一种槲寄生多糖及其制备方法和用途.pdf

一种槲寄生多糖，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸构成，分子量为1.1×106～3.4×106Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]Dt＝+134.6°～+167.3°，多糖的基本骨架由1→5糖苷键连接的阿拉伯糖和1→6糖苷键连接的半乳糖构成。本发明的槲寄生多糖通过水提醇沉，离子交换层析和分子筛层析进一步纯化得到。本发明的槲寄生多糖对Hela细胞和小鼠移植瘤S-180有明显的抑制作用，因此本发明的多糖可以应用于制备治疗肿瘤的药物。

权利要求书
1.  一种槲寄生多糖，其特征在于，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸构成，分子量为1.1×106～3.4×106Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]Dt＝+134.6°～+167.3°，多糖的基本骨架由1→5糖苷键连接的阿拉伯糖和1→6糖苷键连接的半乳糖构成。

2.  一种权利要求1所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是它由下列步骤组成：
步骤1.制备槲寄生水提取液；
步骤2.将步骤1所得的水提取液浓缩后，用乙醇沉淀，沉淀经洗涤后，冷冻干燥得槲寄生多糖粗品；
步骤3.将步骤2所得的槲寄生多糖粗品溶于蒸馏水，去除沉淀后用Sevag液萃取，保留水层，
步骤4.将步骤3所得的水溶液对自来水透析，透析液浓缩后，冷冻干燥得初步纯化的槲寄生多糖，
步骤5.取步骤4中得到的多糖VCP，充分溶解后，用离子交换柱和分子筛柱层析分离纯化得产品。

3、  根据权利要求2所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是，步骤1为：槲寄生粉末在60～90℃水浴中用水提取2～5h，离心去沉淀，得槲寄生水提取液。

4、  根据权利要求2所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是，步骤2为：将步骤1所得的提取液浓缩后，加入3～5倍体积乙醇，4℃放置12～24h，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得槲寄生多糖粗品。

5、  根据权利要求2所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是，步骤3为：将步骤2所得的VCP粗品充分溶于蒸馏水，离心，去除沉淀，加入1～5倍体积的Sevag液，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，反复萃取2～5次，

6、  根据权利要求2所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是，步骤4为，将步骤3所得的水溶液对自来水透析24～48h，透析液浓缩后，冷冻干燥得初步纯化的槲寄生多糖。

7、  根据权利要求2所述的槲寄生多糖的制备方法，其特征是，步骤5为：将步骤4中得到的槲寄生多糖充分溶解，上离子交换柱DEAE-52，先以蒸馏水洗涤，再以0～2mol/LNaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分；离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱层析Sephadex-G100，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得产品。

