抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途.pdf

本发明公开了一种抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的多肽ZA及制备方法和用途，其步骤是首先制备E2-GST融合蛋白；其次是制备E2-GST融合蛋白抗体；第三是构建随机DNA文库；第四是制备核糖体文库；第五是核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽，得到与E2蛋白特异性结合的12肽(ZA)。该多肽ZA与丙肝病毒E2糖蛋白有高亲和性，多肽ZA能显著降低HCV侵袭人肝细胞和DC细胞，并抑制E2蛋白与人细胞的结合，抑制能力强，该多12肽ZA可作为制备或治疗预防丙型肝炎病毒感染的药物。多肽在检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。

权利要求书
1.  一种分离得到的多肽ZA，其序列为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.  一种制备权利要求1所述的多肽方法，它包括下列步骤：
A、制备E2-GST融合蛋白的步骤：首先是挑取含有pGEX-KG-E2的大肠杆菌BL21DE3于3ml含有氨节青霉素的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG的大肠杆菌BL21DE3，37℃培养12～16小时；其次是将试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养到OD600为1～2；第三是加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，使其终浓度为0.1mM，30℃诱导4～5小时；第四是将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，离心，弃上清，沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS洗涤1次，离心，弃上清，将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟的PBS中；第五是将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20％曲通X-100，使其终浓度1％，4℃，混30分钟，每EP管中加入1ml超声降解的菌液，离心，取上清，上清再次离心，再取上清；第六是各EP管加入20μl琼脂糖凝胶4B，室温混匀，离心，弃上清，各EP管加入100μl 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B的悬浊液收集于一管，离心，弃上清，共洗涤3次；最后是加入与Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液，室温下轻轻混，取上清，重复第六步骤两次，收集的上清则为E2-GST融合蛋白；
B、制备E2-GST融合蛋白抗体的步骤是：首先是将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1mg/ml，加入完全弗氏佐剂，注射至新西兰家兔脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每点0.1～0.2ml，每只兔子抗原免疫剂量为1mg；其次是两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以弗氏佐剂为佐剂，免疫位点及数量选择同基础免疫；第三是共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍，末次免疫后第10天心脏采血，室温静置凝固后，转入4℃冰箱静置过夜，分离血清，血清即为E2-GST融合蛋白的抗体，置于-80℃冰箱保存备用；
C、制备随机DNA文库的步骤：首先是寡核昔酸为3’-CCT CTA TAT AGG
TAC CGA TCG(NNM)12AGG CCG G TAGTA GTA GTA GTA GTA CCTAGGCCA-5’(90bp)；其次是第一轮PCR的上游引物U1为5′-G CTC GTA TAA TGTGTG GCC ACA ACG GAA GGA GAT ATA TCC ATG-3′(43bp，下游引物D1为3′-GTA GTA CCT AGG CCA TCA CCT TCA CCA TCA CCG AGT GGA AGT TCACAT ACG G-5’(52bp)；第三是第二轮PCR的上游引物U2为5′-GCG CTG CAGTTG ACA ATT AAT CAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3′(42bp)，，下游引物为D1，随机DNA文库的构建；第四是PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收；第五是经第四步骤回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增；第六是经第五步骤所得得PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段用于体外转录翻译；
D、制备核糖体文库的步骤：首先是核糖体文库构建及筛选，将编码1014个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个复合体结构，利用E2-GST Sepharose 4B亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体—多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2蛋白特异性结合的多肽；其次是反应体系：
DNA模板                                        10μl
S30 Premix without Amino Acids                 20μl
氨基酸混合液                                   2.5μl
氨基酸混合液                                   2.5μl
S30 Extract，linear                            15μl
总体积                                         50μl
混匀反应体系中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部，30℃孵育2.5小时；最后是EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库；
