钟转速下离心0.1～2小时，沉淀为血细胞，上清用于制备活性肽。

4.  按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
所述化学变性过程为：于鹿血上清中加入尿素至终浓度为8-10mol/L，搅拌10-20分钟；所述热变性过程为：将鹿血上清加热至60-100℃10-60分钟。

5.  按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。

说明书一种血管紧张素转化酶抑制剂及其制备
技术领域
本发明涉及鹿血活性肽，具体地说是一种血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制剂及其制备，本发明制备的鹿血活性肽具有血管紧张素转化酶抑制活性和增强免疫力活性。
背景技术
鹿血中蛋白质含量占13％以上，是鹿血中的主要成分。蛋白质是由肽组成的，具有生理作用的肽类化合物称为功能肽或生物活性肽，活性肽具有抗氧化、降血压、提高免疫力、抗肿瘤、促进矿物质吸收等活性，不同来源的蛋白质制备具有各种功能的活性肽已成为该领域的研究热点(参考文献1：Hannu Korhonen，Anne Pihlanto；Bioactive peptides：Production andfunctionality，International Dairy Journal 16(2006)945-960)。具有保健功能的鹿血中丰富的蛋白质是理想的活性肽原料。
高血压是我国发病率非常高的常见心血管疾病，是引发心、脑、肾和眼血管等各种并发症并导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。高血压早期一般没有不适症状，直至发生临床现象—心脏发病、脑血管破裂，因此有高血压家族史及轻微症状者的早期保健就至关重要。
血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)抑制剂是现今治疗高血压与心力衰竭的主要药物(参考文献2：YANJUN YANG，EWA D.MARCZAK，MEGUMI YOKOO，HACHIRO USUI，AND MASAAKIYOSHIKAWA；Isolation and Antihypertensive Effect of AngiotensinI-Converting Enzyme(ACE)Inhibitory Peptides from Spinach Rubisco，J.Agric.Food Chem.2003，51，4897-4902 4897)。血管紧张素转化酶可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强烈收缩血管作用的八肽血管紧张素II，导致血压升高，因此ACE抑制剂可有效控制高血压而且在心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。肽类化合物是一类重要的ACE抑制剂，肽类ACE抑制剂对高血压患者有降压作用而对血压正常者无作用，因此是理想的潜在高血压患者的保健品。
天然蛋白质的酶解是制备具有ACE抑制活性的肽的主要方法，温和的酶解条件对于已知有保健作用的鹿血来说不会破坏其固有的活性而且可产生新的活性肽类化合物。
发明内容
本发明的目的是提供一种血管紧张素转化酶抑制剂及其制备；其以鹿血活性肽为活性成份，鹿血活性肽具有血管紧张素转化酶抑制活性和增强免疫力活性。本发明通过酶解的方法制备鹿血活性肽，制备工艺简单、条件温和，具有良好的应用前景
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种血管紧张素转化酶抑制剂，其以鹿血活性肽为活性成份，鹿血活性肽具有血管紧张素转化酶抑制活性和增强免疫力活性。
所述血管紧张素转化酶抑制剂的制备方法，以新鲜的鹿血为原料，鹿血经离心分离后，取上清，上清即为血浆蛋白，血浆蛋白经化学或热变性、变性后的蛋白质冷冻干燥，用pH2～9的磷酸缓冲液溶解成重量浓度1～50％的溶液，加入蛋白质水解酶，酶的加入量为酶：蛋白质重量比＝1：10～500，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，再冷冻干燥得到鹿血多肽，活性肽检测具有血管紧张素转化酶抑制活性和免疫增强活性。
所述离心分离过程为，以新鲜的鹿血为原料，取1～2升鹿血，在4℃、鹿血经3000～15000转/分钟转速下离心0.1～2小时，沉淀为血细胞，上清为鹿血血浆蛋白用于制备活性肽。
所述化学变性过程为：于鹿血血浆蛋白中加入尿素至终浓度为8-10mol/L，搅拌10-20分钟；所述热变性过程为：将鹿血血浆蛋白加热至60-100℃10-60分钟。
蛋白质水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶或中性蛋白酶。
本发明将鹿血经离心即可得到蛋白质含量、纯度较好的血浆蛋白，省略了繁琐的分离纯化步骤；血浆蛋白是由肽、免疫蛋白和许多微量元素组成的具有免疫功能鹿血组分，酶解的方法保留了其本身具有活性的功能。
本发明的特点如下：
1.活性肽的生理活性显著。采用本发明制备工艺，首次从鹿血中获得具有血管紧张素转化酶抑制活性和免疫增强活性的肽类物质。
2.反应条件温和、方法简便可行。本发明活性肽的制备是通过酶解的方法，反应条件温和，既可制备活性肽又保留鹿血中原有的活性组分，反应方法简单可行。
3.具有良好的应用前景。血管紧张素转化酶抑制剂可降低高血压患者的血压，通过本发明制备的活性肽有可能成为降血压保健品同时又具有提高免疫力的功能，因此具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的鹿血活性肽分子量分布图。
具体实施方式
实施例1
以新鲜鹿血为原料，按照以下工艺制备鹿血多肽：
取1升新鲜鹿血，在4℃、3000转/分钟转速下离心1小时，取上清在100℃变性4小时，变性后的蛋白质冷冻干燥，干燥的蛋白质粉末用pH＝2的磷酸缓冲液溶解成浓度为1％的溶液，加胃蛋白酶，酶的加入量为酶：蛋白质＝1：100，在20℃温度下水解0.5小时，反应结束后冷冻干燥，得到粉末状鹿血活性肽。
通过基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI—MS)所测定的本发明实施例1制备的活性肽的分子量分布如图1所示，酶解所得的肽分子量主要分布在2000道尔顿以下，说明通过本工艺可将大分子量的蛋白质水解为分子量较小的肽类化合物。
鹿血活性肽的血管紧张素转化酶抑制活性为IC50＝0.4mg/ml，小鼠的ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验表明在浓度为10ug/ml时，免疫增强活性呈阳性。
ACE抑制活性及增强免疫活性过程为：
将上述方法制备的活性肽进行ACE抑制活性和免疫增强活性检测，结果如下：
1)ACE抑制活性检测方法：采用文献(B.A.Murray，D.J.Walsh，R.J.Fitzgerald，Modification of the furanacryloyl-L-phenylalanyglycylglycine assayfor determination of angiotensin-I-converting enzyme inhibiotory activity，Joumal of biochemical and biophysical methods，2004，59：127-137)所报道的方法，检测活性肽ACE抑制活性，以肽FAGG为底物，ACE将FAGG转化为FA和GG两个肽，在340nm紫外吸光度的变化得到ACE的活性，将加入活性肽与未活性肽时ACE活性相比可得到活性肽的ACE抑制率。通过该方法制备的活性肽的ACE抑制率为90％，而未酶解的血浆蛋白的ACE抑制率为10％。
2)增强免疫活性的检测：通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验，以MTT法进行检测。当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。结果采用方差分析，加入活性肽的实验组小鼠脾淋巴细胞增值显著(P<0.05)，说明活性肽具有增强免疫活性。
实施例2
取1升新鲜鹿血，在4℃、15000转/分钟转速下离心0.1小时，取上清加入尿素480克，变性1小时后取出蛋白质冷冻干燥，干燥的蛋白质粉末用pH8的磷酸缓冲液溶解成浓度为50％的溶液，加中性蛋白酶，酶的加入量为酶：蛋白质＝1：500，在80℃温度下水解24小时，反应结束后冷冻干燥，得到粉末状鹿血活性肽。
活性肽的活性检测结果与实施例1相同。