8.  权利要求1所述的槲寄生多糖在制备治疗肿瘤药物中的应用。

说明书一种槲寄生多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种多糖，具体地说是涉及一种中药槲寄生多糖Viscum coloratumpolysaccharide(简称VCP)及它的制备方法和用途。
背景技术
槲寄生(Viscum coloratum(Kom.)Nakai)为桑寄生科(Lorantheceae)半寄生常绿小灌木植物，又称冬青，北寄生、柳寄生等。槲寄生在我国为传统中药，应用历史很悠久。其干燥茎枝为中国药典收载的较常用中药“槲寄生”，《神农本草经》中列为上品，有补肝肾、强筋骨、祛风湿、养血安胎和降血压的功能。用于治疗风湿痹痛、腰膝酸软、下肢麻木、胎动不安、先兆流产和高血压等症。
其近缘植物白果槲寄生为欧洲民间药用植物，英、德、法、荷兰比利时等欧洲国家已有数万名癌症患者利用槲寄生水提物治疗乳癌、胃癌及结肠癌等各种肿瘤，且疗效显著。英国一家制药公司已率先开发出白果槲寄生植物提取物(商品名为Iscardo)，其主要成分就是白果槲寄生多糖。
有研究表明槲寄生多糖可以促进小鼠巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1。也有实验证实槲寄生多糖提取物能抑制人肝癌细胞生长[参见吴勇，何承敏等.槲寄生多糖对巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1的影响.湖北中医杂志，2003，25:1；李霞，丰平等.方剂槲芪散及君药槲寄生提取物对人肝癌细胞生长的的抑制作用.世界华人消化杂志，2006，14:20]。而对槲寄生多糖结构的研究还未有报道。
近年来我们从中药槲寄生中经提取纯化获得了一种多糖(简称VCP)并对其理化性质、化学结构、生物学活性进行了比较广泛的深入研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种槲寄生多糖，它的制备方法及在制备药物中的用途。
本发明的具体的技术方案如下：
一种槲寄生多糖，它由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸构成，分子量为1.1×106～3.4×106Da，端基碳为α-构型，旋光度[α]Dt＝+134.6°～+167.3°，多糖的基本骨架由1→5糖苷键连接的阿拉伯糖和1→6糖苷键连接的半乳糖构成。所说的槲寄生多糖的结构式见图1。本发明所说的槲寄生多糖中不含蛋白质和核酸。
一种上述槲寄生多糖的制备方法，它由下列步骤组成：
步骤1.制备槲寄生水提取液；
步骤2.将步骤1所得的水提取液浓缩后，用乙醇沉淀，沉淀经洗涤后，冷冻干燥得VCP粗品；
步骤3.将步骤2所得的VCP粗品溶于蒸馏水，去除沉淀后用Sevag液萃取，保留水层，
步骤4.将步骤3所得的水溶液对自来水透析，透析液浓缩后，冷冻干燥得初步纯化的VCP，
步骤5.取步骤4中得到的VCP，充分溶解后，用离子交换柱(DEAE-52)和分子筛柱层析分离纯化得产品。
具体的操作步骤为：
步骤1.称取中药槲寄生粉末，加水，60～90℃水浴提取2～5h，间歇搅拌，纱布滤去残渣，4000～8000rmp离心去沉淀，
步骤2.将步骤1所得的提取液浓缩，加入3～5倍体积乙醇，4℃放置12～24h，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得VCP粗品。
步骤3.将步骤2所得的VCP粗品加蒸馏水充分溶解，离心，去除沉淀，加入1～5倍体积的Sevag液(氯仿：正丁醇＝3：1～5：1)，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机溶剂层及中间层，保留水层，反复萃取2～5次，
步骤4.将步骤3所得的水溶液对自来水透析24～48h，透析液浓缩，冷冻干燥得初步纯化的VCP，
步骤5.将步骤4中得到的VCP充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-52)，先以蒸馏水洗涤，再以0～2mol/LNaCl溶液梯度洗脱，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱层析(Sephadex-G100)，分部收集，硫酸蒽酮比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的VCP。
在上述步骤1中，最好是每500克槲寄生加水2500～5000ml提取。
本发明的VCP对Hela细胞和小鼠移植瘤S180有明显的抑制作用，因此本发明的VCP可以应用于制备治疗肿瘤的药物。
附图说明
图1：VCP的重复单元；
图2：VCP的高效液相色谱纯度鉴定图谱；
图3：VCP的单糖组分的薄层层析图谱；
图4：VCP的甲基化分析步骤示意图；
图5：VCP的红外光谱分析图谱；
图6：VCP的碳核磁共振谱图；
图7：VCP对Hela的抑制作用；
具体实施方式
实施例1.VCP的提取、分离纯化、鉴定