E、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤是：首先是在100μl体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase，10×DNase I缓冲液6μl，温育，然后加6μl中止缓冲液，灭活，取60μlE2-GST-Sepharose 4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用500μl洗脱缓冲液洗涤3次；其次是将100μl体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，摇动，离心，弃上清，沉淀用washing buffer洗涤3次，沉淀中加入100μl elution buffer，摇动10min使mRNA与核糖体解离，离心，取上清；最后用RNaid Kit回收mRNA，2％琼脂糖琼脂糖凝胶电泳，以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物；第四是将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19上，具体步骤为：
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
10×Y+Buffer                               2μl
BamHI                                      1μl
PstI                                       1μl
ddH2O                                      17μl
总体积                                     20μl
37℃水浴2小时，
b.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断；
c.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，
d.将所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α，取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，加入800μl LB液体培养基，取200μl菌液涂在有氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上，培养过夜；
e.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基培养过夜，提取获得的菌液的质粒DNA，PCR鉴定所得的DNA，将所得产物经BamHI和PstI鉴定，最后得到测序结果。

3、  多肽在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用。

4、  多肽在检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。

说明书抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途
技术领域
本发明属于病毒的分子生物学领域。更具体涉及一种抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA，还涉及抑制丙型肝炎病毒结合人肝细胞和DC-SIGN+的靶细胞的多肽的制备方法，同时还涉及一条能靶向结合丙肝病毒包膜糖蛋白E2的小分子12肽，即多肽ZA在制备治疗或预防丙型肝炎病毒感染人细胞的药物中的用途，该多肽同时还作为检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。
背景技术
丙型病毒性肝炎(简称丙型肝炎)是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)引起的肝脏炎症性疾病。HCV感染呈全球性分布，主要通过血液传播。据世界卫生组织统计，全球HCV感染率约为3％，估计有1.7亿人感染HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万。我国血清流行病学调查资料显示，一般人群抗HCV阳性率为3.2％，各地区感染率有一定差异。急性HCV感染者约80％发展为慢性丙型肝炎(CHC)，在20年间约20％可发展为肝硬化，每年约有1％～4％肝硬化患者发展为肝癌。CHC已成为不可忽视的重要疾病，及早发现和治疗CHC患者已受到重视。CHC治疗目的包括根除或长期抑制病毒复制，减轻肝内炎症和纤维化，最终阻止进展为肝硬化、肝癌和肝功能衰竭，并提高患者的生活质量。
抗病毒是CHC治疗的关键，目前抗病毒治疗主要有干扰素(Interferon，IFN)治疗，包括普通IFN-α、复合干扰素(CIFN)、聚乙二醇化干扰素α(PGE—IFNα)。自20世纪90年代应用IFN治疗CHC以来，其远期疗效从10％～15％提高至50％～60％。其次，干扰素与利巴伟林联合治疗是当前CHC治疗的一大进展，利巴韦林的抗病毒机制属于免疫调节作用，它通过对T细胞介导的细胞毒性作用，调节免疫应答。利巴韦林单一治疗并没有抗HCV作用，IFNα与利巴韦林联合应用却能使患者获得更好的恢复。此外，基因治疗是将一种新的遗传物质导入患者细胞内并能给患者带来治疗作用。HCV基因治疗需要导入的基因特异性的阻断或抑制病毒基因的表达或病毒蛋白合成的功能，除了细胞内干扰外，基因治疗还包括通过刺激特异性免疫应答使体内产生持续性表达的抑制性分泌蛋白，阻止细胞外水平HCV的播散。
上述治疗方法虽然能使部分患者(30％～40％)获得持续性病毒应答(SVR)，但半数以上患者无法达到SVR，并且干扰素治疗容易引起一系列的副作用，如对神经系统、血液系统的影响，PGE—IFNα与利巴伟林联合治疗的患者中有37％的人会出现抑郁症状，约20％的患者出现粒细胞减少，血小板减少及贫血。此外，利巴伟林还易引起患者干咳、皮肽骚痒、皮疹及视网膜疾病。
慢性丙型肝炎治疗会产生严重的不良反应，从而限制用药剂量，并造成患者的个体差异性。因而研制新型的抗HCV药物迫在眉睫。随着对丙肝病毒生物学行为基础研究的深入，如何抑制病毒感染和入侵人肝细胞成为科研工作者寻求的更普遍，更有效控制和更治丙型肝炎的方法。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA，该多肽分子量小，易于合成，应用方便、特异性高、无免疫原性、无毒副作用，该多肽能特异性与丙肝病毒E2包膜糖蛋白结合，并阻止丙肝病毒侵入靶细胞，可作为治疗丙肝病毒感染的新型药物。
本发明另一个目的是在于提供了一种抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽的制备方法，该方法简便，成本低廉，易于推广。
本发明的再一个目的是在于提供了一种多肽，即多肽ZA，在制备治疗或预防丙型肝炎的药物中的应用。
本发明还有一个目的在于提供了一种多肽，即多肽ZA在检测丙型肝炎病毒包膜抗原的试剂盒中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施：
核糖体文库筛选技术是将编码随机肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成mRNA一核糖体一蛋白质三聚体结构，此三聚体形式将蛋白和mRNA信息连接在一起，使基因型和表型得到统一。利用固相化抗原或受体的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA一核糖体一多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA，PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过几轮筛选，能找到与抗体特异性结合的多肽。近年来，应用核糖体展示技术已进行了许多研究，如筛选配体或受体，筛选抗体或确定抗原表位，开发新的蛋白酶抑制物和新的药物。
一种抑制丙肝病毒与人肝细胞结合的多肽具体制备步骤如下：
一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下：
A.挑取含有表达E2-GST融合蛋白的质粒pGEX-KG-E2(见参考文献Li，etal.，Engineering of N-glycosylation of Hepatitis C Virus Envelope ProteinE2 Enhances T cell responses for DNA immunization，Vaccine.2007.25：1544-1551.)的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)接种于3ml含有氨节青霉素(50μg/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自Amersham Biosciences公司)的大肠杆菌BL21DE3，37℃培养12～16小时。
B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37℃培养到OD600为1～2。
C.加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM，30℃诱导4～5小时。
D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4℃，7700g，5min离心，弃上清。
E.沉淀物用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4℃，7700g，5min离心，弃上清。
F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF：17.42mg PMSF溶于1ml异丙醇中，-20℃保存)的PBS中。
G.将菌液放置冰中，超声碎菌，加入20％曲通X-100(Triton X-100：1mlTritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1％，4℃，轻混30分钟。
H.每EP管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000g，10min离心，取上清。
I.4℃，12000g，离心10min，再取上清。
J.各EP管加入20μl琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B：购自AmershamBiosciences公司)，混匀，室温20～25℃孵育30min。4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清。
K.每个EP管中各加入100μl 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose4B的悬浊液收集于一管，4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清，共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的谷光苷肽洗脱缓冲液(Glutathione ElutionBuffer：0.0154g谷光苷肽溶解于0.25ml pH8.0的1M过滤除菌，分装，4℃保存)，室温20～25℃轻轻混匀10min，4℃，5000rpm，5min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为E2-GST融合蛋白。
二、制备E2-GST融合蛋白抗体的步骤如下：
A.将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1mg/ml，加入完全弗氏佐剂(CFA)，注射至新西兰家兔(购自武汉大学医学院实验动物中心)脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每点0.1～0.2ml，每只兔子抗原免疫剂量为1mg。
B.两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂(IFA)为佐剂。免疫位点及数量选择同基础免疫。
C.共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。末次免疫后第10天心脏采血，室温静置凝固后，转入4℃冰箱静置过夜，分离血清，血清即为E2-GST融合蛋白的抗体，置于-80℃冰箱保存备用。
三、制备随机DNA文库的步骤如下：
A.寡核昔酸为3’-CCT CTA TAT AGG TAC CGA TCG(NNM)12AGG CCG GTAGTA GTA GTA GTA GTA CCTAGG CCA-5’(90bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、His Tag、斜体部分为BamHI酶切位点)(N代表A，C，T或G，M代表A或C)
B.第一轮PCR的上游引物U1为5′-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACAACG GAA GGA GAT ATA TCC ATG-3′(43bp)(划线部分为5’端茎环和斜体部分为核糖体结合位点：RBS)，下游引物D1为3′-GTA GTA CCTAGG CCA TCA CCT TCA CCA TCA CCG AGT GGA AGT TCACAT ACGG-5’(52bp)(划线部分分别为BamHI酶切位点、Gly-Ser序列和3’端茎环)
C.第二轮PCR的上游引物U2为5′-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AATCAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3′(42bp)，(划线部分分别为PstI酶切位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。随机DNA文库的构建示意图见图1。
D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为：
10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg2+)               5μl
dNTP mix(10mM)                                     1μl
引物U1(20μM)                                       1μl
引物D1(20μM)                                       1μl