称取中药槲寄生粉末500g，加水2500ml，60℃水浴提取2h，间歇搅拌，纱布滤去残渣，4000rpm离心去沉淀，提取液浓缩至500ml，加入3倍体积的乙醇，4℃放置12h，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得VCP粗品。
200ml蒸馏水溶解粗多糖粉末，充分溶解后离心，去除沉淀。加入等体积的Sevag液(氯仿:正丁醇＝3:1)，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机层及中间层，保留水层，反复萃取2次。将所得的水溶液对蒸馏水透析24h，浓缩，冷冻干燥得初步纯化的VCP。
取VCP 100mg，用蒸馏水充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-52)，先以100ml蒸馏水洗涤，再以0～2mol/LNaCl梯度洗脱，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同的组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱(Sephadex-G100)层析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的VCP。
HPLC纯度鉴定：采用Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mmID)高效液相色谱柱和示差折光检测器，流动相为H2O，VCP1mg/ml20μl，流速1ml/min。
结果见图2。HPLC纯度鉴定结果为一个对称峰，表明所得的多糖为单一组分。
实施例2.VCP的提取、分离纯化、鉴定
称取中药槲寄生粉末500g，加水1000ml，70℃水浴提取3h，间歇搅拌，纱布滤去残渣，4000rpm离心去沉淀，提取液浓缩至750ml，加入4倍体积的乙醇，4℃放置18h，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得VCP粗品。
500ml蒸馏水溶解粗多糖粉末，充分溶解后离心，去除沉淀。加入3倍体积的Sevag液(氯仿:正丁醇＝4:1)，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机层及中间层，保留水层，反复萃取3次。将所得的水溶液对蒸馏水透析36h，浓缩，冷冻干燥得初步纯化的VCP。
取VCP 100mg，用蒸馏水充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-52)，先以200ml蒸馏水洗涤，再以0～2mol/LNaCl梯度洗脱，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同的组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱(Sephadex-G100)层析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的VCP。纯度与实例1的相同。
实施例3.VCP的提取、分离纯化、鉴定
称取中药槲寄生粉末500g，加水5000ml，90℃水浴提取5h，间歇搅拌，纱布滤去残渣，8000rpm离心去沉淀，提取液浓缩至1000ml，加入5倍体积的乙醇，4℃放置24h，离心，沉淀依次以无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，冷冻干燥得VCP粗品。
800ml蒸馏水溶解粗多糖粉末，充分溶解后离心，去除沉淀。加入5倍体积的Sevag液(氯仿:正丁醇＝5:1)，剧烈振荡，静置分层，除去下层有机层及中间层，保留水层，反复萃取5次。将所得的水溶液对蒸馏水透析48h，浓缩，冷冻干燥得初步纯化的VCP。
取VCP 100mg，用蒸馏水充分溶解，上已平衡好的离子交换柱(DEAE-52)，先以50ml蒸馏水洗涤，再以0～2mol/LNaCl梯度洗脱，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同的组分。离子交换柱分离所得多糖组分上分子筛柱(Sephadex-G100)层析，分部收集，蒽酮-硫酸比色法跟踪检测，合并相同组分，冷冻干燥，即得本发明的VCP。纯度与实例1的相同。
实施例4.VCP重均分子量测定
采用Agilent1100高效液相色谱仪，色谱柱为测多糖的专用凝胶柱Shodex SUGARKS-805(8mmID×300mmID)，分离范围上限为500×104道尔顿，检测器为示差折光检测器。流动相为H2O：柱温30℃：流速1ml/min。取分子量不同的右旋糖酐分子量标准品适量，分别用流动相制成每mL中约含1mg的标准溶液，分别取上述标准溶液100μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。绘制标准曲线，得线性回归方程：1gMw＝8.635-0.3776tR(Mw为标样的已知重均分子量；tR为标样的保留时间)。取VCP1mg，溶于1mL水，上样100μL，记录色谱图。取3批样品分别进行测定。
测定结果见表1。VCP多糖的重均分子量为1×106Da。
表1.VCP分子量测定