寡核苷酸(0.05μg/μl)                                1μl
双蒸水                                             40μl
Tag DNA聚合酶                                      1μl
总体积                                             50μl
反应程序：
a.95℃，2分钟
b.95℃，36秒；63℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。
c.72℃，5分钟
E.PCR产物经2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20ml 1×TAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。
F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为：
10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg2+)           5μl
dNTP mix(10mM)                                 1μl
引物U1(20μM)                                   1μl
引物D1(20μM)                                   1μl
第一轮PCR产物                                   4μl
双蒸水                                          37μl
Tag DNA聚合酶                                   1μl
总体积                                          50μl
反应程序：
a.95℃，2分钟
b.95℃，36秒；62℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。
c.72℃，5分钟
G.步骤F所得得PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA文库。
四、制备核糖体文库的步骤如下：
A.核糖体文库构建及筛选流程(见参考文献Wu，et al.，Peptides 26(11)：2057-2063.)如图2所示：将编码1014个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，从而形成一个稳定的mRNA-核糖体-新生多肽复合体结构。利用连接有Sepharose 4B(sigma公司)的E2-GST融合蛋白(E2-GST-Sepharose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体—多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过六轮筛选，能找到与E2蛋白特异性结合的多肽。
B.反应体系：
DNA模板(0.3mg/ml)                 10μl
S30 Premix without Amino Acids     20μl
氨基酸混合液(无甲硫氨酸)          2.5μl
氨基酸混合液(无亮氨酸)            2.5μl
E.coli S30 Extract                15μl
总体积                            50μl
轻轻混匀EP管中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。
C.30℃孵育2.5小时。
D.EP管冰上放置5分钟中止反应，EP管中物质即为核糖体展示文库。
五、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下：
A.在100μl体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10×DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6μl，37℃温育30min。然后加6μl中止缓冲液，65℃，10min灭活DNase。
B.取60μl E2-GST-Sepharose 4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清。
C.沉淀用500μl洗脱缓冲液：(washing buffer：50mM pH7.5的Tris-醋酸，150mM氯化钠NaCl，0.1％ Tween-20，50mM醋酸镁)洗涤3次。
D.将100μl体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时。
E.4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用washing buffer洗涤3次。F.沉淀中加入100μl elution buffer，4℃摇动10min使mRNA与核糖体解离，4℃，5000rpm，5min离心，取上清。
G.用RNaid Kit(购自bio101公司，美国)回收mRNA，具体方法如下：
a.上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt(RNaid Kit成份)混匀。
b.再加入10μl RNAMATRIX(RNaid Kit成份)，室温放置5min。
c.13000rpm，1min离心，弃上清。
d.用RNA wash(RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNA wash:乙醇＝1:1)。
e.加入10μl无RNase的H2O，45～55℃温育5min。
f.13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。H.RT-PCR，其反应体系为
AMV/Tfl 5×Reaction buffer       10μl
dNTP mix混合物                   1μl
引物U1(20mM)                     1μl
引物D1(20mM)                     1μl
MgSO4(25mM)                      2μl
AMV Reverse Transcription        1μl
Tfl DNA Polymerase               1μl
RNA模板                         1μl
无酶水                          29μl
总体积                          50μl
反应程序为：48℃，45分钟；94℃，2分钟；94℃，30秒；63℃，1分钟，72℃，2分钟；共31个循环；72℃，7分钟
I.2％琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。