单糖组分分析
实施例5.多糖VCP的薄层层析(TLC)
称取多糖样品5mg，置于干净的安瓿中，加入2mol/l三氟乙酸2ml，封管。100℃水解8h后，将三氟乙酸蒸干，用甲醇洗4～5次后，用蒸馏水溶解，备用。称取鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各20mg，分别置于1ml蒸馏水中，从中各吸取0.2ml溶液混合均匀作为混合糖。硅胶板在使用前105℃活化1h。点样。按正丁醇：乙酸：水＝4：2：1配成展开剂置于层析缸中，放入以活化好的板，饱和10min后，上行展开。展开完毕后，取出，以苯胺-邻苯二甲酸溶液为显色剂显色后，于110℃加热10min。
结果见图3。
实施例6.VCP中糖醛酸和葡萄糖含量的测定
糖醛酸含量的测定：精密量取标准糖醛酸溶液(0.1mg/mL)0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于带塞试管中，补足蒸馏水至1ml，在冰浴中预冷后逐滴加入1.5ml浓硫酸溶液。振摇混合，在85℃水浴保持20min。冷却至室温，每管加入50μL0.15％的间羟联苯-0.5％氢氧化钠溶液。摇匀后在530nm处测定光吸收，以“0”管作空白对照，绘制标准曲线。为避免样品中非己糖醛酸成分与四硼酸钠溶液反应的干扰，可作一样品对照，即以50μL0.5％氢氧化钠代替间羟联苯溶液，测得光吸收值从样品吸收值中扣除。取VCP配成1mg/ml的溶液，吸取0.5ml，补足蒸馏水至1ml，余操作同标准曲线的制备，再由回归方程算出相应浓度。
葡萄糖含量的测定：
精确配制100μg/mL的标准糖醛酸溶液，分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml标准溶液置带塞试管中，补足蒸馏水至1mL，加入2mg/mL蒽酮试剂4mL，混匀，沸水裕煮5min。冷却后测定620nm处的吸光度。以“0”管作空白对照，以吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线。
取VCP配成1mg/ml的溶液，吸取0.1ml，补足蒸馏水至1ml，余操作同标准曲线的制备。
由于糖醛酸的存在对硫酸蒽酮法测定葡萄糖的含量存在一定的干扰，为此首先采用间羟联苯法(y＝0.0053x-0.0008，r＝0.9998)测定糖醛酸的含量，再根据糖醛酸-硫酸蒽酮标准曲线(y＝0.0021x-0.0004，r＝0.9998)得到糖醛酸吸光度值的贡献，总糖的吸光度与之的差值即为葡萄糖显色所致，再根据葡萄糖-硫酸蒽酮标准曲线(y＝0.0059 x-0.0031，r＝0.9995)计算出总糖中葡萄糖的含量。由实验可得总糖含量为68.32％，糖醛酸含量为10.87％。
实施例7.VCP的糖醇乙酰化衍生物的气相分析
称取多糖10mg于安瓿中，加入2mol/l的三氟乙酸2ml，封口，于100℃水解8h，水解产物于蒸发皿中蒸干后加入甲醇5～6次反复蒸干后溶于2ml水中，加入5mg硼氢化钠和3mg内标物肌醇，充分溶解后，65℃放置30min，水解液减压蒸干。然后加少量强酸型离子交换树脂732H+搅拌数分钟后，检查溶液呈酸性时过滤，树脂用少量水反复洗3次，合并滤液在水溶液上蒸干，所得残余物加3ml甲醇溶解并蒸干，反复4次以上以除去硼化物，最后使还原产物于小安瓿管中彻底干燥。在上述还原产物中加入醋酐和无水吡啶各0.3ml，封口，于100℃水浴乙酰化20min，冷却，转移至蒸发皿中，加入0.5ml水，浓缩后反复加水2-3次直至蒸干，残渣用1ml三氯甲烷提取，提取液用1ml水洗，三氯甲烷溶液减压蒸干后，再用0.2ml三氯甲烷重溶。标准单糖(D-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)按相同方法处理。
气相条件为：Varian CP3800(Hewlett-Packard Component，USA)，VF-5ms石英毛细管柱(30cm×0.25mm×0.25μm)和FID检测器。分流-不分流进样口，进样口温度250℃。升温程序120℃至250℃。，8℃/min；250℃至280℃，20℃/min。保留2min。FID检测器，载气为He，流速1.0ml/min，检测器温度300℃。
结果见表2。
表2.VCP气相色谱分析