J.回收分子量大小为155bp的RT PCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国invitrogen公司)上，具体步骤为：
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
10×Y+Buffer             2μl
BamHI                    1μl
PstI                     1μl
ddH2O                    17μl
总体积                   20μl
37℃水浴2小时
M.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。
a.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：
DNA                      4μl
pUC 19                   2μl
10×Buffer               2μl
T4连接酶                 2μl
双蒸水                   10μl
总体积                   20μl
16℃孵育20小时
b.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α。取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，冰浴30分钟，42℃ 90秒，再冰浴5分钟，加入800μl LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37℃，225rpm振摇40～50分钟。取200μl菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Ampr)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃培养过夜。
c.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基(含氨苄青霉50μg/ml)培养过夜。
d.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
e.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：
10×Taq DNA polymerase buffer        5μl
dNTP mix混合物(10mM)                1μl
引物U2(20μM)                        1μl
引物D1(20μM)                        1μl
质粒DNA                             1μl
双蒸水                              40μl
Taq DNA Polymerase                   1μl
总体积50μl
反应程序为：95℃，2分钟；95℃，30秒；62℃，1分钟，72℃，1分钟24秒；共25个循环；72℃，5分钟
f.将步骤g所得产物经BamHI和PstI鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。
根据测序结果，请西安美联公司合成的，得到了一种分离的多肽，其氨基酸
序列为：
ZA(SEQ ID NO：1)：GFGRYRRHGSPW
六、表面等离子共振技术(SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的步骤如下：
A.让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。
B.注射40μl氨基偶联试剂(含0.02M的EDC和0.05M的NHS)，活化CM5传感片上的羧基。
C.用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5mg/ml，注射该溶液40μl。
D.上机检测，流速为20μl/min。
E.将多肽ZA、ZC(对照多肽)稀释为不同浓度，以2μl/min上机与CM5传感片上的E2蛋白作用7分钟。
F.以2μl/min的流速注射10μl的HCl再生液使基线恢复，实时采集响应信号。
G.用测试仪器Biocore(美国)上的专用软件进行数据分析。分析结果见图3，显示多肽与E2蛋白的亲和力是ZA>>ZC。
七、流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下：
A.培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong，et al.，Robust hepatitis C virusinfection in vitro，2005，PNAS，102：9294-9299)和DC-SIGN+-NIH3T3(表面有DC-SIGN分子的小鼠的成纤维细胞)细胞(见参考文献Wu，et al.，Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGNinteractions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virustype I transmission.J.virol.2002，76：5905-5914)。培养条件均为10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司购买)，培养于37℃，含5％二氧化碳的培养箱中。
B.将多肽PE2A、PE2B、PE2C、PE2D分别与E2-GST蛋白混合(对照管加入GST蛋白)，总体积为50μl，其中多肽的浓度均为500μM，E2-GST蛋白和GST蛋白的浓度均为20μg/ml，37℃孵育30分钟。
C.将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN+-NIH3T3细胞混合，总体积为100μl，其中细胞个数为2×106个。37℃孵育30分钟。
D.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用80μl重悬细胞。
E.加入20μl 1：500的E2-GST抗体，37℃孵育30分钟。
F.重复D步骤一次。
G.加入1μl PE标记的羊抗兔的二抗，37℃孵育30分钟。
H.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用500μl重悬细胞。
I.上机检测，结果见图4，图5，显示多肽ZA(SEQ ID NO：1)能显著抑制E2蛋白与Huh7.5及DC-SIGN+-NIH3T3细胞结合，而多肽ZC(另一对照12肽)的抑制作用较弱。
本发明的优点
本实验首次应用核糖体文库筛选了与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽。筛选到的多肽ZA抑制与丙肝病毒E2糖蛋白蛋白具有高亲和力，且能抑制E2蛋白侵袭人体肝脏细胞Huh7.5和DC细胞。该多肽ZA作为两种特异性抗病毒多肽，可与抗丙肝病毒药物协同作用，以抑制病毒对人体细胞特异性感染，竞争性抑制病毒HCVE2与病毒的细胞受体CD81的结合。该多肽的筛选，为预防和治疗丙肝病毒感染以及阐明丙肝病毒与宿主细胞相互作用的机制奠定了基础。本发明所提供的针对丙肝病毒E2糖蛋白的小分子多肽弥补了以上提及的干扰素及其它药物治疗丙型肝炎的不足，并且显示出了明显的抑制病毒入侵作用。其最大的优点是可以高效、特异、快速的抑制丙肝病毒结合到肝细胞上，并且分子量小、安全性高、毒副作用小、和免疫原性低等。
附图说明
图1.随机DNA文库的构建流程图。
RBS表示核糖体结合位点，N代表A，C，T或G，M代表A或C
图2.核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的构建流程图。
图3.SPR检测多肽ZA、多肽ZC与E2蛋白的亲和力，它们结合的亲合力大小是：多肽ZA>>多肽ZC。
图4.流式细胞仪检测多肽ZA、多肽ZC分别抑制E2蛋白结合人肝癌细胞Huh7.5的能力；A—多肽ZA能显著抑制E2蛋白结合人肝细胞Huh7.5，而多肽C的抑制作用较弱，B—多肽ZA抑制E2蛋白与人肝细胞Huh7.5细胞的结合，且呈剂量依赖关系。
图5.流式细胞仪检测多肽ZA抑制E2蛋白结合DC-SIGN+-NIH3T3细胞的能力；A—多肽ZA显著抑制E2蛋白结合人细胞DC-SIGN+-NIH3T3，B—多肽ZA抑制E2蛋白与DC-SIGN靶细胞结合，多肽ZA抑制E2蛋白结合DC-SIGN+-NIH3T3的能力的一定剂量依赖性。
图6.流式细胞仪检测E2-GST蛋白显著大于对照GST蛋白与人靶细胞(如人肝细胞Huh7.5，或DC-SIGN+NIH3T3细胞)的结合能力。
具体实施方式
实施例1
一、制备E2-GST融合蛋白的步骤如下：
A.挑取含有pGEX-KG-E2的大肠杆菌BL21DE3(购自美国invitrogen公司)培养于3ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB培养基中，对照组别接种含有pGEX-KG(GST蛋白的原核表达载体，购自AmershamBiosciences公司)，37℃培养12～16小时。
B.将小试管中的菌液分别转移到200ml含有氨苄青霉素(50g/ml)的LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)中，37℃培养到OD600为1～2。
C.加入100mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1mM，30℃诱导4～5小时。
D.将诱导以后的菌液分装到250ml的离心管中，4℃，7700g，5min离心，弃上清。
E.沉淀用磷酸盐缓冲液PBS(140mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸二氢钾)洗涤1次，4℃，7700g，5min离心，弃上清。
F.将沉淀重悬于8ml含1mM苯甲基磺酰氟(PMSF：17.42mg PMSF溶于1ml异丙醇中，-20℃保存)的PBS中。
G.将菌液放置冰中，超声碎菌后加入20％曲通X-100(20％ Triton X-100：1ml TritonX-100溶于4ml无菌双蒸水中)，使其终浓度1％，4℃，轻混30分钟。
H.每EP管中加入1ml超声降解的菌液，4℃，12000g，10min离心，取上清。
I.上清再次离心，4℃，12000g，10min，再取上清。
J.各EP管加入20μl琼脂糖凝胶4B(Sepharose 4B：购自AmershamBiosciences公司)，室温(20-25℃，以下相同)轻混30min。4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清。
K.每个EP管各加入100μl 0.01M PBS洗涤，离心洗涤后将含有Separose 4B的悬浊液收集于一管，4℃，5000rpm，5min，离心，弃上清，共洗涤3次。
L.加入与Sepharose 4B等量的Glutathione Elution Buffer(0.0154g谷光苷肽溶解于0.25ml pH8.0的1M PBS过滤除菌，分装，4℃保存)，室温轻混10min，4℃，5000rpm，5min，取上清。
M.重复步骤L两次。收集的上清则为所需E2-GST融合蛋白。
二、制备E2重组蛋白抗体的步骤如下：
A.将表达纯化的E2-GST融合蛋白用PBS稀释至1mg/ml，加入完全弗氏佐剂(CFA)，注射至新西兰家兔脊椎两侧6点皮下及腹股沟淋巴结，每点0.1～0.2ml，每只兔子抗原免疫剂量为1mg。
B.两周后，用同样抗原量再次免疫家兔，以不完全弗氏佐剂(IFA)为佐剂。免疫位点及数量选择同基础免疫。
C.共免疫4次，间隔时间为2周，后两次免疫剂量为第一次剂量的1.5倍。末次免疫后第10天心脏采血，室温静置凝固后，转入4℃冰箱静置过夜，分离血清，血清即E2-GST融合蛋白抗体，置于-80℃冰箱保存备用。
三、制备随机DNA文库的步骤如下(见图1)：
A.寡核昔酸为3’CCT CTA TAT AGG TAC CGA TCG(NNM)12AGG CCG GTAGTA GTA GTA GTA GTA CCTAGG CCA-5’(90bp)(划线部分分别为SD序列、启始密码子、His Tag、斜体部分为BamHI酶切位点)(N代表A，C，T或G，M代表A或C)
B.第一轮PCR的上游引物U1为5′-G CTC GTA TAA TGT GTG GCC ACAACG GAA GGA GAT ATA TCC ATG-3′(43bp)(划线部分为5’端茎环和斜体部分为核糖体结合位点：RBS)，下游引物D1为3′-GTA GTA CCTAGG CCA TCA CCT TCA CCA TCA CCG AGT GGA AGT TCA CAT ACGG-5’(52bp)(划线部分分别为BamHI酶切位点、Gly-Ser序列和3’端茎环)
C.第二轮PCR的上游引物U2为5′-GCG CTG CAG TTG ACA ATT AATCAT CGG CTC GTA TAA TGT GTG-3′(42bp)，(划线部分分别为PstI酶切位点和Tac启动子)。下游引物为D1。随机DNA文库的构建示意图见图1。
D.以寡核普酸为模板，用引物U1和D1进行第一轮PCR，反应体系为：
10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg2+)                 5μl
dNTP mix(10mM)                                       1μl
引物U1(20μM)                                         1μl
引物D1(20μM)                                         1μl
寡核苷酸(0.05μg/μl)                                  1μl
双蒸水                                               40μl
Tag DNA聚合酶                                        1μl
总体积                                               50μl
反应程序：
a.95℃，2分钟