相邻单糖基连接方式分析
实施例8.甲基化分析
称取20mg彻底干燥糖样，溶于6ml无水二甲亚砜(DMSO)，充氮气封管，超声波振荡10min，加入200mg精细研磨的NaOH，充氮气密封，超声波振荡90min，放置90min，逐滴加入CH3I2ml，超声波振荡30min，放置30min，减压蒸馏除去剩余的CH3I。
后续步骤见图4。
重复上述甲基化步骤一次，经红外光谱分析，在3500cm-1附近无吸收峰，表明多糖上的羟基已经完全甲基化。
上述甲基化样品中加入90％(V/V)甲酸3ml，封口，水解6h，减压蒸发至干，加入2mol/l的三氟乙酸，封口，于100℃水解8h，乙酰化，进行气相-质谱联用分析。
结果见表3。
表3.VCP甲基化反应气质联用结果

实施例9过碘酸氧化与Smith降解
将NaIO4配成15mmol/l溶液，稀释250倍，再稀释成10个不同浓度，于223nm处测吸收值，作标准曲线。
精确称取VCP10mg，加10mlNaIO4置4℃暗处，间或振摇，间隔时间取样，稀释250倍，在223nm处测吸收值，直至数值不再下降为止。由标准曲线查出NaIO4消耗量。
量取0.1mol/l的NaOH储备液25ml加新煮沸过的冷蒸馏水定容至250ml。精密称取三份干燥恒重的邻苯二甲酸氢钾，每份50mg，分别加40ml新煮沸过的冷蒸馏水溶解，冷却后加酚酞指示液2滴，用NaOH标准溶液滴定至微红色为终点。
高碘酸反应终止后，以溴甲酚紫作为指示剂，用上述标定过的0.008974mol/l的NaOH溶液测定甲酸释放量。
VCP经15mM高碘酸完全氧化后，加入适量乙二醇搅拌30min以还原剩余的高碘酸。装入透析袋，对流水48h，蒸馏水透析12h，于70℃减压浓缩至最小体积，用NaBH4于室温暗处还原18h，用0.1mol/l乙酸调节至pH5.5，以分解剩余的硼氢化物，对蒸馏水透析24h后冷冻干燥。将所得的多糖醇用2mol/l的三氟乙酸于100℃水解8h，水解液减压蒸干，进行薄层层析。
VCP经高碘酸氧化，72h可反应完全，高碘酸的消耗达到稳定由NaIO4标准曲线(y＝0.0603x-0.0031，r＝0.9998)测得每mol多糖消耗为0.984mol高碘酸量并有0.256mol甲酸生成。
Smith降解产物经薄层层析主要产物为赤鲜醇和甘油。
端基碳构型分析
实施例10.VCP比旋测定
将VCP干燥失重后，精密称取25mg，定容至25ml，用0.8μm的滤膜过滤，取续滤液依法测定旋光度，由公式[α]Dt＝α/lc计算比旋[α：旋光度；L：玻璃管长度(dm)；c：溶液浓度(g/ml)]。取5批样品分别进行测定。
测定结果见表4。多糖VCP具有较高的正性比旋，表明VCP的端基碳为α-构型。
表4.VCP比旋测定

实施例11.红外光谱分析
VCP经干燥后称取1mg，用溴化钾压片法在Nicolet-170X型红外光谱仪上于4000-400cm-1区间扫描。
VCP的红外光谱图如图5所示。在3500～3200cm-1出现一种宽峰，是O-H的伸缩振动。在3000～2800cm-1的弱吸收峰是糖类C-H伸缩振动，1400～1200cm-1的一些峰是C-H的变角振动。这两组峰是糖类化合物的特征吸收。1200cm-1出现的峰则可能是多糖水化物的吸收峰。1200～1000cm-1的吸收峰是由C-O的伸缩振动所引起的。1100～1010cm-1中有三个弱的吸收峰是吡喃型糖基的特征吸收。864cm-1的吸收是α-端基差向异构C-H变角振动的特征吸收，表明VCP的端基碳为α-构型，这与比旋测定结果一致。763cm-1的吸收是由D-葡萄吡喃环的对称环伸缩振动所引起的。
实施例12.核磁共振分析
取纯化的VCP15mg，溶于氘代水(D2O)，60℃于Varian500兆核磁共振仪上进行分析。
结果见图6。多糖VCP所测得的核磁共振信号归属见表5。
表5.VCP的13C-NMR信号归属

根据以上结果推断多糖VCP的重复单元如图1。
实施例13.VCP对Hela细胞的抑制作用
将培养好的Hela细胞用小牛血清调整至一定浓度，将190ulHela细胞溶液加到96孔板中，在37℃温度，100％相对湿度，含5％CO2的培养箱中预培养24小时。将多糖配成5个稀释的浓度，终浓度分别是300μg/ml，100μg/ml，10μg/ml，1μg/ml，0.1μg/ml。将10ul稀释好的多糖溶液加入到上述96孔板中，培养48小时，加10ul5％MTT到96孔板中，继续培养4小时，吸去上清，加150ul DMSO，振荡，1小时后在570nm波长处用酶标仪测OD值。
计算抑瘤率公式＝[1-(A-空白)/(CK-空白)]×100％
结果见图7。Hela细胞的生长受到明显的抑制，多糖的5个浓度均有不同程度的抑制作用。
实施例14.VCP对小鼠移植瘤S180的抑制作用
将培养好的S180腹水瘤注射到小鼠体内，一周后随机分为5组，每组8只，空白对照组与5-Fu(20mg/kg)组分别为阴、阳性对照组，VCP组设高、中、低三个剂量组(320，160，80/kg)。从注射腹水细胞开始，每两天称一次体重，并注意观察小鼠的毛色、饮食及活动情况，做好记录。注射给药，每天一次，共给药7次。末此次给药之后24小时，小鼠眼眶静脉取血，用Hema-screen18测定样品的血常规，进行白细胞、白细胞分类计数、然后颈椎脱臼处死，分别取胸腺、肝和脾，称重，计算各项指数。胸腺(脾)指数＝胸腺(脾)重(mg)/体重(g)。
结果见表6，表7。与空白对照组相比，多糖VCP组及5-Fu组都能显著影响小鼠体重的增长，以及胸腺指数、脾指数。
表6.对小鼠体重的影响

*P<0.05，**P<0.01
表7.对小鼠胸腺指数、脾指数的影响

*P<0.05，**P<0.01