b.95℃，36秒；63℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。
c.72℃，5分钟
E.PCR产物经2％的琼脂糖凝胶(0.4g琼脂糖粉末溶解于20ml 1×TAE溶液)电泳，然后用回收试剂盒(QIAEX II gel Extraction Kit，美国promega公司)回收。
F.经步骤E回收所得的PCR产物作为模板，进行第二轮PCR扩增，反应体系为：
10×Tag DNA Polymerase buffer(含Mg2+)              5μl
dNTP mix(10mM)                                    1μl
引物U1(20μM)                                      1μl
引物D1(20μM)                                      1μl
第一轮PCR产物                                      4μl
双蒸水                                            37μl
Tag DNA聚合酶                                     1μl
总体积                                            50μl
反应程序：
a.95℃，2分钟
b.95℃，36秒；62℃，36秒；72℃，84秒；共25个循环。
c.72℃，5分钟
G.步骤F所得得PCR产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，然后用回收试剂盒回收，回收所得片段即可用于体外转录翻译DNA模板。
四、制备核糖体展示文库的步骤如下：
A.核糖体文库制备及筛选(见参考文献Wu，et al.，Peptides 26(11)：2057-2063.)，构建及筛选流程如图2所示：将编码1014个随机12肽的DNA库在体外进行偶联的转录/翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定的复合体结构。利用连接有Sepharose 4B的E2-GST蛋白(E2-GST—Sepharose 4B)亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA—核糖体—多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA.PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经连接有Sepharose 4B的GST蛋白(GST—Sepharose 4B)反筛以去除非特异性结合的多肽，E2-GST—Sepharose 4B正筛，经过六轮筛选，筛选到与E2蛋白特异性结合的多肽。
B.反应体系：
DNA模板(0.3mg/ml)                    10μl
S30 Premix without Amino Acids        20μl
氨基酸混合液(无甲硫氨酸)             2.5μl
氨基酸混合液(无亮氨酸)               2.5μl
E.coli S30 Extract                   15μl
总体积                               50μl
轻轻混匀步骤B中各混合物，5000rpm，离心30秒，让混合物沉积于EP管底部。
C.30℃孵育2.5小时。
D.EP管冰上放置5分钟中止反应。即得到核糖体展示文库。
五、核糖体展示文库筛选与丙肝病毒E2糖蛋白结合的多肽的步骤如下(见图2)：
A.在100μl体外转录翻译混合物中加入6单位的无RNA酶的DNase(Promega公司，美国)，10×DNase I缓冲液(Promega公司，美国)6μl，37℃温育30min。然后加6μl中止缓冲液，65℃，10min灭活DNase。
B.取60μl E2-GST-Sepharose 4B，4℃，5000rpm，5min离心，弃上清。
C.沉淀用500μl washing buffer(50mM pH7.5的Tris-醋酸，150mM NaCl，0.1％ Tween-20，50mM醋酸镁)洗涤3次。
D.将100μl体外转录/翻译混合物加入到洗涤过的E2-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时。
E.4℃，5000rpm，5min离心，弃上清，沉淀用洗脱缓冲液洗涤3次。
F.沉淀中加入100μl elution buffer，4℃摇动10min使mRNA与核糖体解离，4℃，5000rpm，5min离心，取上清。
G.用RNaid Kit(购自bio101公司，美国)回收mRNA，具体方法如下：g.上清中加入3倍体积的RNA Binding Salt(RNaid Kit成份)混匀。
h.再加入10μl RNA MATRIX(RNaid Kit成份)，室温放置5min。
i.13000rpm，1min离心，弃上清。
j.用RNA wash(RNaid Kit成份)洗涤2次，(RNA wash:乙醇＝1:1)。
k.加入10μl无RNase的H2O，55℃温育5min。
l.13000rpm，2min离心，取上清，上清即是RNA模板，可用于RT-PCR。
H.RT-PCR，其反应体系为
AMV/Tfl 5×Reaction buffer              10μl
dNTP mix混合物                          1μl
引物U1(20μM)                            1μl
引物D1(20μM)                            1μl
硫酸镁(25mM)                            2μl
AMV Reverse Transcription               1μl
Tfl DNA聚合酶                           1μl
RNA模板                                 1μl
无酶水                                  29μl
总体积                                  50μl
反应程序为：48℃，45分钟；94℃，2分钟；94℃，30秒；63℃，1分钟，72℃，2分钟；共31个循环；72℃，7分钟
I.2％琼脂糖琼脂糖凝胶电泳。
J.回收分子量大小为155bp的RTPCR产物。
K.以回收产物为模板，再行第二轮PCR扩增，回收分子量大小为181bp的PCR产物。
L.将回收的第二轮PCR产物连接至载体pUC19(购自美国invitrogen公司)上，具体步骤为：
a.将PCR产物及载体pUC19酶切，反应体系为
10×Y+Buffer        2μl
BamHI             1μl
PstI              1μl
ddH2O             17μl
总体积            20μl
37℃水浴2小时
b.分别回收分子量大小为128bp的DNA片段以及分子量大小为2.668kb的pUC19目的片断(回收方法同上)。
c.用DNA连接酶将步骤b所的DNA和载体pUC19连接，反应体系为：
DNA                    4μl
pUC 19                 2μl
10×Buffer             2μl
T4连接酶               2μl
双蒸水                 10μl
总体积                 20μl
16℃孵育20小时
d.将步骤c所得的连接产物分别转化至大肠杆菌DH5α。取连接产物10μl，加入100μl DH5α感受肽细胞，冰浴30分钟，42℃90秒，再冰浴5分钟，加入800μl LB液体培养基(LB液体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶解至1000ml双蒸水)，37℃，225rpm振摇40～50分钟。取200μl菌液均匀涂在有氨苄青霉素(Ampr)抗性的LB固体培养基(LB固体培养基为：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，15g琼脂粉溶解至1000ml双蒸水)上(氨苄青霉素浓度为50μg/ml)，37℃培养过夜。
e.挑取单个克隆菌落，置于3ml LB液体培养基(含氨苄青霉50μg/ml)培养过夜。
f.提取步骤e获得的菌液的质粒DNA。
g.PCR鉴定步骤f所得的DNA，反应体系为：
10×Taq DNA polymerase buffer  5μl
dNTP mix混合物(10mM)          1μl
引物U2(20mM)      1μl
引物D1(20mM)      1μl
质粒DNA           1μl
双蒸水            40μl
Taq DNA Polymerase 1μl
总体积            50μl
反应程序为：95℃，2分钟；95℃，30秒；62℃，1分钟，72℃，1分钟24秒；共25个循环；72℃，5分钟
h.将步骤g所得产物经BamHI和PstI鉴定，正确的克隆送至上海华诺公司测序。
M.根据测序结果，请西安美联公司合成12肽，见表1。
表1 筛选出的与E2蛋白结合的多肽序列
 分离的肽氨基酸序列ZAGFGRYRRHGSPWSEQ ID NO：1ZC(对照)LSVLVISMFNAV
实施例2
表面等离子共振技术(SPR)检测多肽与E2蛋白的亲和力的步骤如下：
A.让测试仪器Biocore(美国)通过一段HBS缓冲液直至基线稳定。
B.注射40μl氨基偶联试剂(含0.02M的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.05M的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))，活化CM5传感片上的羧基。
C.用pH值为5.0的醋酸缓冲液将E2蛋白稀释至5mg/ml，注射该溶液40μl。
D.上机检测，流速为20μl/min。
E.将多肽AA、ZC稀释为不同浓度，以2μl/min上机与CM5传感片上的E2蛋白作用7分钟。
F.以2μl/min的流速注射10μl的HCl再生液使基线恢复，实时采集响应信号。
G.用该仪器Biocore(美国)的专用软件进行数据分析，我们发现分析ZA与E2蛋白的亲和力最高，结果见图3，其亲和力有关参数见表2。
表2 多肽与E2蛋白相互结合作用的动力学数据
 多肽ka/M-1s-1(×104)kd/s-1(×10-3)kA/M-1(×107)ZCnononoZA3.221.392.32
实施例3
流式细胞仪检测多肽与靶分子细胞结合的步骤如下：
A.培养人肝癌细胞Huh7.5(见参考文献Zhong，et al.，Robust hepatitis C virusinfection in vitro，2005，PNAS，102：9294-9299)和DC-Sign-NIH3T3(表面有DC-Sign分子的小鼠的成纤维细胞)细胞(见参考文献Wu，et al.，Functional evaluation of DC-SIGN monoclonal antibodies reveals DC-SIGNinteractions with ICAM-3 do not promote human immunodeficiency virustype I transmission.J.virol.2002，76：5905-5914)。培养条件均为10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco公司购买)，培养于37℃，含5％二氧化碳的培养箱中。
B.将多肽ZA、ZC分别与E2-GST蛋白混合(对照管加入GST蛋白)，总体积为50μl，其中多肽的浓度均为500μM，E2-GST蛋白和GST蛋白的浓度均为20μg/ml，37℃孵育30分钟。
C.将步骤B所得的多肽与蛋白的混合物分别与收获的Huh7.5和DC-SIGN+-NIH3T3细胞混合，总体积为100μl，其中细胞个数为2×106个。37℃孵育30分钟。
D.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用80μl重悬细胞。
E.加入20μl 1：500的E2-GST抗体，37℃孵育30分钟。
F.重复D步骤一次。
G.加入1μl PE标记的羊抗兔的二抗，37℃孵育30分钟。
H.每管加入1ml PBS洗涤，1000rpm，5min，弃上清，用500μl重悬细胞。
I.经上机检测，申请人发现ZA能显著抑制E2蛋白结合到Huh7.5细胞(图4)及DC-SIGN+-NIH3T3细胞(图5)，且成剂量依赖关系，多肽剂量愈大，其与E2的亲合力愈强，抑制HCVE2侵袭靶细胞能力愈强(图4B和图5B)。而E2-GST结合人Huh7.5细胞及DC-SIGN+-NIH3T3细胞的能力显著大于对照蛋白GST与人Huh7.5细胞及DC-SIGN+-NIH3T3细胞没有结合能力(图6)。
实施例4
多肽的细胞毒性实验，即分离得到的多肽对人源性细胞系的毒性作用。
利用MTT法检测多肽对人Molt4细胞的毒性，
A.培养人Molt4细胞(见参考文献Minowada J，et al.Rosette-forming humanlymphoid cell lines，Establishment and evidence for origin of thymus-derivedlymphocytes.J.Natl.Cancer Inst.49：891-895，1972.)于96孔板，每孔5×106个细胞。
B.分别加入不同浓度的PE2A、PE2B、PE2D于Molt4细胞，每个浓度做6个复孔。
C.37℃培养细胞72小时，在培养结束前4小时加入20ml 5mg/ml的MTT。
D.2000转/分钟离心细胞10分钟，弃上清。
E.每孔加入100ml二甲亚砜(DMSO)室温(20～26℃)孵育10分钟。
F.酶标仪测量各孔细胞的OD580值。
结果显示，ZA，ZC的半数致死剂量(IC50)均大于200μM，表明它们的毒性很小，具备用于临床实验的基本要求。
SEQUENCE LISTING
<110>武汉大学
<120>抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途
<130>抑制丙型肝炎病毒感染人细胞的12肽ZA及制备方法和用途
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>12
<212>PRT
<213>人工合成
<400>1